Eine modifizierte Manschettentechnik für das zervikale heterotope Herztransplantationsmodell der Maus

Zusammenfassung

Im vorliegenden Protokoll wird ein Maus-Herztransplantationsmodell verwendet, um den Mechanismus der kardialen Allotransplantatabstoßung zu untersuchen. In diesem heterotopen Herztransplantationsmodell wird die Operationseffizienz verbessert und das Überleben von Herztransplantaten durch eine zervikale End-to-End-Anastomose der Herzimplantation unter Verwendung einer modifizierten Manschettentechnik sichergestellt.

Zusammenfassung

Die Abstoßung von kardialen Allotransplantaten schränkt das Langzeitüberleben von Patienten nach einer Herztransplantation ein. Ein Maus-Herztransplantationsmodell ist aufgrund seiner hohen Homologie mit menschlichen Genen ideal für die Untersuchung des Mechanismus der kardialen Allotransplantatabstoßung in präklinischen Studien. Dieses Verständnis würde dazu beitragen, einzigartige Ansätze zur Verbesserung des Langzeitüberlebens von Patienten zu entwickeln, die mit kardialen Allotransplantaten behandelt werden. In einem Mausmodell wird die Implantation eines abdominalen Spenderherzens üblicherweise mit einer Ende-zu-Ende-Anastomose an der Aorta und der unteren Hohlvene des Empfängers unter Verwendung von Stichen durchgeführt. In diesem Modell wird das Herz des Spenders durch End-to-End-Anastomose in die Halsschlagader und die Halsvene des Empfängers durch die modifizierte Manschettentechnik implantiert. Die Transplantation wird ohne Nähen durchgeführt und kann somit das Überleben des Empfängers erhöhen, da die Blutversorgung und der venöse Rückfluss des Unterkörpers nicht beeinträchtigt werden. Dieses Mausmodell würde helfen, die Mechanismen zu untersuchen, die der immunologischen und pathologischen (akuten/chronischen) Abstoßung von kardialen Allotransplantaten zugrunde liegen.

Einleitung

Die Herztransplantation ist zur Standardbehandlung für Herzinsuffizienz im Endstadium geworden. Mehr als 5.500 Herztransplantationen pro Jahr werden in den Organisationen durchgeführt, die bei der Internationalen Gesellschaft für Herz- und Lungentransplantation registriert sind. Bei den Empfängern allogener Herztransplantate liegt die 1-Jahres-Abstoßungsrate immer noch bei >10 %, während die 3-Jahres-Abstoßungsrate auf 36 % gestiegen ^ist1,2. Es fehlen jedoch wirksame prophylaktische Behandlungen für Patienten mit kardialer Allotransplantatabstoßung. Daher sind Tiermodellstudien gerechtfertigt, die die physiologischen Mechanismen aufklären, die der immunologischen und pathologischen Abstoßung von kardialen Allotransplantaten zugrunde liegen. Solche Studien würden zur Untersuchung neuer Ziele beitragen, die für die Entwicklung wirksamer Medikamente erforderlich sind, die dazu beitragen würden, die Abstoßung von Herzallotransplantaten zu verhindern und die Überlebensraten in diesen Patientenpopulationen zu verbessern.

Einige mögliche immunologische und pathophysiologische Mechanismen der kardialen Allotransplantatabstoßung wurden kürzlich in Mausmodellstudien zur heterotopen Herztransplantation vorgeschlagen ^3,4,5. Folglich wurde die heterotope Herztransplantation von Mäusen zu einem idealen präklinischen Modell, um die Mechanismen der Immunabstoßung und der pathologischen Schädigung von Herztransplantaten nach einer Herztransplantation zu untersuchen, da sie eine hohe Homologie mit menschlichen Genen aufweisen. Das vorherrschende Konzept besteht darin, eine heterotope Transplantation in einem Mausmodell durch eine abdominale Ende-zu-Ende-Anastomose in der Empfängeraorta und der unteren Hohlvene unter Verwendung von Stichen durchzuführen, die der normalen menschlichen Anatomie ähneln. Dieses Verfahren kann jedoch die Blutversorgung des Empfängers und den venösen Rückfluss des Unterkörpers beeinträchtigen⁶. Daher wird hier ein modifiziertes heterotopes Herztransplantationsverfahren in einem Mausmodell vorgeschlagen.

Das Herz des Spenders wird durch eine End-to-End-Zervixanastomose mit einer modifizierten Cuff-Technik in die Halsschlagader und die Halsvene des Empfängers implantiert. Dieses modifizierte Verfahren erleichterte die operative Durchführbarkeit und sicherte das Überleben des Herztransplantats, ohne die Blutversorgung und den venösen Rückfluss des Unterkörpers zu beeinträchtigen.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, Eight Edition, National Research Council (US) 2011 durchgeführt. Verfahren, an denen Tiere beteiligt sind, wurden vom Animal Care and Use Committee des Chongqing University Cancer Hospital, Chongqing, China, genehmigt. Männliche BALB/c- und C57BL/6-Mäuse mit einem Gewicht von 20-30 g, die aus kommerziellen Quellen stammen (siehe Materialtabelle), wurden für die allogene Herztransplantationsstudie verwendet. Die C57BL/6-Mäuse wurden als Spender und syngene Empfänger verwendet, während die BALB/c-Mäuse als allogene Empfänger dienten. Ein Schema des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.
HINWEIS: Alle während der Operation verwendeten Verbrauchsmaterialien, einschließlich chirurgischer Instrumente und Lösungen, sind steril. Der chirurgische Eingriff folgt dem Prinzip der aseptischen Operationstechnik.

1. Verfahren des Empfängers

1. Induzieren Sie eine Vollnarkose durch Inhalation von 5% Isofluran durch eine 15 x 10 x 10 cm große Induktionskammer, die mit einer Haube verbunden ist (siehe Materialtabelle).
2. Fixieren Sie die Empfängermaus mit einem Heizkissen auf dem Operationstisch. Aufrechterhaltung der Anästhesie mit kontinuierlicher Inhalation von 2% Isofluran durch eine Gesichtsmaske über Nase und Mund.
   HINWEIS: Eine langsame Atemfrequenz und ein langsamer Atemrhythmus, das Verschwinden des Hornhautreflexes und das Fehlen des Pedalreflexes in den Zehen weisen auf die Wirksamkeit der Anästhesie hin.
3. Desinfizieren Sie nach dem Rasieren der Haare den Operationsbereich mit drei abwechselnden Runden Povidon-Jod-Peeling, gefolgt von Alkohol. Dann schneiden Sie die Haut 1,5-2 cm parallel zur zervikalen Mittellinie vom rechten Unterkieferwinkel bis zum Schwanzende ein.
4. Präzieren Sie ~ 1 cm der rechten Vena jugularis extern mit einem Elektrokoagulator und einer Mikrozange. Schneiden Sie die Vene am proximalen Ende mit einer atraumatischen mikrovaskulären Klemme ab und ligieren Sie sie am distalen Ende.
5. Führen Sie das distale Ende der Vene durch eine 22 G Polyurethan-Stachelmanschette (siehe Materialtabelle) mit einem abgeschrägten Ende und oberflächlichen Rillen. Fixieren Sie die Vene mit dem Griff der Manschette mit einer mikrovaskulären Klemme.
6. Entfernen Sie das 8-0 Ligaturnaht am distalen Ende, drehen Sie das Lumen über die Manschette, die vom oberflächlichen Widerhaken eingehakt wird, auf links und fixieren Sie es mit einer 10-0-chirurgischen Naht in den Rillen der Oberfläche.
7. Sezieren Sie die rechte sublinguale Drüse, um eine Fossa für die Implantation des Herztransplantats zu bilden, und reservieren Sie den rechten Lappen der Unterkieferdrüse und den rechten Sternocleidomastoideus.
8. Präzieren Sie die rechte Arteria carotis communis für ~ 1 cm mit einer Mikrozange und schneiden Sie die Arterie mit einer atraumatischen mikrovaskulären Klemme am proximalen Ende ab. Am distalen Ende die Arterie ligieren und abschneiden.
9. Führen Sie das distale Ende der Arterie durch eine 26 G Polyurethan-Stachelmanschette (siehe Materialtabelle) mit einem abgeschrägten Ende und Rillen auf der Oberfläche. Fixieren Sie die Arterie mit dem Griff der Manschette mit einer mikrovaskulären Klemme.
10. Entfernen Sie die Ligaturnaht am distalen Ende, drehen Sie das Lumen über die Manschette und fixieren Sie es mit einem oberflächlichen Widerhaken und Rillen mit einer 10-0-Operationsnaht.
11. Nachdem Sie die Gefäße des Empfängers vorbereitet haben, lassen Sie 100 IE / ml Heparinkochsalzlösung auf die Gefäße fallen, um eine Thrombose zu verhindern. Decken Sie den zervikalen Schnitt für die anschließende Implantation mit steriler feuchter Kochsalzlösung ab.

2. Spenderverfahren

1. Verwenden Sie das gleiche Anästhesieverfahren (Schritt 1.1) für die Spendermaus.
2. Rasieren Sie die Bauchhaare mit einem Elektrorasierer und desinfizieren Sie den Operationsbereich mit drei abwechselnden Runden Povidon-Jod-Peeling, gefolgt von Alkohol.
3. Schneiden Sie den Bauch (2-3 cm) mit einer Schere entlang der Mittellinie von der Symphyse pubis bis zum Subxiphoid ein und erweitern Sie den eingeschnittenen Bereich mit einem Retraktor.
4. Sezieren Sie 1 cm der Bauchaorta und der unteren Hohlvene mit einem Elektrokoagulator und einer Mikrozange und führen Sie eine Heparinisierung durch, indem Sie 1 ml physiologische Kochsalzlösung, ergänzt mit 250 IE / ml Heparin, durch die untere Hohlvene injizieren. Danach die Bauchaorta und die untere Hohlvene herausschneiden.
5. Entfernen Sie den Thorax entlang der vorderen Achsellinie auf beiden Seiten mit einer chirurgischen Schere, um die Brustwand zu trennen. Ligate die überlegene Hohlvene mit einem 8-0 chirurgische Naht.
6. Führen Sie eine Kopfhautnadel in die suprahepatische Vena cava inferior ein. Dann injizieren Sie eiskalte physiologische Kochsalzlösung, die mit 100 IE / ml Heparin ergänzt wird, durch die Kopfhautnadel aus der suprahepatischen unteren Hohlvene, um das Spenderherz zu durchbluten, bis die Blutfarbe verblasst.
7. Perfusionieren Sie das Spenderherz erneut mit 2-3 ml eiskalter Histidin-Tryptophan-Ketoglutarat-Lösung (HTK) (siehe Materialtabelle) unter Verwendung einer Kopfhautnadel aus dem Aortenbogen, um das Spendermyokard zu schützen. Die mittlere warme Ischämiezeit beträgt 5 min.
8. Libehandeln Sie die obere und untere Hohlvene und die Lungenvene mit einer 5-0-Operationsnaht. Sezieren und schneiden Sie die Spenderaorta und die Lungenarterie vor ihrer Verzweigung ab. Danach teilen Sie die obere und untere Hohlvene und die Lungenvene, um das Herz des Spenders zu entfernen.

3. Implantation

1. Implantieren Sie das Spenderherz in umgekehrter Position in die Halstasche der Empfängermaus.
2. Ziehen Sie die Manschette mit einer umgestülpten Empfängervene in das Lumen der Spenderpulmonalarterie, um eine Ende-zu-Ende-Anastomose der Spenderpulmonalarterie zur Vena jugularis extern des Empfängers durchzuführen. Ligate die Manschette mit den Rillen auf der Oberfläche durch eine 10-0 chirurgische Naht, um die Anastomose zu fixieren.
3. Verwenden Sie ein ähnliches Verfahren für die End-to-End-Anastomose der Spenderaorta zur Empfänger-Halsschlagader.
4. Lassen Sie die atraumatische mikrovaskuläre Klemme der Halsvene los, gefolgt von der Halsschlagader, um das Herz des Spenders erneut zu perfundieren. Die mittlere kalte Ischämiezeit beträgt 15 Minuten.
5. Fixieren Sie das Herztransplantat und nähen Sie es richtig, um ein Verdrehen des Transplantats zu verhindern.
6. Verschließen Sie den zervikalen Schnitt mit kontinuierlichen Nähten unter Verwendung einer 5-0-Polyamid-Monofilamentnaht (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Entfernen Sie die Naht, nachdem die Wunde vollständig verheilt ist.
7. Bewahren Sie die Empfängermaus in einem warmen, trockenen und sauberen Käfig auf, bis sie sich von der Narkose erholt hat.
   HINWEIS: Es dauert 5-10 Minuten, um sich zu erholen.
8. Injizieren Sie Buprenorphin (0,05 mg/kg) subkutan alle 6 h für 48 h zur postoperativen Analgesie subkutan in die Empfängermaus.
   HINWEIS: Die Analgesie-Dosierung wurde für diese Studie optimiert. Das Analgesieschema kann jedoch bei Anzeichen von Schmerzen gemäß den institutionellen Tierverwendungsrichtlinien verlängert / modifiziert werden.

Ergebnisse

In diesem zervikalen heterotopen Herztransplantationsmodell der Maus betrug die Überlebensrate der Empfängermäuse etwa 95,2% (20 von 21 Mäusen überlebten). Die Haupttodesursache waren postoperative Blutungen. Der schnelle Herzschlag mit regelmäßigem Rhythmus dient als Indikator für das Überleben des implantierten Spenderherzens.

C57BL/6- und BALB/c-Mäuse waren in diesem Modell MHC (H-2b) bzw. MHC (H-2d) Typen, ^7,8. Diese beid...

Diskussion

Das Maus-Herztransplantationsmodell trägt zur Untersuchung von Abstoßungsmechanismen nach einer Herztransplantation bei und trägt zur Entwicklung einzigartiger Ansätze zur Verbesserung des Langzeitüberlebens von kardialen Allotransplantatempfängern bei. Die Herztransplantation bei Mäusen ist jedoch eine komplexe und herausfordernde Aufgabe, die ein hohes Maß an mikrochirurgischen Techniken erfordert, insbesondere bei vaskulärer Anastomose^11,12,13

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	C3090954
8-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	C2090880
10-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	G0090781
22 G polyurethane cuff	B.Braun Medical Inc.	4251628-02
26 G polyurethane cuff	Suzhou Linhua Medical Instrument Co., LTD	REF383713
Anesthesia induction chamber	RWD Life Science Co., LTD	V100
Atraumatic microvascular clamp	Beyotime	FS500
BALB/c and C57BL/6 mice (20–30 g)	Centre of Experimental Animals (Army Medical University, Chongqing, China)
Buprenorphine	US Biological life Sciences	352004
Electrocoagulator	Guangzhou Runman Medical Instrument Co., LTD	ZJ1099
Gauze	Henan piaoan group Co., LTD	10210402
Heating pad	Guangzhou Dewei Biological Technology Co., LTD	DK0032
Heparin	North China Pharmaceutical Co., LTD	2101131-2
HTK solution	Shenzhen Changyi Pharmaceutical Co., LTD	YZB/Min8263-2013
Injection syringe (10 mL)	Shandong weigao group medical polymer Co., LTD	20211001
Isoflurane	RWD Life Science Co., LTD	21070201
Physiological saline	Southwest pharmaceutical Co., LTD	H50021610
Scalp needle	Hongyu Medical Group	20183150210
Shaver	Beyotime	FS600
Small animal anesthesia machine	RWD Life Science Co., LTD	R500
Surgical operation microscope	Tiannuoxiang Scientific Instrument Co. , Ltd, Beijing, China	SZX-6745
Swab	Yubei Medical Materials Co., LTD	21080274