Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этой статье описывается, как эффективно использовать три платформы обработки крио-ЭМ, т.е. cryoSPARC v3, RELION-3 и Scipion 3, для создания единого и надежного рабочего процесса, применимого к различным наборам данных с одной частицей для определения структуры с высоким разрешением.

Аннотация

Последние достижения в области как приборов, так и программного обеспечения для обработки изображений сделали криоэлектронную микроскопию одной частицы (крио-ЭМ) предпочтительным методом для структурных биологов для определения структур высокого разрешения широкого спектра макромолекул. Для новых и опытных пользователей доступно несколько пакетов программного обеспечения для обработки изображений и расчета структуры, которые оптимизируют один и тот же базовый рабочий процесс: фильмы, полученные детекторами микроскопа, проходят коррекцию для оценки движения и контрастной функции передачи луча (CTF). Затем изображения частиц выбираются и извлекаются из усредненных кадров фильма для итеративной 2D- и 3D-классификации, за которой следует 3D-реконструкция, уточнение и проверка. Поскольку различные программные пакеты используют разные алгоритмы и требуют разного уровня знаний для работы, 3D-карты, которые они генерируют, часто различаются по качеству и разрешению. Таким образом, пользователи регулярно передают данные между различными программами для достижения оптимальных результатов. Этот документ содержит руководство для пользователей по навигации по рабочему процессу в популярных программных пакетах: cryoSPARC v3, RELION-3 и Scipion 3 для получения структуры, близкой к атомному разрешению аденоассоциированного вируса (AAV). Сначала мы подробно описываем конвейер обработки изображений с помощью cryoSPARC v3, поскольку его эффективные алгоритмы и простой в использовании графический интерфейс позволяют пользователям быстро получить 3D-карту. На следующем этапе мы используем PyEM и собственные скрипты для преобразования и передачи координат частиц из 3D-реконструкции наилучшего качества, полученной в cryoSPARC v3, в RELION-3 и Scipion 3 и пересчитывают 3D-карты. Наконец, мы намечаем шаги для дальнейшего уточнения и валидации результирующих структур путем интеграции алгоритмов из RELION-3 и Scipion 3. В этой статье мы расскажем, как эффективно использовать три платформы обработки для создания единого и надежного рабочего процесса, применимого к различным наборам данных для определения структуры с высоким разрешением.

Введение

Криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) и анализ одной частицы (SPA) позволяют определять структуру широкого спектра биомолекулярных сборок в их гидратированном состоянии, помогая осветить роль этих макромолекул в атомных деталях. Усовершенствования в оптике микроскопа, компьютерном оборудовании и программном обеспечении для обработки изображений позволили определить структуры биомолекул с разрешением, превышающим 2 Å1,2,3. Более 2 300 крио-ЭМ-структур были депонированы в Банке данных белка (PDB) в 2020 году по сравнению со 192 структурами в 20144 году, что указывает на то, что крио-ЭМ стал методом выбора для многих структурных биологов. Здесь мы описываем рабочий процесс, объединяющий три различные программы SPA для определения структуры с высоким разрешением (рисунок 1).

Целью SPA является реконструкция 3D-объемов целевого образца из шумных 2D-изображений, записанных детектором микроскопа. Детекторы собирают изображения в виде фильмов с отдельными кадрами одного поля зрения. Чтобы сохранить образец, кадры собираются с низкой дозой электронов и, таким образом, имеют плохое отношение сигнал/шум (SNR). Кроме того, воздействие электронов может индуцировать движение внутри остеклованных крио-ЭМ-сеток, что приводит к размытию изображения. Чтобы преодолеть эти проблемы, кадры выравниваются для корректировки движения, вызванного лучом, и усредняются, чтобы получить микрофотографию с увеличенным SNR. Эти микроснимки затем проходят оценку функции переноса контраста (CTF) для учета эффектов расфокусировки и аберраций, наложенных микроскопом. Из микроснимков, скорректированных CTF, отдельные частицы отбираются, извлекаются и сортируются в средние значения 2D-класса, представляющие различные ориентации, принятые образцом в стекловидном льду. Результирующее однородное множество частиц используется в качестве входных данных для ab initio 3D-реконструкции для создания грубой модели или моделей, которые затем итеративно уточняются для получения одной или нескольких структур с высоким разрешением. После реконструкции выполняются структурные доработки для дальнейшего улучшения качества и разрешения крио-ЭМ карты. Наконец, либо атомная модель непосредственно выводится из карты, либо карта снабжена атомными координатами, полученными в другом месте.

Для выполнения описанных выше задач доступны различные пакеты программного обеспечения, включая Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13 и другие. Хотя эти программы следуют аналогичным этапам обработки, они используют разные алгоритмы, например, для выбора частиц, создания начальных моделей и уточнения реконструкций. Кроме того, эти программы требуют различного уровня пользовательских знаний и вмешательства для работы, так как некоторые из них зависят от тонкой настройки параметров, которые могут выступать в качестве препятствия для новых пользователей. Эти расхождения часто приводят к картам с несогласованным качеством и разрешением на разных платформах14, что побуждает многих исследователей использовать несколько пакетов программного обеспечения для уточнения и проверки результатов. В этой статье мы освещаем использование cryoSPARC v3, RELION-3 и Scipion 3 для получения 3D-реконструкции AAV с высоким разрешением, широко используемого вектора для генной терапии15. Вышеупомянутые пакеты программного обеспечения бесплатны для академических пользователей; cryoSPARC v3 и Scipion 3 требуют лицензий.

протокол

1. Создание нового проекта cryoSPARC v3 и импорт данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Данные были получены в Орегонском университете здоровья и науки (OHSU) в Портленде с использованием электронного микроскопа Titan Krios 300 кВ, оснащенного прямым электронным детектором Falcon 3. Изображения собирались в режиме подсчета с общей дозой 28,38 e/Å2 , дробленной на 129 кадров, и диапазоном дефокусировки от -0,5 мкм до -2,5 мкм при размере пикселя 1,045 Å с использованием EPU. Образец AAV-DJ предоставили сотрудники OHSU.

  1. Откройте cryoSPARC v3 в веб-браузере и щелкните заголовок Проекты . Выберите + Добавить , чтобы создать новый проект. Назовите проект соответствующим образом и укажите путь к существующему каталогу, в котором будут сохранены задания и данные.
  2. Создайте рабочую область для проекта, открыв проект, щелкнув + Добавить и выбрав Новая рабочая область. Назовите рабочую область и нажмите кнопку Создать.
  3. Перейдите в новую рабочую область и откройте конструктор заданий на правой панели. На этой вкладке отображаются все функции, доступные в cryoSPARC v3. Нажмите «Импорт фильмов» и укажите путь к фильмам, путь к файлу ссылки и задайте параметры получения следующим образом: Размер необработанного пикселя 1,045 Å, Ускоряющее напряжение 300 кВ, Сферическая аберрация 2,7 мм, Общая экспозиционная доза 28,38 e-/Å^2.
  4. Щелкните Очередь, выберите полосу для запуска задания и рабочей области, а затем нажмите кнопку Создать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры сбора зависят от образца и микроскопа.

2. CryoSPARC v3 - выравнивание ролика и оценка CTF

  1. Откройте исправление движения патча (Multi). Для этого задания в качестве входных данных требуются фильмы, импортированные на шаге 1.3. Откройте карточку заданий импорта фильмов в рабочей области и перетащите выходные данные Imported_movies в заполнитель фильмов в новом задании. Поставьте задание в очередь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения дополнительной информации о методах cryoSPARC, описанных в этой статье, см. учебник cryoSPARC16.
  2. Для выполнения оценки CTF откройте Patch CTF Estimation (Multi). Введите микроснимки, созданные на шаге 2.1, и поставьте задание в очередь.
  3. Чтобы проверить усредненные и CTF-скорректированные микроснимки и выбрать подмножество для дальнейшей обработки, откройте Curate Exposures и введите экспозиции, полученные на этапе 2.2. Поставьте задание в очередь.
  4. После того, как задание перейдет в режим ожидания , перейдите на вкладку Взаимодействие на карточке задания, настройте пороговые значения параметров и примите или отклоните отдельные микроснимки для дальнейшей обработки. Принимайте микроснимки с хорошо подобранными оценочными и экспериментальными CTF (рисунок 2) и отбрасывайте снимки с высоким астигматизмом, плохой посадкой CTF и толстым льдом.
  5. При обработке текущих данных установите верхний порог астигматизма равным 400 Å, разрешением соответствия CTF 5 Å и относительной толщиной льда 2. Нажмите « Готово», чтобы выбрать микроснимки для последующей обработки.

3. CryoSPARC v3 - ручной и шаблонный отбор частиц

  1. Откройте средство выбора вручную, введите принятые экспозиции из шагов 2.4-2.5 и поставьте задание в очередь. Нажмите на вкладку «Интерактивный », установите размер коробки (px) на 300 и нажмите на несколько сотен частиц на нескольких микрофотографиях и избегайте выбора перекрывающихся частиц. Здесь было отобрано 340 частиц на 29 микроснимках. Когда закончите, нажмите Готово Выбор! Извлеките частицы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует ручной отбор частиц для создания шаблонов для автоматического выбора. Однако доступны и другие методы17.
  2. Чтобы сгенерировать шаблоны для автоматического отбора частиц, нажмите на 2D-классификацию и введите выбор частиц, сгенерированные на шаге 3.1. Измените число 2D-классов на 10 и поставьте задание в очередь.
  3. Откройте Выбрать 2D-классы. Введите частицы и средние значения классов, полученные на шаге 3.2, и перейдите на вкладку Интерактивные . Выберите репрезентативные 2D-классы с хорошим SNR и нажмите готово.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Средние значения класса отражают различные представления частиц. Выберите средние значения класса, отражающие каждое представление. Цель состоит в том, чтобы создать четко определенные шаблоны, представляющие различные виды образца для автоматической комплектации.
  4. Откройте средство выбора шаблонов и введите 2D-классы, выбранные на шаге 3.3, и микроснимки из шагов 2.4-2.5. Установите диаметр частицы (Å) равным 220 Å и поставьте задание в очередь.
  5. Чтобы проверить автоматические выборки, откройте Select Particle Picks, введите частицы и микроснимки, созданные на шаге 3.4, и поставьте задание в очередь.
  6. На карточке задания Выбор частиц перейдите на вкладку Интерактивные и установите размер поля (px) равным 300. Нажмите на отдельный микрофотографию, отрегулируйте фильтр нижних частот до тех пор, пока частицы не станут хорошо видны, и установите порог нормализованной перекрестной корреляции (NCC) на 0,41 и порог мощности между 54000 и 227300.
  7. Осмотрите несколько микроснимков и, при необходимости, отрегулируйте пороговые значения таким образом, чтобы большинство частиц было выбрано без включения ложных срабатываний. По завершении нажмите Готово выбор! Извлеките частицы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Истинные частицы обычно имеют высокий показатель NCC и мощности, что указывает на то, что они похожи на шаблон и имеют высокий SNR, соответственно.
  8. Откройте Извлечение из микроснимков и введите микроснимки и частицы из шага 3.7. Установите для параметра Размер извлеченного поля (px) значение 300 и поставьте задание в очередь.

4. КриоСПАРК v3 - 2D классификация

  1. Нажмите на 2D Classification и введите извлеченные частицы из шага 3.8. Установите для параметра Число 2D-классов значение 50 и поставьте задание в очередь.
  2. Чтобы выбрать лучшие 2D-классы для дальнейшей обработки, откройте Выбрать 2D-классы. Введите частицы и средние значения классов, полученные на шаге 4.1. Нажмите на вкладку Interactive и выберите 2D-классы в зависимости от разрешения и количества частиц в классе (рисунок 3). Не выбирайте классы, содержащие артефакты. После выбора нажмите Готово.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно для удаления частиц, которые не сходятся в отдельные, четко определенные классы, требуется несколько раундов 2D-классификации. Выполните столько раундов 2D-классификации, сколько необходимо для удаления таких частиц из набора данных (рисунок 3).

5. CryoSPARC v3 - ab-initio реконструкция и однородная доработка

  1. Чтобы сгенерировать начальный 3D-объем, откройте Ab-initio Reconstruction и введите частицы, полученные на шаге 4.2 или из окончательной 2D-классификации. Настройте симметрию на икосаэдрическую. Поставьте задание в очередь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Симметрия зависит от выборки и должна быть изменена соответствующим образом. Если неизвестно, используйте симметрию C1.
  2. Открытая однородная очистка. Введите объем из шага 5.1 и частицы из 4.2 или окончательную 2D-классификацию. Измените симметрию и поставьте задание в очередь. По завершении задания проверьте кривую корреляции оболочки Фурье (FSC) и загрузите том для изучения в UCSF Chimera18.

6. Экспорт координат частиц из cryoSPARC v3 и импорт их в RELION-3 с помощью PyEM

ПРИМЕЧАНИЕ: Координаты частиц несут информацию о местоположении отдельных частиц на каждой микроснимке. Передача координат вместо стеков частиц в RELION-3 позволяет выполнять этапы уточнения, которые в противном случае были бы недоступны. Например, для полировки частиц требуется доступ к начальным кадрам фильма. Следовательно, перед экспортом координат частиц из cryoSPARC v3 в RELION-3 импортируйте фильмы и выполняйте коррекцию движения и оценку CTF в RELION-3. Подробности см. в учебнике RELION-319.

  1. Перейдите в каталог проекта RELION-3 и запустите RELION-3.
  2. Откройте импорт из браузера типа задания и укажите путь к фильмам и параметрам получения, как показано на шаге 1.3.
  3. Чтобы выполнить коррекцию движения, используйте UCSF MotionCor220 через графический интерфейс RELION-3, откройте Motion Correction и установите параметры по умолчанию, как в руководстве UCSF MotionCor222. Введите путь к фильмам, импортированным на шаге 6.2. На вкладке Движение укажите путь к исполняемому файлу motioncor2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: MotionCor2 можно запускать параллельно с использованием нескольких графических процессоров.
  4. Выполните оценку CTF с использованием CTFFIND-4.122 через графический интерфейс RELION-3. Откройте оценку CTF и введите micrographs.star, сгенерированный на шаге 6.3. На вкладке CTFFIND-4.1 укажите путь к исполняемому файлу CTFFIND-4.1 и задайте параметры, как в учебнике RELION-3.119.
  5. Чтобы импортировать стеки частиц из cryoSPARC v3 в RELION-3, они сначала должны быть экспортированы из cryoSPARC v3. В cryoSPARC v3 откройте карточку заданий задания Select 2D class из шага 4.2 или окончательной 2D-классификации. На вкладке Сведения нажмите кнопку Экспорт задания. Задание экспорта выводит файл particles_exported.cs.
  6. Перед импортом координат частиц из cryoSPARC v3 в RELION-3 файл particles_exported.cs из шага 6.5 должен быть преобразован в формат .star. Используя PyEM23, преобразуйте particles_exported.cs файл в формат .star, выполнив следующую команду: csparc2star.py particles_exported.cs particles_exported.star
  7. В RELION-3 перейдите на вкладку «Ручной выбор» и на вкладке «Ввод-вывод » введите микроснимки из уточнения CTF, описанного в шаге 6.4. На вкладке Дисплей введите следующие параметры: Диаметр частиц (A): 220, Фильтр нижних частот (A): -1 , Масштаб для изображения CTF: 0,5. Запустите задание. Каталог с именем ManualPick создается в домашней папке RELION-3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг выполняется для создания структуры папок ручного выбора в RELION-3. При ручном отборе для каждого усредненного микрофотографии, используемого для отбора в графическом интерфейсе RELION-3, создается один файл .star, содержащий координаты выбранных частиц.
  8. Перейдите в папку, содержащую файл particles_exported.star из шага 6.6, и запустите домашний сценарий, создающий один файл manualpick.star для каждого усредненного микрофотографии, используемого для выбора частиц cryo-SPARC v3, что способствовало окончательной 2D-классификации, экспортированной на шаге 6.5. Полученные файлы координат сохраняются в папке ManualPick/Movies.
  9. Вернитесь в RELION-3 и снова откройте задание Ручная комплектация . Нажмите продолжить. Это отобразит частицы, ранее выбранные в cryoSPARC v3, в графическом интерфейсе RELION-3. Осмотрите несколько микроснимков, чтобы убедиться, что передача координат частиц была выполнена и правильно ли выбраны частицы.

7. RELION-3 - Экстракция частиц и 2D классификация

  1. Нажмите на Извлечение частиц. На вкладке Ввод-вывод введите скорректированные микроснимки CTF из шага 6.4 и координаты из шага 6.9. Перейдите на вкладку «Извлечь» и измените размер ячейки частиц (пикс) на 300. Запустите задание.
  2. Выполните 2D-классификацию для дальнейшей очистки набора частиц, сгенерированного в cryoSPARC v3, для достижения реконструкции с более высоким разрешением. Нажмите на 2D Classification и на вкладке I/O введите файл particles.star, сгенерированный на шаге 7.1. На вкладке Оптимизация установите для параметра Количество классов значение 50, а для параметра Диаметр маски (A) — 280. Запустите задание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Маска должна охватывать всю частицу.
  3. Чтобы выбрать лучшие 2D-классы, щелкните метод Выбора подмножества , введите файл _model.star из шага 7.2 и запустите задание. Выберите классы, как описано в шаге 4.2.
  4. Повторите шаги 7.2 и 7.3, чтобы удалить несходящиеся частицы.

8. RELION-3 - 3D уточнение, создание маски и постобработка

  1. Используйте карту, сгенерированную в cryoSPARC v3 (шаг 5.2), в качестве исходной модели для 3D-уточнения в RELION-3. Выберите метод Импорт и задайте следующие параметры на вкладке Ввод-вывод : Импорт необработанных фильмов/микрофотографий: Нет, Необработанные входные файлы: Фильмы/*.mrc.
  2. Введите файл MTF и введите параметры получения фильма, как описано в шаге 1.3. На вкладке Другие выберите карту cryoSPARC v3 в качестве входного файла, измените Тип узла на 3D-ссылку (.mrc) и выполните задание.
  3. Выберите 3D Auto-Refine и на вкладке Ввод-вывод установите Входные изображения в качестве файла particles.star из шага 7.3 или последнего задания выбора. Приведите реконструкцию cryoSPARC v3 в качестве справочной карты. Перейдите на вкладку Ссылка и измените начальный фильтр нижних частот (Å) на 50 и симметрию на icosahedral. На вкладке Оптимизация измените диаметр маски (Å) на 280 и выполните задание.
  4. После завершения пробега откройте run_class001.mrc в UCSF Chimera.
  5. В UCSF Chimera щелкните Инструменты и в разделе Данные тома выберите Средство просмотра томов. Откроется новое окно для настройки параметров громкости. Измените шаг на 1 и отрегулируйте ползунок до достижения значения уровня, на котором карта не имеет шума. Запишите это значение, так как оно будет использоваться для создания маски на следующем шаге.
  6. Карта, полученная в результате автоочистки, не отражает истинный FSC, так как шум от окружающего растворителя снижает разрешение. Перед последующей обработкой создайте маску, чтобы отличить образец от области растворителя.
    1. Щелкните Создание маски и введите run_class001.mrc из шага 8.3.
    2. Перейдите на вкладку Маска и настройте параметры следующим образом: Карта фильтров нижних частот (Å): 10, Размер пикселя (Å): 1,045, Начальный порог бинаризации: значение уровня, полученное на шаге 8.5, Расширить двоичную карту на это количество пикселей: 3 и Добавить мягкий край этого количества пикселей: 3. Запустите задание.
  7. Изучите маску в UCSF Chimera. Если маска слишком плотная, увеличьте На столько пикселей увеличить двоичную карту и/или добавьте мягкий край этого количества пикселей. Важно создать маску с мягкими краями, так как острая маска может привести к переподготовке.
  8. Нажмите на Постобработка и на вкладке Ввод-вывод введите полукарты, созданные на шаге 8.3, и маску из 8.6. Установите размер калиброванного пикселя равным 1,045 Å. На вкладке Резкость введите следующее: Оцените B-фактор автоматически?: Да, самое низкое разрешение для автоподгонки B (A): 10, используйте свой собственный B-фактор?: Нет. На вкладке Фильтр установите для параметра Пропустить Fsc-Weighting? значение Нет. Выполните задание.

9. RELION-3 - Обучение полировке и полировке частицами

  1. Перед корректировкой движения, вызванного пучком частицы, сначала используйте режим обучения, чтобы определить оптимальные траектории движения для набора данных. Откройте байесовскую полировку и на вкладке Ввода-вывода введите микроснимки с коррекцией движения из шага 6.3, частицы из шага 8.3 и файл .star постпроцесса из шага 8.8. Перейдите на вкладку Обучение и задайте следующие параметры: Оптимальные параметры тренировки: Да, Доля пикселей Фурье для тестирования: 0,5, Используйте это количество частиц: 5000. Запустите задание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот скрипт создаст opt_params_all_groups.txt файл в польской папке RELION-3, содержащий оптимизированные параметры полировки, необходимые для выполнения следующего шага.
  2. Как только учебная работа будет завершена, нажмите на Байесовскую полировку. Перейдите на вкладку Обучение и установите для параметра Оптимальные параметры тренировки? значение Нет. Выберите вкладку Польский и в разделе Оптимизированный файл параметров укажите путь к файлу opt_params_all_groups.txt из шага 9.1. Нажмите кнопку Выполнить.
  3. Повторите 3D-уточнение (шаг 8.3) и постобработку (шаг 8.8) с набором полированных частиц.

10. RELION-3 - Уточнения CTF и частиц

  1. Чтобы оценить аберрации более высокого порядка, откройте уточнение CTF и на вкладке Ввод-вывод в разделе Частицы выберите путь к файлу .star, содержащему отполированные частицы из недавнего задания Уточнение 3D (run_data.star).
    1. В разделе Postprocess Star File задайте путь к выходным данным последнего задания постобработки (шаг 9.3).
    2. Выберите вкладку «Подгонка» и задайте следующие параметры: Оценка (анизотропное увеличение): Нет, выполнить подгонку параметров CTF? Нет, оцените Beamtilt: Да, также оцените трилистник? Да, оценка абберации 4-го порядка? Да. Запустите задание.
  2. Повторите шаг 10.1, используя в качестве входных частиц (из Refine3D ), сгенерированных в предыдущем задании (particles_ctf_refine.star). На вкладке Соответствие измените значение параметра Оценка (анизотропное увеличение) на Да и выполните задание.
  3. Повторите шаг 10.2, используя в качестве входных частиц (из Refine3D), полученных в предыдущем задании (particles_ctf_refine.star). На вкладке Fit задайте следующие параметры: Оценка (анизотропное увеличение): Нет, Выполнить подгонку параметров CTF?: Да, Fit Defocus?: Per-particle, Fit Astigmatism? На микрофотографию, Fit B-фактор?: Нет, Fit Phase-Shift: No, Estimate Beamtilt?: No, Estimate 4th Order Aberrations?: No. Запустите его.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая, что частица имеет достаточную контрастность, вкладку Fit Astigmatism? можно установить в Per-particle. Для этого набора данных уточнение астигматизма на частицу не улучшило качество и разрешение карты.
  4. Повторите 3D-уточнение с частицами из шага 10.3 и на вкладке «Ввод-вывод» установите для параметра Использовать FSC с сглаженными растворителями? значение «Да». По завершении выполнения выполните задание постобработки (шаг 8.8) и изучите карту в UCSF Chimera (шаг 5.2).

11. Передача координат частиц RELION-3 и 3D карты в Сципион 3

  1. Для дальнейшего уточнения и проверки карты RELION-3 сначала импортируйте объем и частицы из последнего задания постобработки (шаг 10.4) в Scipion 3. Запустите Scipion 3 и создайте новый проект.
  2. На левой панели «Протоколы » выберите раскрывающийся список «Импорт» и нажмите « Импортировать частицы». Измените следующие параметры: Импорт из: RELION-3, Star File: postprocess.star и укажите параметры получения, как показано в шаге 1.3. Нажмите кнопку Выполнить.
  3. Щелкните раскрывающийся список Импорт и выберите Импорт томов. В разделе Импорт от укажите путь к карте RELION-3. Измените размер пикселя (частоту дискретизации) Å/px на 1,045 и выполните.

12. Scipion 3 - Уточнение высокого разрешения

  1. Во-первых, выполните глобальное выравнивание. Выберите раскрывающийся список Уточнить на панели Протоколы и нажмите на Xmipp3 - highres24. Введите импортированные частицы и тома из шагов 11.2 и 11.3 в виде полноразмерных изображений и начальных томов соответственно и установите для группы симметрии икосаэдрическое значение. На вкладке Выравнивание изображения в разделе Угловое назначение выберите Глобальный, установите для параметра Максимальное целевое разрешение значение 3 Å и выполните задание.
  2. Когда задание будет завершено, нажмите «Анализировать результаты». В новом окне нажмите на значок UCSF Chimera , чтобы просмотреть уточненный объем. Кроме того, нажмите «Графики разрешения дисплея» (FSC), чтобы увидеть, как изменился FSC после уточнения, а также «График гистограммы с угловыми изменениями», чтобы увидеть, изменились ли назначения угла Эйлера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от разрешения входной структуры RELION-3 этот шаг может быть повторен несколько раз с различными значениями, установленными для максимального целевого разрешения на вкладке Угловое назначение . Для получения дополнительной информации см. учебник Scipion25.
  3. Повторите шаг 12.1 с локальным выравниванием. Скопируйте предыдущее задание и измените Параметр Выбрать предыдущий запуск на Xmipp3 - highres Global. На вкладке Угловое назначение измените выравнивание изображения на Локальное. Установите для параметра Максимальное целевое разрешение значение 2,1 Å.
  4. Изучите уточненную карту в UCSF Chimera и проанализируйте изменение FSC и угловых присвоений (шаг 12.2). Повторяйте локальное уточнение до тех пор, пока разрешение не улучшится и угловые назначения не сойдутся, при необходимости настраивая максимальное целевое разрешение .
  5. Выходная карта из Scipion 3 может быть дополнительно модифицирована плотностью и заточена в Phenix26.

13. Scipion 3 - Проверка карты

  1. Изучите локальное разрешение окончательной карты, сгенерированной в Xmipp3 - highres. Откройте Xmipp - локальный MonoRes27 и введите окончательный том из предыдущего задания и маску, сгенерированные на шаге 8.6. Установите диапазон разрешения от 1 до 6 Å с интервалом 0,1 Å и выполните задание.
  2. Когда вы закончите работу, нажмите «Анализировать результаты» и изучите гистограмму разрешения и объемные фрагменты, окрашенные разрешением.
  3. Чтобы увидеть, хорошо ли выровнены частицы, откройте Multireference Alignability28 и введите частицы и объем с шага 12.3. Щелкните Анализ результатов, чтобы отобразить график проверки. В идеале все точки должны быть сгруппированы вокруг (1.0,1.0).
  4. Откройте Xmipp3 - Проверка перенастройки. Введите частицы и объемы из шага 12.3. Когда закончите работу, проанализируйте результаты и осмотрите график перенастройки. Пересечение выровненных кривых гауссовского шума и выровненных частиц указывает на перенастройку.

Результаты

Мы представили комплексный конвейер SPA для получения структуры высокого разрешения с использованием трех различных платформ обработки: cryoSPARC v3, RELION-3 и Scipion 3. На рисунках 1 и 4 обобщен общий рабочий процесс обработки, а в таблице 1 подробно описаны ...

Обсуждение

В этой статье мы представляем надежный рабочий процесс SPA для обработки крио-EM данных на различных программных платформах для достижения 3D-реконструкций с высоким разрешением (рисунок 1). Этот рабочий процесс применим к широкому спектру биологических макромолекул. Посл...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Карлоса Оскара Сорцано за помощь в установке Scipion3 и Килиана Шнелле и Арне Мёллера за помощь в передаче данных между различными платформами обработки. Часть этого исследования была поддержана грантом NIH U24GM129547 и выполнена в PNCC в OHSU и доступна через EMSL (grid.436923.9), Пользовательский объект Управления науки Министерства энергетики США, спонсируемый Управлением биологических и экологических исследований. Это исследование было поддержано грантом стартапа от Ратгерского университета Ареку Кульчику.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
CryoSPARCStructura Biotechnology Inc.https://cryosparc.com/
CTFFIND 4Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical Schoolhttps://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4
MotionCorr2UCSF Macromolecular Structure Grouphttps://msg.ucsf.edu/software
PhenixComputational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC)http://www.phenix-online.org/
PyEMUniverisity of California, San Franciscohttps://github.com/asarnow/pyem
RELIONMRC Laboratory of Structural Biologyhttps://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page
ScipionInstruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLabhttp://scipion.i2pc.es/
UCSF ChimeraUCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informaticshttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/

Ссылки

  1. Bartesaghi, A., et al. Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase. Structure. 26 (6), 848-856 (2018).
  2. Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
  3. Wardell, M., et al. The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A. Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).
  4. PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB Available from: https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em (2021)
  5. Lander, G. C., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
  6. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383 (2018).
  7. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  8. Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  9. van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
  10. Scheres, S. H. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  11. de la Rosa-Trevin, J. M., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  12. Shaikh, T. R., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
  13. Sorzano, C. O., et al. XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).
  14. Lawson, C. L., Chiu, W. Comparing cryo-EM structures. Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).
  15. Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
  16. Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at Available from: https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial (2020)
  17. Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET. Nature Communications. 11 (5208), (2020).
  18. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  19. . Single-particle processing in RELION-3.1 Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf (2019)
  20. Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  21. . MotionCor2 User Manual Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf (2018)
  22. Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).
  23. . UCSF PyEM v0.5 Available from: https://github.com/asarnow/pyem (2019)
  24. Sorzano, C. O. S., et al. A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy. Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).
  25. Jimenez-Moreno, A., et al. Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261 (2021).
  26. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).
  27. Vilas, J. L., et al. MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps. Structure. 26 (2), 337-344 (2018).
  28. Sorzano, C. O., et al. A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy. Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).
  29. Penczek, P. A. Resolution measures in molecular electron microscopy. Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).
  30. Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution. Viruses. 12 (10), 1194 (2020).
  31. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166 (2018).
  32. Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

179SPAcryoSPARCRELIONScipionAAV

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены