마우스 자궁경부 이종 심장 이식 모델을 위한 수정된 커프 기술

요약

본 프로토콜에서, 마우스 심장 이식 모델은 심장 동종이식 거부반응의 메카니즘을 조사하기 위해 사용된다. 이 이종 심장 이식 모델에서는 수술 효율이 향상되고 수정된 커프 기술을 사용하여 심장 이식의 자궁경부 종단 간 문합에 의해 심장 이식편의 생존이 보장됩니다.

초록

심장 동종이식 거부반응은 심장 이식 후 환자의 장기 생존을 제한합니다. 마우스 심장 이식 모델은 인간 유전자와의 높은 상동성 때문에 전임상 연구에서 심장 동종이식 거부 메커니즘을 조사하는 데 이상적입니다. 이러한 이해는 심장 동종이식편으로 치료받은 환자의 장기 생존을 개선하기 위한 독특한 접근 방식을 개발하는 데 도움이 될 것입니다. 마우스 모델에서 복부 기증자 심장 이식은 일반적으로 바늘을 사용하여 수혜자의 대동맥과 하대정맥에 대한 종단 간 문합으로 수행됩니다. 이 모델에서 기증자의 심장은 수정된 커프 기술에 의해 수혜자의 경동맥과 경정맥에 종단 간 문합에 의해 이식됩니다. 이식 수술은 바느질없이 시행되므로 하체의 혈액 공급 및 정맥 역류에 방해가되지 않기 때문에 수혜자의 생존율을 높일 수 있습니다. 이 마우스 모델은 심장 동종이식편의 면역학적 및 병리학적(급성/만성) 거부의 기본 메커니즘을 조사하는 데 도움이 될 것입니다.

서문

심장 이식은 말기 심부전의 표준 치료법이 되었습니다. 국제 심장 및 폐 이식 학회(International Society for Heart and Lung Transplantation)에 등록된 조직에서 연간 5,500건 이상의 심장 이식이 수행됩니다. 동종 심장 이식 수혜자 중 1년 거부율은 여전히 >10%인 반면 3년 거부율은 36%로 증가했습니다^1,2. 그러나 심장 동종이식 거부 반응이 있는 환자에 대한 효과적인 예방적 치료법은 부족합니다. 따라서 심장 동종이식편의 면역학적 및 병리학적 거부의 기초가 되는 생리학적 메커니즘을 밝히는 동물 모델 연구가 보증됩니다. 이러한 연구는 심장 동종이식 거부를 예방하고 해당 환자 집단의 생존율을 향상시키는 데 도움이 되는 효과적인 약물을 개발하는 데 필요한 새로운 표적의 조사에 기여할 것입니다.

심장 동종이식 거부반응의 일부 잠재적인 면역학적 및 병태생리학적 기전이 최근 이종성 심장 이식의 마우스 모델 연구에서 제안되었다 ^3,4,5. 결과적으로, 마우스 이종 심장 이식은 인간 유전자와의 높은 상동성으로 인해 심장 이식 후 심장 동종 이식편에서 발생하는 면역 거부 및 병리학적 손상의 메커니즘을 조사하기 위한 이상적인 전임상 모델이 되었습니다. 널리 퍼진 개념은 정상적인 인체 해부학과 유사하게 바늘을 사용하여 수혜자 대동맥과 하대정맥의 복부 종단 간 문합에 의해 마우스 모델에서 이종 이식을 수행하는 것입니다. 그러나, 이 시술은 수혜자의 혈액 공급과 하체의 정맥 역류를 방해할 수 있다⁶. 따라서, 마우스 모델에서 변형된 이질성 심장 이식 절차가 여기에서 제안된다.

기증자의 심장은 수정된 커프 기술을 사용하여 종단 간 자궁 경부 문합에 의해 수혜자의 경동맥과 경정맥에 이식됩니다. 이 수정된 절차는 수술 타당성을 촉진하고 하체의 혈액 공급 및 정맥 역류를 방해하지 않으면서 심장 이식편의 생존을 보장했습니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Eight Edition, National Research Council (US) 2011에 따라 수행되었다. 동물 대상과 관련된 절차는 중국 충칭에 있는 충칭 대학 암 병원의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 상업적 출처( 재료 표 참조)에서 얻은 체중 20-30g의 수컷 BALB/c 및 C57BL/6 마우스를 동종 심장 이식 연구에 사용했습니다. C57BL/6 마우스는 기증자 및 동종 수혜자로 사용되었고, BALB/c 마우스는 동종 수혜자로 사용되었습니다. 프로토콜의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다.
알림: 수술 기구 및 용액을 포함하여 수술 중에 사용되는 모든 소모품은 멸균 상태입니다. 수술 절차는 무균 수술 기술의 원리를 준수합니다.

1. 수취 절차

1. 후드와 연결된 15 x 10 x 10cm 유도 챔버를 통해 5% 이소플루란을 흡입 하여 전신 마취를 유도합니다( 재료 표 참조).
2. 가열 패드로 받는 사람 마우스를 수술대에 고정합니다. 코와 입에 안면 마스크를 통해 2% 이소플루란을 지속적으로 흡입하여 마취를 유지하십시오.
   참고: 느린 호흡 속도와 리듬, 각막 반사의 소실, 발가락의 페달 반사 부재는 마취의 효과를 나타냅니다.
3. 머리카락을 면도한 후 포비돈-요오드 스크럽을 세 번 번갈아 가며 알코올로 수술 부위를 소독합니다. 그런 다음 오른쪽 하악 각도에서 꼬리 끝까지 자궁 경부 정중선과 평행 한 1.5-2cm 피부를 절개합니다.
4. 전기 응고기와 마이크로 집게를 사용하여 오른쪽 외부 경정맥의 ~1cm를 해부합니다. 비외상성 미세혈관 클램프로 근위부 끝의 정맥을 자르고 말단부에서 결찰합니다.
5. 정맥의 말단부를 경사 끝과 표면 홈이 있는 22G 폴리우레탄 가시 커프( 재료 표 참조)를 통해 통과시킵니다. 미세 혈관 클램프를 사용하여 커프의 손잡이로 정맥을 고정하십시오.
6. 8-0 제거 결찰 봉합사 말단부에서 표면 미늘에 의해 걸린 커프 위로 내강을 뒤집고 표면의 홈에 10-0 수술 봉합사로 고정합니다.
7. 오른쪽 설하선을 절제하여 심장 이식편을 이식하기 위한 포사를 형성하고 상악하악선의 오른쪽 엽과 오른쪽 흉쇄유돌근을 예약합니다.
8. 미세 집게를 사용하여 ~1cm 동안 오른쪽 총경동맥을 해부하고 근위 끝에 있는 비외상성 미세혈관 클램프로 동맥을 자릅니다. 말단부에서 결찰하고 동맥을 차단합니다.
9. 표면에 경사 끝과 홈이 있는 26G 폴리우레탄 가시 커프( 재료 표 참조)를 통해 동맥의 말단부를 통과시킵니다. 미세혈관 클램프를 사용하여 커프의 손잡이로 동맥을 고정합니다.
10. 말단부에서 결찰 봉합사를 제거하고 커프 위로 내강을 뒤집은 다음 10-0 수술 봉합사로 표면 미늘과 홈으로 고정합니다.
11. 수혜자의 혈관을 준비한 후 혈전증을 예방하기 위해 혈관에 100IU/mL의 헤파린 식염수를 떨어뜨립니다. 후속 이식을 위해 멸균 된 젖은 식염수 거즈로 자궁 경부 절개를 덮으십시오.

2. 기증자 절차

1. 기증자 마우스에 대해 동일한 마취 절차(1.1단계)를 사용합니다.
2. 전기 면도기를 사용하여 복부 털을 면도하고 포비돈-요오드 스크럽을 세 번 번갈아 가며 알코올로 수술 부위를 소독합니다.
3. 치골 결합에서 자궁하 흉골까지 정중선을 따라 가위로 복부(2-3cm)를 절개하고 견인기로 절개 부위를 확장합니다.
4. 전기응고제와 미세겸자를 이용하여 복부 대동맥과 하대정맥 1cm를 절개하고, 헤파린 250IU/mL가 보충된 생리식염수 1mL를 하대정맥을 통해 주입하여 헤파린을 시행합니다. 그 후, 복부 대동맥과 하대정맥을 절제하십시오.
5. 흉벽을 분리하기 위해 수술용 가위를 사용하여 양쪽의 전방 겨드랑이 라인을 따라 흉부를 절제합니다. 8-0으로 우수한 대정맥을 합치십시오. 외과 봉합사.
6. 간상부 하대정맥에 두피 바늘을 삽입합니다. 그런 다음 간상하 대정맥에서 두피 바늘을 통해 100IU/mL의 헤파린이 보충된 얼음처럼 차가운 생리 식염수를 주입하여 혈액색이 바래질 때까지 기증자의 심장을 관류합니다.
7. 기증자 심근을 보호하기 위해 대동맥궁의 두피 바늘을 사용하여 2-3mL의 얼음처럼 차가운 히스티딘-트립토판-케토글루타레이트(HTK) 용액( 재료 표 참조)으로 기증자 심장을 다시 관류합니다. 평균 온난 허혈 시간은 5분입니다.
8. 상대정맥과 하대정맥을 5-0 수술 봉합사로 유자합니다. 기증자 대동맥과 폐동맥을 분지하기 전에 해부하고 잘라냅니다. 그 후, 상대정맥과 하대정맥과 폐정맥을 나누어 기증자의 심장을 제거합니다.

3. 이식

1. 기증자 심장을 거꾸로 된 위치에서 수혜자 마우스의 자궁 경부 주머니에 이식합니다.
2. 전향된 수혜자 경정맥이 있는 커프를 기증자 폐동맥의 내강으로 당겨 수혜자 외부 경정맥에 대한 기증자 폐동맥의 종단 간 문합을 수행합니다. 문합을 고정하기 위해 10-0 수술 봉합사를 통해 표면의 홈을 사용하여 커프를 결속시킵니다.
3. 수혜자 경동맥에 대한 기증자 대동맥의 종단 간 문합을 위해 유사한 절차를 사용합니다.
4. 경정맥의 비외상성 미세혈관 클램프를 풀고 경동맥을 풀어 기증자의 심장을 다시 관류합니다. 평균 한랭 허혈 시간은 15분입니다.
5. 심장 이식편을 고정하고 이식편이 비틀어지지 않도록 적절하게 봉합하십시오.
6. 5-0 폴리아미드 모노필라멘트 봉합사를 사용하여 연속 봉합사로 자궁경부 절개를 봉합합니다( 재료 표 참조).
   알림: 상처가 완전히 치유된 후 봉합사를 제거합니다.
7. 수용자 마우스를 마취에서 회복될 때까지 따뜻하고 건조하며 깨끗한 케이지 안에 보관하십시오.
   알림: 복구하는 데 5-10분이 걸립니다.
8. 부프레노르핀(0.05 mg/kg)을 수술 후 진통을 위해 48시간 동안 6시간마다 수용자 마우스에 피하 주사합니다.
   참고: 진통 용량은 이 연구에 최적화되었습니다. 그러나 진통 요법은 기관 동물 사용 지침에 따라 통증의 징후가 있는 경우 연장/수정될 수 있습니다.

결과

이 마우스 자궁 경부 이종 심장 이식 모델에서, 수용 마우스의 생존율은 대략 95.2%였다 (21마리의 마우스 중 20마리가 생존하였다). 주요 사망 원인은 수술 후 출혈이었다. 규칙적인 리듬의 빠른 심장 박동은 이식 된 기증자 심장의 생존을 나타내는 지표 역할을합니다.

C57BL/6 및 BALB/c 마우스는 이 모델에서 각각 MHC(H-2b) 및 MHC(H-2d) 유형이었습니다 ^7,8

토론

마우스 심장 이식 모델은 심장 이식 후 거부 메커니즘 조사에 기여하여 심장 동종 이식 수혜자의 장기 생존을 개선하기 위한 독특한 접근 방식의 개발에 기여합니다. 그러나, 생쥐에서의 심장 이식은 복잡하고 도전적인 작업이며, 특히 혈관 문합에서 높은 수준의 미세 수술 기술을 필요로 한다^11,12,13. 마우스 복부 이종 심장 이...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	C3090954
8-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	C2090880
10-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	G0090781
22 G polyurethane cuff	B.Braun Medical Inc.	4251628-02
26 G polyurethane cuff	Suzhou Linhua Medical Instrument Co., LTD	REF383713
Anesthesia induction chamber	RWD Life Science Co., LTD	V100
Atraumatic microvascular clamp	Beyotime	FS500
BALB/c and C57BL/6 mice (20–30 g)	Centre of Experimental Animals (Army Medical University, Chongqing, China)
Buprenorphine	US Biological life Sciences	352004
Electrocoagulator	Guangzhou Runman Medical Instrument Co., LTD	ZJ1099
Gauze	Henan piaoan group Co., LTD	10210402
Heating pad	Guangzhou Dewei Biological Technology Co., LTD	DK0032
Heparin	North China Pharmaceutical Co., LTD	2101131-2
HTK solution	Shenzhen Changyi Pharmaceutical Co., LTD	YZB/Min8263-2013
Injection syringe (10 mL)	Shandong weigao group medical polymer Co., LTD	20211001
Isoflurane	RWD Life Science Co., LTD	21070201
Physiological saline	Southwest pharmaceutical Co., LTD	H50021610
Scalp needle	Hongyu Medical Group	20183150210
Shaver	Beyotime	FS600
Small animal anesthesia machine	RWD Life Science Co., LTD	R500
Surgical operation microscope	Tiannuoxiang Scientific Instrument Co. , Ltd, Beijing, China	SZX-6745
Swab	Yubei Medical Materials Co., LTD	21080274