טכניקת שרוול שונה למודל השתלת לב הטרוטופי של עכבר צוואר הרחם

Summary

בפרוטוקול הנוכחי, מודל השתלת לב עכבר משמש לחקירת מנגנון דחיית אלוגרפט לבבי. במודל השתלת לב הטרוטופי זה, יעילות הניתוח משופרת, והישרדותם של שתלי לב מובטחת על ידי אנסטומוזה מקצה לקצה של צוואר הרחם של השתלת לב באמצעות טכניקת שרוול שונה.

Abstract

דחיית השתלת לב מגבילה את הישרדותם לטווח ארוך של חולים לאחר השתלת לב. מודל השתלת לב עכבר אידיאלי לחקר המנגנון של דחיית אלוגרפט לבבי במחקרים פרה-קליניים בגלל ההומולוגיה הגבוהה שלהם עם גנים אנושיים. הבנה זו תסייע לפתח גישות ייחודיות לשיפור הישרדותם ארוכת הטווח של החולים המטופלים באלושתלי לב. במודל עכברי, השתלת לב תורם בטן מבוצעת בדרך כלל עם אנסטומוזה מקצה לקצה לאבי העורקים של המקבל ונבוב ורידי נחות באמצעות תפרים. במודל זה, ליבו של התורם מושתל באנסטומוזה מקצה לקצה לעורק התרדמה ולווריד הצוואר של המקבל בטכניקת השרוול השונה. ניתוח ההשתלה מבוצע ללא תפירה ובכך עשוי להגדיל את הישרדותו של המושתל שכן אין הפרעה באספקת הדם וריפלוקס ורידי פלג הגוף התחתון. מודל עכברי זה יסייע לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס הדחייה האימונולוגית והפתולוגית (חריפה/כרונית) של אלוגרפטים לבביים.

Introduction

השתלת לב הפכה לטיפול הסטנדרטי באי ספיקת לב סופנית. יותר מ-5,500 השתלות לב בשנה מבוצעות בארגונים הרשומים תחת האגודה הבינלאומית להשתלות לב וריאות. בקרב מושתלי הלב האלוגניים, שיעור הדחייה לשנה הוא עדיין >10%, בעוד ששיעור הדחייה ל-3 שנים עלה ל-36%^1,2. עם זאת, טיפולים מניעתיים יעילים לחולים עם דחיית אלוגרפט לבבית חסרים. לכן, מחקרי מודלים בבעלי חיים מוצדקים המבהירים את המנגנונים הפיזיולוגיים העומדים בבסיס הדחייה החיסונית והפתולוגית של אלוגרפטים לבביים. מחקרים כאלה יתרמו לחקר מטרות חדשות הנדרשות לפיתוח תרופות יעילות, אשר יסייעו במניעת דחיית אלוגרפט לבבי וישפרו את שיעורי ההישרדות באוכלוסיות חולים אלה.

כמה מנגנונים אימונולוגיים ופתופיזיולוגיים פוטנציאליים של דחיית אלוגרפט לבבי הוצעו לאחרונה במחקרי מודל עכברים של השתלת לב הטרוטופית ^3,4,5. כתוצאה מכך, השתלת לב הטרוטופית בעכבר הפכה למודל פרה-קליני אידיאלי לחקר מנגנוני הדחייה החיסונית והפגיעה הפתולוגית המתרחשים בהשתלות לב לאחר השתלת לב בגלל ההומולוגיה הגבוהה שלהם עם גנים אנושיים. הרעיון הרווח הוא לבצע השתלה הטרוטופית במודל עכברי על ידי אנסטומוזה בטנית מקצה לקצה באבי העורקים המושתל ונבוב ורידי נחות באמצעות תפרים, בדומה לאנטומיה האנושית הרגילה. עם זאת, הליך זה עלול להפריע לאספקת הדם של המקבל וריפלוקס ורידי של פלג הגוף התחתון⁶. לכן, הליך השתלת לב הטרוטופי שונה במודל עכבר מוצע כאן.

ליבו של התורם מושתל בעורק התרדמה ובווריד הצוואר של המקבל על ידי אנסטומוזה צווארית מקצה לקצה בטכניקת שרוול שונה. הליך שונה זה הקל על ההיתכנות הניתוחית והבטיח את הישרדות השתל הלבבי מבלי להפריע לאספקת הדם ולריפלוקס ורידי של פלג הגוף התחתון.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, מהדורה שמינית, המועצה הלאומית למחקר (ארה"ב) 2011. נהלים המערבים נבדקים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית החולים לסרטן של אוניברסיטת צ'ונגצ'ינג, צ'ונגצ'ינג, סין. עכברי BALB/c ו-C57BL/6 זכרים במשקל 20-30 גרם, שהתקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים), שימשו למחקר השתלת לב אלוגנית. עכברי C57BL/6 שימשו כתורמים ומושתלים סינגניים, ואילו עכברי BALB/c שימשו כמושתלים אלוגניים. סכמה של הפרוטוקול מוצגת באיור 1.
הערה: כל החומרים המשמשים במהלך הניתוח, כולל מכשירים ופתרונות ניתוחיים, הם סטריליים. ההליך הכירורגי שומר על עקרון טכניקת הפעולה האספטית.

1. הליך הנמען

1. יש להשרות הרדמה כללית באמצעות שאיפה של איזופלורן 5% דרך תא אינדוקציה בגודל 15 x 10 x 10 ס"מ המחובר למכסה מנוע (ראה טבלת חומרים).
2. תקן את העכבר הנמען על שולחן הניתוחים באמצעות כרית חימום. יש לשמור על הרדמה עם שאיפה מתמשכת של 2% איזופלורן דרך מסכת פנים מעל האף והפה.
   הערה: קצב וקצב נשימה איטיים, היעלמות רפלקס הקרנית והיעדר רפלקס הדוושה באצבעות הרגליים מצביעים על יעילות ההרדמה.
3. לאחר גילוח השיער, יש לחטא את אזור הניתוח בשלושה סבבים לסירוגין של קרצוף פובידון-יוד ואחריו אלכוהול. לאחר מכן, חותכים את העור 1.5-2 ס"מ במקביל לקו האמצע הצווארי מהזווית המנדיבולרית הימנית ועד קצה הזנב.
4. לנתח ~ 1 ס"מ של וריד הצוואר החיצוני הימני באמצעות אלקטרו-קרישה ומיקרו-מלקחיים. חותכים את הווריד בקצה הפרוקסימלי עם מהדק כלי דם א-טראומטי ומחברים אותו בקצה הדיסטלי.
5. מעבירים את הקצה הדיסטלי של הווריד דרך שרוול דוקרני פוליאוריתן 22 גרם (ראו טבלת חומרים) עם קצה משופע וחריצים שטחיים. תקן את הווריד עם ידית השרוול באמצעות מהדק כלי דם.
6. הסר את ה-8-0 תפר קשירה בקצה הדיסטלי, להפוך את לומן מעל השרוול מחובר על ידי barb שטחי מבפנים החוצה ולתקן עם תפר כירורגי 10-0 חריצים של פני השטח.
7. יש לכרות את הבלוטה התת-לשונית הימנית כדי ליצור פוסה להשתלת השתלת הלב, ולשמור את האונה הימנית של הבלוטה התת-מקסילרית ואת הסטרנוקלידומסטואיד הימני.
8. נתחו את עורק התרדמה המשותף הימני במשך ~1 ס"מ באמצעות מיקרו-מלקחיים, וחתכו את העורק עם מהדק מיקרו-וסקולרי א-טראומטי בקצה הפרוקסימלי. בקצה הדיסטלי, לקשור ולחתוך את העורק.
9. מעבירים את הקצה הדיסטלי של העורק דרך שרוול דוקרני פוליאוריתן 26 גרם (ראו טבלת חומרים) עם קצה משופע וחריצים על פני השטח. תקן את העורק עם ידית השרוול באמצעות מהדק כלי דם.
10. מוציאים את תפר הקשירה בקצה הדיסטלי, הופכים את הלומן מבפנים החוצה מעל השרוול, ומקבעים עם מוט שטחי וחריצים בתפר כירורגי 10-0.
11. לאחר הכנת כלי הדם של הנמען, יש לטפטף 100 IU/mL של מי מלח הפרין על כלי הדם כדי למנוע פקקת. מכסים את חתך צוואר הרחם בגזה מלח רטובה סטרילית להשתלה לאחר מכן.

2. הליך התורם

1. השתמש באותו הליך הרדמה (שלב 1.1) עבור העכבר התורם.
2. יש לגלח את שיער הבטן באמצעות סכין גילוח חשמלי, ולחטא את אזור הניתוח בשלושה סבבים לסירוגין של קרצוף פובידון-יוד ואחריו אלכוהול.
3. חותכים את הבטן (2-3 ס"מ) עם מספריים לאורך קו האמצע מהסימפיזיס פאביס לסובקסיפואיד, ומרחיבים את האזור החתוך עם מחזיר.
4. יש לנתח 1 ס"מ של אבי העורקים הבטני והווריד הנבוב התחתון באמצעות אלקטרו-קרישה ומיקרו-מלקחיים, ולבצע הפריניזציה על ידי הזרקת 1 מ"ל של מי מלח פיזיולוגיים בתוספת 250 IU/מ"ל של הפרין דרך הווריד הנבוב התחתון. לאחר מכן, הבלו את אבי העורקים הבטן ואת נבוב הווריד הנחות.
5. מוציאים את בית החזה לאורך קו בית השחי הקדמי משני הצדדים באמצעות מספריים כירורגיים להפרדת דופן בית החזה. ניצחון 0:8 על הווריד קאווה המעולה תפר כירורגי.
6. הכנס מחט קרקפת אל הווריד הנבוב התחתון suprahepatic. לאחר מכן, הזריקו מלח פיזיולוגי קר כקרח בתוספת 100 IU/mL של הפרין דרך מחט הקרקפת מווריד נבוב נחות בכבד כדי לחורר את הלב התורם עד שצבע הדם דוהה.
7. לנקב מחדש את לב התורם עם 2-3 מ"ל של תמיסת היסטידין-טריפטופן-קטוגלוטרט (HTK) קרה כקרח (ראו טבלת חומרים) באמצעות מחט קרקפת מקשת אבי העורקים כדי להגן על שריר הלב של התורם. זמן האיסכמיה החם הממוצע הוא 5 דקות.
8. קשרו את הווריד הנבוב העליון והנחות ואת וריד הריאתי בתפר ניתוחי 5-0. לנתח ולחתוך את אבי העורקים התורם ואת עורק הריאה לפני הסתעפותם. לאחר מכן, לחלק את הווריד הנבוב העליון והנחות ואת הווריד הריאתי כדי להסיר את הלב של התורם.

3. השתלה

1. השתיל את הלב התורם בכיס הצוואר של העכבר המקבל במצב הפוך.
2. משוך את השרוול עם וריד ג'וגולרי מושתל קטוע לתוך לומן של עורק הריאה התורם כדי לבצע אנסטומוזה מקצה לקצה של עורק הריאה התורם לווריד הצוואר החיצוני של הנמען. קשרו את השרוול באמצעות החריצים על פני השטח דרך תפר כירורגי 10-0 כדי לתקן את האנסטומוזה.
3. להפעיל הליך דומה עבור אנסטומוזה מקצה לקצה של אבי העורקים התורם לעורק התרדמה המקבל.
4. שחררו את המהדק המיקרו-וסקולרי הא-טראומטי של הווריד הצווארי ואחריו את עורק התרדמה כדי לחורר מחדש את לב התורם. זמן האיסכמיה הקר הממוצע הוא 15 דקות.
5. תקן את השתל הלבבי ותפר אותו כראוי כדי למנוע פיתול של השתל.
6. סגור את החתך הצווארי עם תפרים רציפים באמצעות תפר מונופילמנט פוליאמיד 5-0 (ראה טבלת חומרים).
   הערה: הסר את התפר לאחר שהפצע נרפא לחלוטין.
7. שמור את העכבר המושתל בתוך כלוב חם, יבש ונקי עד שהוא מתאושש מההרדמה.
   הערה: לוקח 5-10 דקות להתאושש.
8. הזריקו buprenorphine (0.05 מ"ג / ק"ג) תת עורית לתוך העכבר המקבל כל 6 שעות במשך 48 שעות עבור שיכוך כאבים לאחר הניתוח.
   הערה: מינון שיכוך הכאבים הותאם למחקר זה. עם זאת, ניתן להאריך / לשנות את משטר שיכוך הכאבים אם יש סימן כלשהו לכאב בהתאם להנחיות המוסדיות לשימוש בבעלי חיים.

תוצאות

במודל השתלת לב הטרוטופי זה של עכבר צוואר הרחם, שיעור ההישרדות של עכברים מושתלים היה כ -95.2% (20 מתוך 21 עכברים שרדו). סיבת המוות העיקרית הייתה דימום לאחר הניתוח. פעימות הלב המהירות עם קצב קבוע משמשות אינדיקטור להישרדות הלב התורם המושתל.

עכברי C57BL/6 ו-BALB/c היו מסוג MHC (H-2b) ו-MHC (H-2d) בדגם ...

Discussion

מודל השתלת הלב בעכבר תורם לחקר מנגנוני הדחייה לאחר השתלת לב, ותורם לפיתוח גישות ייחודיות לשיפור הישרדותם ארוכת הטווח של מושתלי השתלת לב. עם זאת, השתלת לב בעכברים היא משימה מורכבת ומאתגרת, הדורשת רמה גבוהה של טכניקות מיקרוכירורגיה, במיוחד באנסטומוזה וסקולרית^11,12,13

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	C3090954
8-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	C2090880
10-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	G0090781
22 G polyurethane cuff	B.Braun Medical Inc.	4251628-02
26 G polyurethane cuff	Suzhou Linhua Medical Instrument Co., LTD	REF383713
Anesthesia induction chamber	RWD Life Science Co., LTD	V100
Atraumatic microvascular clamp	Beyotime	FS500
BALB/c and C57BL/6 mice (20–30 g)	Centre of Experimental Animals (Army Medical University, Chongqing, China)
Buprenorphine	US Biological life Sciences	352004
Electrocoagulator	Guangzhou Runman Medical Instrument Co., LTD	ZJ1099
Gauze	Henan piaoan group Co., LTD	10210402
Heating pad	Guangzhou Dewei Biological Technology Co., LTD	DK0032
Heparin	North China Pharmaceutical Co., LTD	2101131-2
HTK solution	Shenzhen Changyi Pharmaceutical Co., LTD	YZB/Min8263-2013
Injection syringe (10 mL)	Shandong weigao group medical polymer Co., LTD	20211001
Isoflurane	RWD Life Science Co., LTD	21070201
Physiological saline	Southwest pharmaceutical Co., LTD	H50021610
Scalp needle	Hongyu Medical Group	20183150210
Shaver	Beyotime	FS600
Small animal anesthesia machine	RWD Life Science Co., LTD	R500
Surgical operation microscope	Tiannuoxiang Scientific Instrument Co. , Ltd, Beijing, China	SZX-6745
Swab	Yubei Medical Materials Co., LTD	21080274