Un robusto flusso di lavoro di elaborazione crioelettronica a particella singola (cryo-EM) con crioSPARC, RELION e Scipion

Riepilogo

Questo articolo descrive come utilizzare efficacemente tre piattaforme di elaborazione crio-EM, ovvero cryoSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3, per creare un flusso di lavoro unico e robusto applicabile a una varietà di set di dati a particella singola per la determinazione della struttura ad alta risoluzione.

Abstract

I recenti progressi sia nella strumentazione che nel software di elaborazione delle immagini hanno reso la microscopia crioelettronica a singola particella (cryo-EM) il metodo preferito dai biologi strutturali per determinare strutture ad alta risoluzione di un'ampia varietà di macromolecole. Diverse suite software sono disponibili per utenti nuovi ed esperti per l'elaborazione delle immagini e il calcolo della struttura, che semplificano lo stesso flusso di lavoro di base: i filmati acquisiti dai rilevatori al microscopio vengono sottoposti a correzione per la stima del movimento indotto dal fascio e della funzione di trasferimento del contrasto (CTF). Successivamente, le immagini delle particelle vengono selezionate ed estratte dai fotogrammi di filmato medi per la classificazione iterativa 2D e 3D, seguita da ricostruzione, perfezionamento e convalida 3D. Poiché vari pacchetti software impiegano algoritmi diversi e richiedono diversi livelli di esperienza per funzionare, le mappe 3D che generano spesso differiscono per qualità e risoluzione. Pertanto, gli utenti trasferiscono regolarmente i dati tra una varietà di programmi per risultati ottimali. Questo documento fornisce una guida per gli utenti per navigare in un flusso di lavoro attraverso i pacchetti software più diffusi: cryoSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3 per ottenere una struttura di risoluzione quasi atomica del virus adeno-associato (AAV). Per prima cosa dettagliamo una pipeline di elaborazione delle immagini con cryoSPARC v3, poiché i suoi algoritmi efficienti e la GUI facile da usare consentono agli utenti di arrivare rapidamente a una mappa 3D. Nella fase successiva, utilizziamo PyEM e script interni per convertire e trasferire le coordinate delle particelle dalla migliore qualità di ricostruzione 3D ottenuta in cryoSPARC v3 a RELION-3 e Scipion 3 e ricalcolare le mappe 3D. Infine, delineiamo i passaggi per un ulteriore perfezionamento e convalida delle strutture risultanti integrando algoritmi di RELION-3 e Scipion 3. In questo articolo, descriviamo come utilizzare efficacemente tre piattaforme di elaborazione per creare un flusso di lavoro unico e robusto applicabile a una varietà di set di dati per la determinazione della struttura ad alta risoluzione.

Introduzione

La microscopia crioelettronica (cryo-EM) e l'analisi a singola particella (SPA) consentono la determinazione della struttura di un'ampia varietà di assemblaggi biomolecolari nel loro stato idratato, contribuendo a illuminare i ruoli di queste macromolecole nei dettagli atomici. I miglioramenti nell'ottica del microscopio, nell'hardware del computer e nel software di elaborazione delle immagini hanno permesso di determinare le strutture delle biomolecole con una risoluzione superiore a 2 ^Å1,2,3. Più di 2.300 strutture crio-EM sono state depositate nella Protein Data Bank (PDB)....

Protocollo

1. Creazione di un nuovo progetto cryoSPARC v3 e importazione dei dati

NOTA: I dati sono stati acquisiti presso l'Oregon Health and Science University (OHSU) di Portland utilizzando un microscopio elettronico Titan Krios da 300 kV dotato di un rivelatore di elettroni diretti Falcon 3. Le immagini sono state raccolte in modalità di conteggio con una dose totale di 28,38 e⁻/^Å2 frazionata su 129 fotogrammi e un intervallo di sfocatura da -0,5 μm a -2,5 μm, con una dimensione dei pixel di 1,045 Å utilizzando ePU. Il campione di AAV-DJ è stato fornito dallo staff di OHSU.

1. Aprire cryoSPARC v3 in un....

Risultati

Abbiamo presentato una pipeline SPA completa per ottenere una struttura ad alta risoluzione utilizzando tre diverse piattaforme di elaborazione: cryoSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3. La Figura 1 e la Figura 4 riepilogano il flusso di lavoro di elaborazione generale e nella Tabella 1 vengono descritti in dettaglio i protocolli di perfezionamento. Questi protocolli sono stati utilizzati durante i perfezionamenti di una struttura 2.3 Å di AAV, raggi.......

Discussione

In questo articolo, presentiamo un robusto flusso di lavoro SPA per l'elaborazione dei dati crio-EM su varie piattaforme software per ottenere ricostruzioni 3D ad alta risoluzione (Figura 1). Questo flusso di lavoro è applicabile a un'ampia varietà di macromolecole biologiche. I passaggi successivi del protocollo sono descritti nella Figura 4, tra cui la pre-elaborazione dei filmati, il prelievo e la classificazione delle particelle e diversi metodi per il per.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
CryoSPARC	Structura Biotechnology Inc.	https://cryosparc.com/
CTFFIND 4	Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School	https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4
MotionCorr2	UCSF Macromolecular Structure Group	https://msg.ucsf.edu/software
Phenix	Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC)	http://www.phenix-online.org/
PyEM	Univerisity of California, San Francisco	https://github.com/asarnow/pyem
RELION	MRC Laboratory of Structural Biology	https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page
Scipion	Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab	http://scipion.i2pc.es/
UCSF Chimera	UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/