Un flux de travail robuste de traitement par cryo-microscopie électronique (cryo-EM) à particule unique avec cryoSPARC, RELION et Scipion

Résumé

Cet article explique comment utiliser efficacement trois plates-formes de traitement cryo-EM, à savoir cryoSPARC v3, RELION-3 et Scipion 3, pour créer un flux de travail unique et robuste applicable à une variété d’ensembles de données monoparticulaires pour la détermination de la structure à haute résolution.

Résumé

Les progrès récents dans les logiciels d’instrumentation et de traitement d’images ont fait de la cryo-microscopie électronique à particule unique (cryo-EM) la méthode préférée des biologistes structuraux pour déterminer les structures à haute résolution d’une grande variété de macromolécules. Plusieurs suites logicielles sont disponibles pour les utilisateurs nouveaux et experts pour le traitement d’image et le calcul de structure, qui rationalisent le même flux de travail de base: les films acquis par les détecteurs de microscope subissent une correction pour l’estimation de la fonction de transfert de mouvement et de contraste induit par faisceau (CTF). Ensuite, les images de particules sont sélectionnées et extraites des images de film moyennées pour une classification itérative 2D et 3D, suivie d’une reconstruction, d’un raffinement et d’une validation 3D. Parce que divers progiciels utilisent des algorithmes différents et nécessitent différents niveaux d’expertise pour fonctionner, les cartes 3D qu’ils génèrent diffèrent souvent en qualité et en résolution. Ainsi, les utilisateurs transfèrent régulièrement des données entre une variété de programmes pour des résultats optimaux. Cet article fournit un guide permettant aux utilisateurs de naviguer dans un flux de travail à travers les progiciels populaires : cryoSPARC v3, RELION-3 et Scipion 3 afin d’obtenir une structure de résolution quasi atomique du virus adéno-associé (AAV). Nous détaillons d’abord un pipeline de traitement d’image avec cryoSPARC v3, car ses algorithmes efficaces et son interface graphique facile à utiliser permettent aux utilisateurs d’arriver rapidement à une carte 3D. Dans l’étape suivante, nous utilisons PyEM et des scripts internes pour convertir et transférer les coordonnées des particules de la meilleure reconstruction 3D obtenue dans cryoSPARC v3 vers RELION-3 et Scipion 3 et recalculer les cartes 3D. Enfin, nous décrivons les étapes à suivre pour affiner et valider davantage les structures résultantes en intégrant les algorithmes de RELION-3 et Scipion 3. Dans cet article, nous décrivons comment utiliser efficacement trois plates-formes de traitement pour créer un flux de travail unique et robuste applicable à une variété d’ensembles de données pour la détermination de la structure haute résolution.

Introduction

La cryo-microscopie électronique (cryo-EM) et l’analyse monoparticulaire (SPA) permettent de déterminer la structure d’une grande variété d’assemblages biomoléculaires à l’état hydraté, contribuant ainsi à éclairer les rôles de ces macromolécules dans les détails atomiques. Les améliorations apportées à l’optique du microscope, au matériel informatique et aux logiciels de traitement d’images ont permis de déterminer les structures des biomolécules à une résolution supérieure à 2 ^Å1,2,3. Plus de 2 300 structures cryo-EM ont été déposées dans la banque de données sur les protéines (PDB) en 2020, contre 192 structures en 20144, ce qui indique que la cryo-EM est devenue la méthode de choix pour de nombreux biologistes structuraux. Nous décrivons ici un flux de travail combinant trois programmes SPA différents pour la détermination de la structure à haute résolution (Figure 1).

L’objectif de SPA est de reconstruire les volumes 3D d’un spécimen cible à partir d’images 2D bruyantes enregistrées par un détecteur de microscope. Les détecteurs collectent des images sous forme de films avec des images individuelles du même champ de vision. Afin de préserver l’échantillon, les trames sont collectées avec une faible dose d’électrons et ont donc un faible rapport signal/bruit (SNR). De plus, l’exposition aux électrons peut induire un mouvement dans les grilles cryo-EM vitrifiées, ce qui entraîne un flou de l’image. Pour surmonter ces problèmes, les cadres sont alignés pour corriger le mouvement induit par le faisceau et moyennés pour produire une micrographie avec un SNR accru. Ces micrographies subissent ensuite une estimation de la fonction de transfert de contraste (CTF) pour tenir compte des effets de la mise au point et des aberrations imposées par le microscope. À partir des micrographies corrigées par le CTF, les particules individuelles sont sélectionnées, extraites et triées en moyennes de classe 2D représentant différentes orientations adoptées par l’échantillon dans la glace vitrée. L’ensemble homogène de particules résultant est utilisé comme entrée pour la reconstruction 3D ab initio afin de générer un ou plusieurs modèles grossiers, qui sont ensuite affinés de manière itérative pour produire une ou plusieurs structures à haute résolution. Après la reconstruction, des améliorations structurelles sont effectuées pour améliorer encore la qualité et la résolution de la carte cryo-EM. Enfin, soit un modèle atomique est directement dérivé de la carte, soit la carte est équipée de coordonnées atomiques obtenues ailleurs.

Différents progiciels sont disponibles pour accomplir les tâches décrites ci-dessus, notamment ^Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, ^EMAN8, IMAGIC9, ^RELION10, Scipion11, ^SPIDER12, Xmipp13 et autres. Bien que ces programmes suivent des étapes de traitement similaires, ils utilisent différents algorithmes, par exemple, pour sélectionner des particules, générer des modèles initiaux et affiner les reconstructions. De plus, ces programmes nécessitent un niveau variable de connaissances et d’intervention de l’utilisateur pour fonctionner, car certains dépendent du réglage fin des paramètres qui peuvent constituer un obstacle pour les nouveaux utilisateurs. Ces écarts se traduisent souvent par des cartes de qualité et de résolution incohérentes sur toutes les plates-formes14, ce qui incite de nombreux chercheurs à utiliser plusieurs progiciels pour affiner et valider les résultats. Dans cet article, nous soulignons l’utilisation de cryoSPARC v3, RELION-3 et Scipion 3 pour obtenir une reconstruction 3D haute résolution de l’AAV, un vecteur largement utilisé pour la thérapie ^génique15. Les progiciels susmentionnés sont gratuits pour les utilisateurs académiques; cryoSPARC v3 et Scipion 3 nécessitent des licences.

Protocole

1. Création d’un nouveau projet cryoSPARC v3 et importation de données

REMARQUE: Les données ont été acquises à l’Oregon Health and Science University (OHSU) à Portland à l’aide d’un microscope électronique Titan Krios de 300 kV équipé d’un détecteur d’électrons directs Falcon 3. Les images ont été collectées en mode comptage avec une dose totale de 28,38 e⁻/^Å2 fractionnée sur 129 images, et une plage de mise au point de -0,5 μm à -2,5 μm, à une taille de pixel de 1,045 Å en utilisant l’EPU. L’échantillon d’AAV-DJ a été fourni par le personnel de l’OHSU.

1. Ouvrez cryoSPARC v3 dans un navigateur Web et cliquez sur l’en-tête Projets . Sélectionnez + Ajouter pour créer un nouveau projet. Intitulez le projet en conséquence et fournissez un chemin d’accès à un répertoire existant où les tâches et les données seront enregistrées.
2. Créez un espace de travail pour le projet en ouvrant le projet, en cliquant sur + Ajouter, puis en sélectionnant Nouvel espace de travail. Intitulez l’espace de travail et cliquez sur Créer.
3. Accédez au nouvel espace de travail et ouvrez job builder dans le panneau de droite. Cet onglet affiche toutes les fonctions disponibles dans cryoSPARC v3. Cliquez sur Importer des films et indiquez le chemin des films, obtenez le chemin du fichier de référence et définissez les paramètres d’acquisition comme suit: Taille de pixel brute 1.045 Å, Tension d’accélération 300 kV, Aberration sphérique 2,7 mm, Dose totale d’exposition 28.38 e^-/Å^2.
4. Cliquez sur File d’attente, sélectionnez une voie pour exécuter le travail et un espace de travail, puis cliquez sur Créer.
   REMARQUE: Les paramètres d’acquisition dépendent de l’échantillon et du microscope.

2. CryoSPARC v3 - alignement du film et estimation CTF

1. Ouvrez Patch Motion Correction (Multi). Cette tâche nécessite l’importation des films à l’étape 1.3 en entrée. Ouvrez la fiche de travail d’importation de films dans l’espace de travail et faites glisser la sortie Imported_movies vers l’espace réservé des films sur la nouvelle tâche. Mettre le travail en file d’attente .
   REMARQUE : Pour plus d’informations sur les méthodes cryoSPARC décrites dans cet article, consultez le didacticiel ^cryoSPARC16.
2. Pour effectuer une estimation CTF, ouvrez Patch CTF Estimation (Multi). Entrez les micrographies générées à l’étape 2.1 et Mettez la tâche en file d’attente .
3. Pour inspecter les micrographies moyennées et corrigées par le CTF et sélectionner un sous-ensemble pour un traitement ultérieur, ouvrez Curate Exposures et entrez les expositions obtenues à l’étape 2.2. Mettre le travail en file d’attente .
4. Une fois que la tâche est entrée en mode Attente , cliquez sur l’onglet Interaction de la fiche de tâche, ajustez les seuils de paramètres et acceptez ou rejetez des micrographies individuelles pour un traitement ultérieur. Acceptez les micrographies avec des CTF estimés et expérimentaux bien appariés (Figure 2) et jetez celles qui ont un astigmatisme élevé, un mauvais ajustement CTF et une glace épaisse.
5. Lors du traitement des données actuelles, définissez le seuil supérieur d’astigmatisme à 400 Å, la résolution d’ajustement CTF à 5 Å et l’épaisseur relative de la glace à 2. Cliquez sur Terminé pour sélectionner les micrographies à traiter en aval.

3. CryoSPARC v3 - prélèvement manuel et basé sur un modèle de prélèvement de particules

1. Ouvrez le sélecteur manuel, entrez les expositions acceptées des étapes 2.4 à 2.5 et mettez le travail en file d’attente . Cliquez sur l’onglet Interactif , définissez la taille de la boîte (px) sur 300, cliquez sur quelques centaines de particules sur plusieurs micrographies et évitez de sélectionner des particules qui se chevauchent. Ici, 340 particules réparties sur 29 micrographies ont été sélectionnées. Lorsque vous avez terminé, cliquez sur Terminé le prélèvement! Extraire des particules.
   REMARQUE: Ce protocole utilise la sélection manuelle des particules pour générer des modèles de sélection automatique. Cependant, d’autres méthodes sont également ^{disponibles17}.
2. Pour générer des modèles pour la sélection automatisée de particules, cliquez sur Classification 2D et entrez les sélections de particules générées à l’étape 3.1. Modifiez le nombre de classes 2D sur 10 et mettez le travail en file d’attente .
3. Ouvrez Sélectionner des classes 2D. Entrez les particules et les moyennes de classe obtenues à l’étape 3.2 et cliquez sur l’onglet Interactif . Sélectionnez des classes 2D représentatives avec un bon SNR et cliquez sur Terminé.
   REMARQUE : Les moyennes de classe reflètent différentes vues de particules. Sélectionnez des moyennes de classe qui reflètent chaque vue. L’objectif est de produire des modèles bien définis représentant différentes vues de l’échantillon pour le prélèvement automatisé.
4. Ouvrez le sélecteur de modèles et entrez les classes 2D sélectionnées à l’étape 3.3 et les micrographies des étapes 2.4 à 2.5. Définissez le diamètre des particules (Å) sur 220 Å et mettez la tâche en file d’attente .
5. Pour inspecter les prélèvements automatisés, ouvrez Sélectionner les prélèvements de particules, entrez les particules et les micrographies générées à l’étape 3.4 et mettez la tâche en file d’attente .
6. Sur la fiche de travail Sélectionner les choix de particules, cliquez sur l’onglet Interactif et définissez la taille de la boîte (px) sur 300. Cliquez sur une micrographie individuelle, ajustez le filtre passe-bas jusqu’à ce que les particules soient clairement visibles et définissez le seuil de corrélation croisée normalisée (NCC) à 0,41 et le seuil de puissance entre 54000 et 227300 .
7. Inspectez plusieurs micrographies et, si nécessaire, ajustez les seuils de manière à ce que la plupart des particules soient sélectionnées sans inclure de faux positifs. Lorsque vous avez terminé, cliquez sur Terminé la cueillette! Extraire des particules.
   REMARQUE: Les vraies particules ont généralement un NCC et un score de puissance élevés, ce qui indique qu’elles sont similaires au modèle et ont un SNR élevé, respectivement.
8. Ouvrez Extraire des micrographies et saisir les micrographies et les particules de l’étape 3.7. Définissez la taille de la boîte extraite (px) sur 300 et mettez le travail en file d’attente .

4. CryoSPARC v3 - Classification 2D

1. Cliquez sur Classification 2D et entrez les particules extraites de l’étape 3.8. Définissez le nombre de classes 2D sur 50 et mettez le travail en file d’attente .
2. Pour sélectionner les meilleures classes 2D pour un traitement ultérieur, ouvrez Sélectionner des classes 2D. Entrez les particules et les moyennes de classe obtenues à l’étape 4.1. Cliquez sur l’onglet Interactif et choisissez des classes 2D en fonction de la résolution et du nombre de particules dans la classe (Figure 3). Ne sélectionnez pas de classes contenant des artefacts. Après avoir sélectionné, cliquez sur Terminé.
   REMARQUE: Habituellement, plusieurs tours de classification 2D sont nécessaires pour éliminer les particules, qui ne convergent pas en classes distinctes et bien définies. Exécutez autant de tours de classification 2D que nécessaire pour supprimer ces particules de l’ensemble de données (Figure 3).

5. CryoSPARC v3 - reconstruction ab-initio et raffinement homogène

1. Pour générer un volume 3D initial, ouvrez Ab-initio Reconstruction et entrez les particules obtenues à l’étape 4.2 ou à partir de la classification 2D finale. Ajuster la symétrie à l’icosaédrique. Mettre le travail en file d’attente .
   REMARQUE : La symétrie dépend de l’échantillon et doit être modifiée en conséquence. Si elle est inconnue, utilisez la symétrie C1.
2. Ouvrir le raffinement homogène. Entrez le volume de l’étape 5.1 et les particules de la 4.2 ou la classification 2D finale. Modifiez la symétrie et mettez le travail en file d’attente . Lorsque la tâche est terminée, inspectez la courbe FSC (Fourier Shell Correlation) et téléchargez le volume à examiner dans UCSF ^Chimera18.

6. Exportation des coordonnées des particules de cryoSPARC v3 et importation dans RELION-3 à l’aide de PyEM

REMARQUE: Les coordonnées des particules transportent des informations sur l’emplacement des particules individuelles dans chaque micrographie. Le transfert de coordonnées au lieu de piles de particules vers RELION-3 permet d’exécuter des étapes de raffinement qui, autrement, ne seraient pas disponibles. Par exemple, le polissage des particules nécessite l’accès aux images de film initiales. Par conséquent, avant d’exporter les coordonnées des particules de cryoSPARC v3 vers RELION-3, importez des films et effectuez une correction de mouvement et une estimation CTF dans RELION-3. Voir le tutoriel ^RELION-319 pour plus de détails.

1. Accédez au répertoire du projet RELION-3 et lancez RELION-3.
2. Ouvrez Importer à partir du navigateur de type de tâche et spécifiez le chemin d’accès aux films et aux paramètres d’acquisition comme à l’étape 1.3.
3. Pour effectuer une correction de mouvement, utilisez UCSF ^MotionCor220 via l’interface graphique RELION-3, ouvrez Correction de mouvement et définissez les paramètres par défaut comme dans le manuel UCSF MotionCor2221. Entrez le chemin d’accès aux films importés à l’étape 6.2. Sous l’onglet Mouvement, spécifiez le chemin d’accès à l’exécutable motioncor2.
   REMARQUE: MotionCor2 peut être exécuté en parallèle à l’aide de plusieurs GPU.
4. Effectuez une estimation CTF à l’aide de CTFFIND-4.122 via l’interface graphique RELION-3. Ouvrez CTF Estimation et entrez le fichier micrographs.star généré à l’étape 6.3. Sous l’onglet CTFFIND-4.1, spécifiez le chemin d’accès à l’exécutable CTFFIND-4.1 et définissez les paramètres comme dans le didacticiel RELION-3.119.
5. Pour importer des piles de particules de cryoSPARC v3 vers RELION-3, elles doivent d’abord être exportées de cryoSPARC v3. Dans cryoSPARC v3, ouvrez la fiche de travail de la tâche de classe Select 2D à partir de l’étape 4.2 ou de la classification 2D finale. Dans l’onglet Détails , cliquez sur Exporter le travail. Exporter la tâche génère le fichier particles_exported.cs.
6. Avant d’importer les coordonnées des particules de cryoSPARC v3 vers RELION-3, le fichier particles_exported.cs de l’étape 6.5 doit être converti au format .star. À l’aide de ^PyEM23, convertissez le fichier particles_exported.cs au format .star en exécutant la commande suivante : csparc2star.py particles_exported.cs particles_exported.star
7. Dans RELION-3, cliquez sur l’onglet Prélèvement manuel et sur l’onglet E/ S, entrez les micrographies de l’affinement CTF décrit à l’étape 6.4. Sous l’onglet Affichage , entrez les paramètres suivants : Diamètre des particules (A) : 220, Filtre passe-bas (A) : -1 , Échelle de l’image CTF : 0,5. Exécutez le travail. Un répertoire appelé ManualPick est généré dans le dossier de base DE RELION-3.
   REMARQUE : Cette étape est effectuée pour créer une structure de dossiers de prélèvement manuel dans RELION-3. Lors de l’exécution de la sélection manuelle, un seul fichier .star contenant les coordonnées des particules sélectionnées est créé pour chaque micrographie moyenne utilisée pour la sélection dans l’interface graphique RELION-3.
8. Accédez au dossier contenant le fichier particles_exported.star de l’étape 6.6 et exécutez un script écrit à la maison produisant un seul fichier manualpick.star pour chaque micrographie moyenne utilisée pour la sélection des particules cryo-SPARC v3, ce qui a contribué à la classification 2D finale exportée à l’étape 6.5. Les fichiers de coordonnées résultants sont enregistrés dans le dossier ManualPick/Movies.
9. Revenez à RELION-3 et rouvrez la tâche prélèvement manuel . Cliquez sur Continuer. Cela affichera les particules précédemment sélectionnées dans cryoSPARC v3 dans l’interface graphique de RELION-3. Inspectez quelques micrographies pour vérifier si le transfert des coordonnées des particules a été effectué et si les particules sont correctement sélectionnées.

7. RELION-3 - Extraction de particules et classification 2D

1. Cliquez sur Extraction de particules. Sous l’onglet E/ S, entrez les micrographies corrigées CTF de l’étape 6.4 et les coordonnées de l’étape 6.9. Cliquez sur l’onglet Extraire et modifiez la taille de la boîte à particules (pix) à 300. Exécutez le travail.
2. Effectuez une classification 2D pour nettoyer davantage l’ensemble de particules générées dans cryoSPARC v3 afin d’obtenir une reconstruction à plus haute résolution. Cliquez sur Classification 2D et sur l’onglet E/S , entrez le fichier particles.star généré à l’étape 7.1. Sous l’onglet Optimisation , définissez le nombre de classes sur 50 et le diamètre du masque (A) sur 280. Exécutez le travail.
   REMARQUE: Le masque doit englober la particule entière.
3. Pour choisir les meilleures classes 2D, cliquez sur la méthode Sélection de sous-ensembles , entrez le fichier _model.star de l’étape 7.2 et exécutez le travail. Sélectionnez les classes comme décrit à l’étape 4.2.
4. Répétez les étapes 7.2 et 7.3 pour éliminer les particules non convergentes.

8. RELION-3 - Raffinement 3D, création de masques et post-traitement

1. Utilisez la carte générée dans cryoSPARC v3 (étape 5.2) comme modèle initial pour le raffinement 3D dans RELION-3. Sélectionnez la méthode Import et définissez les paramètres suivants sous l’onglet E/S : Importer des films/micrographies bruts : Non, Fichiers d’entrée bruts : Films/*.mrc.
2. Fournissez le fichier MTF et entrez les paramètres d’acquisition de film comme décrit à l’étape 1.3. Sous l’onglet Autres , sélectionnez la carte cryoSPARC v3 comme fichier d’entrée, remplacez Type de nœud par Référence 3D (.mrc) et Exécutez la tâche.
3. Sélectionnez 3D Auto-Refine et, sous l’onglet E/S , définissez Input Images comme fichier particles.star à partir de l’étape 7.3 ou de la dernière tâche de sélection. Donnez la reconstruction cryoSPARC v3 comme carte de référence. Cliquez sur l’onglet Référence et remplacez le filtre passe-bas initial (Å) par 50 et la symétrie par icosaédrique. Sous l’onglet Optimisation , modifiez le diamètre du masque (Å) sur 280 et exécutez la tâche.
4. Une fois l’exécution terminée, ouvrez run_class001.mrc dans UCSF Chimera.
5. Dans UCSF Chimera, cliquez sur Outils et sous Volume Data, sélectionnez Volume Viewer. Cela ouvrira une nouvelle fenêtre pour régler les paramètres de volume. Changez l’étape sur 1 et ajustez le curseur jusqu’à ce qu’il atteigne la valeur de niveau où la carte n’a pas de bruit. Enregistrez cette valeur, car elle sera utilisée pour la création de masques à l’étape suivante.
6. La carte produite à partir de l’auto-raffinement ne reflète pas le véritable FSC, car le bruit du solvant environnant réduit la résolution. Avant le post-traitement, créez un masque pour distinguer l’échantillon de la région du solvant.
   1. Cliquez sur Création de masque et saisissez run_class001.mrc à partir de l’étape 8.3.
   2. Cliquez sur l’onglet Masque et ajustez les paramètres comme suit: Carte de filtre passe-bas (Å): 10, Taille de pixel (Å): 1.045, Seuil de binarisation initial: la valeur de niveau obtenue à l’étape 8.5, Étendre la carte binaire autant de pixels: 3 et Ajouter un bord souple de ce nombre de pixels: 3. Exécutez le travail.
7. Examinez le masque dans UCSF Chimera. Si le masque est trop serré, augmentez Étendre la carte binaire de autant de pixels et/ou Ajoutez un bord souple de ce nombre de pixels. Il est important de créer un masque avec des bords doux, car un masque tranchant peut entraîner un surajustement.
8. Cliquez sur Post-traitement et sur l’onglet E/S , entrez les demi-cartes créées à l’étape 8.3 et masquez à partir de 8.6. Définissez la taille de pixel calibrée sur 1,045 Å. Sous l’onglet Netteté , entrez ce qui suit : Estimer le facteur B automatiquement ?: Oui, Résolution la plus basse pour l’ajustement auto-B (A) : 10, Utilisez votre propre facteur B ?: Non. Sous l’onglet Filtre , définissez Ignorer la pondération Fsc ? sur Non. Exécuter la tâche.

9. RELION-3 - Formation au polissage et au polissage des particules

1. Avant de corriger le mouvement induit par faisceau par particule, utilisez d’abord le mode d’entraînement pour identifier les pistes de mouvement optimales pour l’ensemble de données. Ouvrez Bayesian Polishing et sous l’onglet E/S , entrez les micrographies corrigées du mouvement de l’étape 6.3, les particules de l’étape 8.3 et le fichier .star post-traitement de l’étape 8.8. Cliquez sur l’onglet Entraînement et définissez les paramètres suivants : Paramètres optimaux de l’entraînement : Oui, Fraction de pixels de Fourier pour les tests : 0,5, Utiliser autant de particules : 5000. Exécutez le travail.
   REMARQUE : Ce script produira opt_params_all_groups.txt fichier dans le dossier polonais RELION-3 contenant les paramètres de polissage optimisés requis pour l’exécution de l’étape suivante.
2. Une fois le travail de formation terminé, cliquez sur Polissage bayésien. Cliquez sur l’onglet Formation et définissez Paramètres optimaux du train? sur Non. Sélectionnez l’onglet Polonais et, dans Fichier de paramètres optimisé, spécifiez le chemin d’accès au fichier opt_params_all_groups.txt à partir de l’étape 9.1. Cliquez sur Exécuter.
3. Répétez le raffinement 3D (étape 8.3) et le post-traitement (étape 8.8) avec un ensemble de particules polies.

10. RELION-3 - CTF et raffinements par particule

1. Pour estimer les aberrations d’ordre supérieur, ouvrez CTF Refinement et, sous l’onglet E/S sous Particules, sélectionnez le chemin d’accès au fichier .star contenant des particules polies de la tâche Refine 3D récente (run_data.star).
   1. Sous Postprocess Star File, définissez le chemin d’accès à la sortie de la dernière tâche de post-traitement (étape 9.3).
   2. Sélectionnez l’onglet Ajuster et définissez les paramètres suivants : Estimation (grossissement anisotrope) : Non, Effectuer un ajustement des paramètres CTF ? Non, Estimation Beamtilt: Oui, Estimer aussi Trefoil? Oui, Estimer les aérations ^{de 4ème} ordre? Oui. Exécutez le travail.
2. Répétez l’étape 10.1 en utilisant comme entrée les particules (de Refine3D) générées dans la tâche précédente (particles_ctf_refine.star). Sous l’onglet Ajustement , remplacez Estimation (grossissement anisotrope) par Oui et Exécutez la tâche.
3. Répétez l’étape 10.2 en utilisant comme entrée les particules (de Refine3D) produites dans la tâche précédente (particles_ctf_refine.star). Sous l’onglet Ajustement , définissez les paramètres suivants : Estimation (grossissement anisotrope) : Non, Effectuer un ajustement des paramètres CTF ?: Oui, Ajuster la mise au point ?: Par particule, Ajuster l’astigmatisme ? Per-micrograph, Fit B-factor?: Non, Fit Phase-Shift: No, Estimate Beamtilt?: Non, Estimate ^4th Order Aberrations?: No. Exécutez-le .
   REMARQUE: Étant donné que la particule a un contraste suffisant, l’onglet Ajuster l’astigmatisme? peut être réglé sur Par particule. Pour cet ensemble de données, le raffinement de l’astigmatisme par particule n’a pas amélioré la qualité et la résolution de la carte.
4. Répétez le raffinement 3D avec les particules de l’étape 10.3 et sur l’onglet E/S, réglez Utiliser des FSC aplatis au solvant ? sur oui. Une fois l’exécution terminée, exécutez une tâche de post-traitement (étape 8.8) et examinez la carte dans UCSF Chimera (étape 5.2).

11. Transfert des coordonnées des particules RELION-3 et de la carte 3D vers Scipion 3

1. Pour affiner et valider davantage la carte RELION-3, importez d’abord le volume et les particules de la dernière tâche de post-traitement (étape 10.4) vers Scipion 3. Lancez Scipion 3 et créez un nouveau projet.
2. Dans le panneau Protocoles de gauche, sélectionnez la liste déroulante Importations et cliquez sur Importer des particules. Modifiez les paramètres suivants : Importer à partir de : RELION-3, Fichier étoile : postprocess.star et spécifiez les paramètres d’acquisition comme à l’étape 1.3. Cliquez sur Exécuter.
3. Cliquez sur le menu déroulant Importations et sélectionnez Importer des volumes. Sous Importer de , indiquez le chemin d’accès à la carte RELION-3. Modifiez la taille des pixels (taux d’échantillonnage) Å/px en 1,045 et exécutez.

12. Scipion 3 - Raffinement haute résolution

1. Tout d’abord, effectuez un alignement global. Sélectionnez la liste déroulante Affiner dans le panneau Protocoles et cliquez sur Xmipp3 - highres24. Entrez les particules et les volumes importés des étapes 11.2 et 11.3 en tant qu’images en taille réelle et volumes initiaux, respectivement, et définissez le groupe de symétrie sur icosaédrique. Sous l’onglet Alignement de l’image sous Affectation angulaire, choisissez Global et définissez la résolution cible maximale sur 3 Å, puis Exécutez la tâche.
2. Lorsque le travail est terminé, cliquez sur Analyser les résultats. Dans la nouvelle fenêtre, cliquez sur l’icône UCSF Chimera pour examiner le volume raffiné. De plus, cliquez sur Graphiques de résolution d’affichage (FSC) pour voir comment le FSC a changé après le raffinement, ainsi que sur Histogramme de tracé avec modifications angulaires pour voir si les affectations d’angle d’Euler ont changé.
   REMARQUE: Selon la résolution de la structure RELION-3 d’entrée, cette étape peut être répétée plusieurs fois avec des valeurs différentes définies pour la résolution cible maximale sous l’onglet Affectation angulaire. Pour plus d’informations, consultez le didacticiel ^Scipion25.
3. Répétez l’étape 12.1 avec un alignement local. Copiez la tâche précédente et remplacez Select Previous Run par Xmipp3 - highres Global. Sous l’onglet Affectation angulaire , remplacez Alignement de l’image par Local. Définissez la résolution cible maximale sur 2,1 Å.
4. Examinez la carte affinée dans UCSF Chimera et analysez le changement dans FSC et les affectations angulaires (étape 12.2). Répétez l’affinement local jusqu’à ce que la résolution ne s’améliore pas et que les affectations angulaires aient convergé, en ajustant la résolution cible maximale si nécessaire.
5. La carte de sortie de Scipion 3 peut également être modifiée en termes de densité et affinée dans ^Phenix26.

13. Scipion 3 - Validation de la carte

1. Examinez la résolution locale de la carte finale générée dans Xmipp3 - highres. Ouvrez Xmipp - MonoRes27 local et entrez le volume final de la tâche précédente et le masque généré à l’étape 8.6. Définissez la plage de résolution de 1 à 6 Å avec un intervalle de 0,1 Å et exécutez la tâche.
2. Lorsque vous avez terminé l’exécution, cliquez sur Analyser les résultats et examinez l’histogramme de résolution et les tranches de volume colorées par résolution.
3. Pour voir si les particules sont bien alignées, ouvrez Multireference ^{Alignability28} et entrez les particules et le volume à partir de l’étape 12.3. Cliquez sur Analyser les résultats pour afficher le graphique de validation. Idéalement, tous les points devraient être regroupés (1,0,1,0).
4. Ouvrez Xmipp3 - Validez le surajustement. Entrez les particules et les volumes de l’étape 12.3. Lorsque l’exécution est terminée, analysez les résultats et inspectez le tracé de surajustement. Le croisement des courbes de bruit gaussien aligné et des particules alignées indique un surajustement.

Résultats

Nous avons présenté un pipeline SPA complet pour obtenir une structure haute résolution en utilisant trois plates-formes de traitement différentes : cryoSPARC v3, RELION-3 et Scipion 3. Les figures 1 et 4 résument le flux de travail de traitement général et le tableau 1 détaille les protocoles d’affinement. Ces protocoles ont été utilisés lors des raffinements d’une structure de 2,3 Å de l’AAV, atteignant une résolution proche...

Discussion

Dans cet article, nous présentons un flux de travail SPA robuste pour le traitement des données cryo-EM sur diverses plates-formes logicielles afin de réaliser des reconstructions 3D haute résolution (Figure 1). Ce flux de travail est applicable à une grande variété de macromolécules biologiques. Les étapes suivantes du protocole sont décrites à la figure 4, y compris le prétraitement du film, la sélection et la classification des particules, ainsi ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
CryoSPARC	Structura Biotechnology Inc.	https://cryosparc.com/
CTFFIND 4	Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School	https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4
MotionCorr2	UCSF Macromolecular Structure Group	https://msg.ucsf.edu/software
Phenix	Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC)	http://www.phenix-online.org/
PyEM	Univerisity of California, San Francisco	https://github.com/asarnow/pyem
RELION	MRC Laboratory of Structural Biology	https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page
Scipion	Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab	http://scipion.i2pc.es/
UCSF Chimera	UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/