Fare Servikal Heterotopik Kalp Transplantasyon Modeli için Modifiye Manşet Tekniği

Özet

Bu protokolde, kardiyak allogreft rejeksiyon mekanizmasını araştırmak için bir fare kalp nakli modeli kullanılmıştır. Bu heterotopik kalp nakli modelinde, modifiye Manşet tekniği kullanılarak kalp implantasyonunun servikal uçtan uca anastomozu ile operasyon etkinliği artırılır ve kalp greftlerinin sağkalımı sağlanır.

Özet

Kardiyak allogreft rejeksiyonu, kalp nakli sonrası hastaların uzun dönem sağkalımını sınırlar. Bir fare kalp nakli modeli, insan genleri ile yüksek homolojileri nedeniyle preklinik çalışmalarda kardiyak allogreft rejeksiyonunun mekanizmasını araştırmak için idealdir. Bu anlayış, kardiyak allogreftlerle tedavi edilen hastaların uzun süreli sağkalımını iyileştirmek için benzersiz yaklaşımlar geliştirilmesine yardımcı olacaktır. Bir fare modelinde, abdominal donör kalp implantasyonu genellikle dikişler kullanılarak alıcının aortuna ve inferior vena kavasına uçtan uca bir anastomoz ile gerçekleştirilir. Bu modelde modifiye Manşet tekniği ile vericinin kalbi uçtan uca anastomoz ile alıcının karotis arterine ve juguler venine implante edilir. Transplantasyon ameliyatı dikiş atılmadan yapılır ve bu nedenle alt vücudun kan dolaşımına ve venöz reflüsüne müdahale olmadığı için alıcının sağkalımını artırabilir. Bu fare modeli, kardiyak allogreftlerin immünolojik ve patolojik (akut / kronik) reddedilmesinin altında yatan mekanizmaların araştırılmasına yardımcı olacaktır.

Giriş

Kalp nakli, terminal kalp yetmezliği için standart tedavi haline gelmiştir. Uluslararası Kalp ve Akciğer Nakli Derneği'ne kayıtlı kuruluşlarda yılda 5.500'den fazla kalp nakli yapılmaktadır. Allojenik kalp nakli alıcıları arasında 1 yıllık ret oranı halen %>10 iken, 3 yıllık ret oranı %36'ya ^{yükselmiştir1,2}. Bununla birlikte, kardiyak allogreft reddi olan hastalarda etkili profilaktik tedaviler eksiktir. Bu nedenle, kardiyak allogreftlerin immünolojik ve patolojik reddinin altında yatan fizyolojik mekanizmaları aydınlatan hayvan modeli çalışmaları gereklidir. Bu tür çalışmalar, kardiyak allogreft reddini önlemeye ve bu hasta popülasyonlarında sağkalım oranlarını iyileştirmeye yardımcı olacak etkili ilaçlar geliştirmek için gerekli yeni hedeflerin araştırılmasına katkıda bulunacaktır.

Kardiyak allogreft rejeksiyonunun bazı potansiyel immünolojik ve patofizyolojik mekanizmaları son zamanlarda heterotopik kalp transplantasyonunun fare modeli çalışmalarında önerilmiştir ^3,4,5. Sonuç olarak, fare heterotopik kalp transplantasyonu, insan genleri ile yüksek homolojisi nedeniyle kalp nakli sonrası kardiyak allogreftlerde meydana gelen immün rejeksiyon ve patolojik yaralanma mekanizmalarını araştırmak için ideal bir preklinik model haline gelmiştir. Yaygın kavram, normal insan anatomisine benzer şekilde dikişler kullanarak alıcı aort ve inferior vena kavada abdominal uçtan uca anastomoz ile bir fare modelinde heterotopik transplantasyon yapılmasıdır. Bununla birlikte, bu prosedür alıcının kan dolaşımına ve alt vücudun venöz reflüsüne müdahale edebilir⁶. Bu nedenle, burada bir fare modelinde modifiye edilmiş bir heterotopik kalp nakli prosedürü önerilmektedir.

Donörün kalbi, modifiye edilmiş bir Manşet tekniği kullanılarak uçtan uca servikal anastomoz ile alıcının karotis arteri ve juguler veni ile implante edilir. Bu modifiye prosedür operatif fizibiliteyi kolaylaştırdı ve alt vücudun kan akımına ve venöz reflüsüne müdahale etmeden kalp greftinin hayatta kalmasını sağladı.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu, Sekiz Baskı, Ulusal Araştırma Konseyi (ABD) 2011'e uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Hayvan denekleri içeren prosedürler, Chongqing Üniversitesi Kanser Hastanesi, Chongqing, Çin Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Allojenik kalp nakli çalışması için ticari kaynaklardan elde edilen 20-30 g ağırlığındaki erkek BALB/c ve C57BL/6 fareleri (bakınız Malzeme Tablosu) kullanılmıştır. C57BL / 6 fareleri donör ve sinjenik alıcı olarak kullanılırken, BALB / c fareleri allojenik alıcılar olarak görev yaptı. Protokolün şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.
NOT: Cerrahi aletler ve solüsyonlar da dahil olmak üzere ameliyat sırasında kullanılan tüm malzemeler sterildir. Cerrahi prosedür aseptik operasyon tekniği prensibine bağlıdır.

1. Alıcı prosedürü

1. Bir başlık ile bağlı 15 x 10 x 10 cm'lik bir indüksiyon odasından% 5 izofluran inhalasyonu yoluyla genel anesteziyi indükleyin (bakınız Malzeme Tablosu).
2. Alıcı fareyi ameliyat masasına bir ısıtma yastığı ile sabitleyin. Burun ve ağız üzerindeki bir yüz maskesi aracılığıyla% 2 izofluranın sürekli solunması ile anesteziyi sürdürün.
   NOT: Yavaş solunum hızı ve ritmi, kornea refleksinin kaybolması ve ayak parmaklarında pedal refleksinin olmaması anestezinin etkinliğini gösterir.
3. Saçı tıraş ettikten sonra, cerrahi bölgeyi üç alternatif tur povidon-iyot ovma ve ardından alkol ile dezenfekte edin. Daha sonra, cildi servikal orta çizgiye paralel olarak sağ mandibuler açıdan kuyruk ucuna kadar 1.5-2 cm kesin.
4. Bir elektro-koagülatör ve mikro-forseps kullanarak sağ dış juguler venin ~ 1 cm'sini diseke edin. Proksimal uçtaki damarı atravmatik bir mikrovasküler kelepçe ile klipsleyin ve distal uçta saklayın.
5. Damarın distal ucunu 22 G poliüretan dikenli manşetten (bakınız Malzeme Tablosu) konik uçlu ve yüzeysel oluklu olarak geçirin. Damarı mikrovasküler bir kelepçe kullanarak manşetin sapıyla sabitleyin.
6. 8-0'ı kaldırın Distal uçtaki ligasyon sütürü, lümeni yüzeysel diken tarafından bağlanan manşetin üzerine içten dışa çevirin ve yüzeyin oluklarına 10-0 cerrahi bir dikişle sabitleyin.
7. Kardiyak greftin implante edilmesi için bir fossa oluşturmak üzere sağ dil altı bezini rezeke edin ve submaksiller bezin sağ lobunu ve sağ sternokleidomastoidi ayırın.
8. Sağ ortak karotis arteri mikro-forseps kullanarak ~ 1 cm boyunca diseke edin ve arteri proksimal uçta atravmatik bir mikrovasküler kelepçe ile klipsleyin. Distal uçta, arteri bırakın ve kesin.
9. Arterin distal ucunu, 26 G poliüretan dikenli bir manşetten (bakınız Malzeme Tablosu) bir konik ucu ve yüzeyde oluklar ile geçirin. Arteri mikrovasküler bir kelepçe kullanarak manşetin sapıyla sabitleyin.
10. Distal uçtaki ligasyon sütürünü çıkarın, lümeni manşetin üzerinden içten dışa çevirin ve yüzeysel bir diken ve 10-0 cerrahi dikiş ile oluklarla sabitleyin.
11. Alıcının damarlarını hazırladıktan sonra, trombozu önlemek için damarlara 100 IU / mL heparin salin bırakın. Daha sonraki implantasyon için servikal insizyonu steril ıslak tuzlu gazlı bezle örtün.

2. Donör prosedürü

1. Donör fare için aynı anestezik prosedürü (adım 1.1) kullanın.
2. Karın kıllarını elektrikli bir tıraş bıçağı kullanarak tıraş edin ve cerrahi bölgeyi üç alternatif tur povidon-iyot ovma ve ardından alkol ile dezenfekte edin.
3. Karnı (2-3 cm) simfiz pubisten subksifoid'e kadar orta hat boyunca bir makasla kesin ve kesilmiş alanı bir retraktör ile genişletin.
4. Bir elektro-koagülatör ve bir mikro-forseps kullanarak abdominal aort ve inferior vena kava'nın 1 cm'sini diseke edin ve inferior vena kava yoluyla 250 IU / mL heparin ile desteklenmiş 1 mL fizyolojik salin enjekte ederek heparinizasyon gerçekleştirin. Bundan sonra, abdominal aort ve inferior vena kava'yı eksize edin.
5. Göğüs duvarını ayırmak için cerrahi bir makas kullanarak her iki taraftaki anterior aksiller çizgi boyunca toraksı eksize edin. Üstün vena kava'yı 8-0 ile ligate cerrahi dikiş.
6. Suprahepatik inferior vena kavaya bir kafa derisi iğnesi yerleştirin. Daha sonra, kan rengi solana kadar donör kalbi perfüze etmek için kafa derisi iğnesinden suprahepatik inferior vena kavadan 100 IU / mL heparin ile takviye edilmiş buz gibi soğuk fizyolojik salin enjekte edin.
7. Donör miyokardını korumak için aort arkından bir kafa derisi iğnesi kullanarak donör kalbini 2-3 mL buz gibi soğuk histidin-triptofan-ketoglutarat (HTK) çözeltisi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile yeniden perfüze edin. Ortalama sıcak iskemi süresi 5 dakikadır.
8. Süperior ve inferior vena kava ve pulmoner veni 5-0 cerrahi sütür ile bağlanın. Donör aort ve pulmoner arteri dallanmadan önce diseke edin ve kesin. Bundan sonra, donörün kalbini çıkarmak için superior ve inferior vena kava ve pulmoner veni bölün.

3. İmplantasyon

1. Donör kalbini, alıcı farenin servikal cebine ters çevrilmiş bir konumda implante edin.
2. Donör pulmoner arterin alıcı eksternal juguler venine uçtan uca anastomozunu gerçekleştirmek için manşeti everted alıcı juguler ven ile donör pulmoner arterin lümenine çekin. Anastomozu düzeltmek için yüzeydeki olukları kullanarak manşeti 10-0 cerrahi bir dikiş ile açın.
3. Donör aortun alıcı karotis artere uçtan uca anastomozu için benzer bir prosedür uygulayın.
4. Donörün kalbini yeniden perfüze etmek için juguler venin atravmatik mikrovasküler kelepçesini ve ardından karotis arteri serbest bırakın. Ortalama soğuk iskemi süresi 15 dakikadır.
5. Kalp greftini sabitleyin ve greftin bükülmesini önlemek için uygun şekilde dikin.
6. Servikal insizyonu 5-0 poliamid monofilament sütür kullanarak sürekli dikişlerle kapatın (bkz.
   NOT: Yara tamamen iyileştikten sonra dikişi alın.
7. Alıcı fareyi anesteziden kurtulana kadar sıcak, kuru ve temiz bir kafesin içinde tutun.
   NOT: İyileşmesi 5-10 dakika sürer.
8. Postoperatif analjezi için 48 saat boyunca her 6 saatte bir alıcı fareye deri altından buprenorfin (0.05 mg / kg) enjekte edin.
   NOT: Analjezi dozu bu çalışma için optimize edilmiştir. Bununla birlikte, analjezi rejimi, kurumsal hayvan kullanım kılavuzlarına uygun olarak herhangi bir ağrı belirtisi varsa uzatılabilir / değiştirilebilir.

Sonuçlar

Bu fare servikal heterotopik kalp nakli modelinde, alıcı farelerin hayatta kalma oranı yaklaşık% 95.2 idi (21 fareden 20'si hayatta kaldı). Primer ölüm nedeni postoperatif kanamaydı. Düzenli bir ritimle hızlı kalp atışı, implante edilen donör kalbin hayatta kalmasının bir göstergesi olarak hizmet eder.

C57BL/6 ve BALB/c fareler bu modelde sırasıyla ^7,8 MHC (H-2b) ve MHC (H-2d) tipleriydi. Bu iki suş, akut T-hücre...

Tartışmalar

Fare kalp nakli modeli, kalp nakli sonrası rejeksiyon mekanizmalarının araştırılmasına katkıda bulunarak, kardiyak allogreft alıcılarının uzun süreli sağkalımını iyileştirmek için benzersiz yaklaşımların geliştirilmesine katkıda bulunmaktadır. Bununla birlikte, farelerde kalp nakli, özellikle vasküler anastomozda yüksek düzeyde mikrocerrahi teknikleri gerektiren karmaşık ve zorlu bir iştir^11,12,13...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	C3090954
8-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	C2090880
10-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	G0090781
22 G polyurethane cuff	B.Braun Medical Inc.	4251628-02
26 G polyurethane cuff	Suzhou Linhua Medical Instrument Co., LTD	REF383713
Anesthesia induction chamber	RWD Life Science Co., LTD	V100
Atraumatic microvascular clamp	Beyotime	FS500
BALB/c and C57BL/6 mice (20–30 g)	Centre of Experimental Animals (Army Medical University, Chongqing, China)
Buprenorphine	US Biological life Sciences	352004
Electrocoagulator	Guangzhou Runman Medical Instrument Co., LTD	ZJ1099
Gauze	Henan piaoan group Co., LTD	10210402
Heating pad	Guangzhou Dewei Biological Technology Co., LTD	DK0032
Heparin	North China Pharmaceutical Co., LTD	2101131-2
HTK solution	Shenzhen Changyi Pharmaceutical Co., LTD	YZB/Min8263-2013
Injection syringe (10 mL)	Shandong weigao group medical polymer Co., LTD	20211001
Isoflurane	RWD Life Science Co., LTD	21070201
Physiological saline	Southwest pharmaceutical Co., LTD	H50021610
Scalp needle	Hongyu Medical Group	20183150210
Shaver	Beyotime	FS600
Small animal anesthesia machine	RWD Life Science Co., LTD	R500
Surgical operation microscope	Tiannuoxiang Scientific Instrument Co. , Ltd, Beijing, China	SZX-6745
Swab	Yubei Medical Materials Co., LTD	21080274