Une technique de brassard modifiée pour un modèle de transplantation cardiaque hétérotopique cervicale de souris

Résumé

Dans le présent protocole, un modèle de transplantation cardiaque de souris est utilisé pour étudier le mécanisme du rejet de l’allogreffe cardiaque. Dans ce modèle de transplantation cardiaque hétérotopique, l’efficacité de l’opération est améliorée et la survie des greffons cardiaques est assurée par une anastomose cervicale de bout en bout de l’implantation cardiaque à l’aide d’une technique de brassard modifiée.

Résumé

Le rejet d’allogreffe cardiaque limite la survie à long terme des patients après une transplantation cardiaque. Un modèle de transplantation cardiaque de souris est idéal pour étudier le mécanisme du rejet d’allogreffe cardiaque dans les études précliniques en raison de leur homologie élevée avec les gènes humains. Cette compréhension aiderait à développer des approches uniques pour améliorer la survie à long terme des patients traités par allogreffes cardiaques. Dans un modèle murin, l’implantation du cœur du donneur abdominal est généralement réalisée avec une anastomose de bout en bout de l’aorte du receveur et de la veine cave inférieure à l’aide de points de suture. Dans ce modèle, le cœur du donneur est implanté par anastomose de bout en bout à l’artère carotide et à la veine jugulaire du receveur par la technique du brassard modifié. La chirurgie de transplantation est réalisée sans point de suture et peut donc augmenter la survie du receveur car il n’y a pas d’interférence avec l’apport sanguin et le reflux veineux du bas du corps. Ce modèle murin aiderait à étudier les mécanismes sous-jacents au rejet immunologique et pathologique (aigu/chronique) des allogreffes cardiaques.

Introduction

La transplantation cardiaque est devenue le traitement standard de l’insuffisance cardiaque terminale. Plus de 5 500 transplantations cardiaques par an sont effectuées dans les organisations enregistrées auprès de l’International Society for Heart and Lung Transplantation. Parmi les receveurs allogéniques de transplantation cardiaque, le taux de rejet à 1 an est toujours de >10 %, tandis que le taux de rejet à 3 ans est passé à 36 %^1,2. Cependant, les traitements prophylactiques efficaces pour les patients présentant un rejet d’allogreffe cardiaque font défaut. Par conséquent, des études sur des modèles animaux sont justifiées pour élucider les mécanismes physiologiques sous-jacents au rejet immunologique et pathologique des allogreffes cardiaques. De telles études contribueraient à la recherche de nouvelles cibles nécessaires pour développer des médicaments efficaces, ce qui aiderait à prévenir le rejet d’allogreffe cardiaque et à améliorer les taux de survie dans ces populations de patients.

Certains mécanismes immunologiques et physiopathologiques potentiels du rejet d’allogreffe cardiaque ont été proposés récemment dans des études sur des modèles murins de transplantation cardiaque hétérotopique ^3,4,5. Par conséquent, la transplantation cardiaque hétérotopique de souris est devenue un modèle préclinique idéal pour étudier les mécanismes de rejet immunitaire et de lésion pathologique survenant dans les allogreffes cardiaques après transplantation cardiaque en raison de leur forte homologie avec les gènes humains. Le concept courant est d’effectuer une transplantation hétérotopique dans un modèle murin par une anastomose abdominale de bout en bout dans l’aorte receveuse et la veine cave inférieure à l’aide de points de suture, similaire à l’anatomie humaine normale. Cependant, cette procédure peut interférer avec l’approvisionnement en sang du receveur et le reflux veineux du bas du corps⁶. Par conséquent, une procédure de transplantation cardiaque hétérotopique modifiée dans un modèle murin est proposée ici.

Le cœur du donneur est implanté avec l’artère carotide et la veine jugulaire du receveur par une anastomose cervicale de bout en bout à l’aide d’une technique de brassard modifiée. Cette procédure modifiée a facilité la faisabilité opératoire et assuré la survie du greffon cardiaque sans interférer avec l’apport sanguin et le reflux veineux du bas du corps.

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Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, huitième édition, National Research Council (US) 2011. Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’hôpital de cancérologie de l’Université de Chongqing, à Chongqing, en Chine. Des souris mâles BALB/c et C57BL/6 pesant de 20 à 30 g, obtenues de sources commerciales (voir le tableau des matériaux), ont été utilisées pour une étude allogénique de transplantation cardiaque. Les souris C57BL/6 ont été utilisées comme donneurs et receveurs syngéniques, tandis que les souris BALB/c ont servi de receveurs allogéniques. Un schéma du protocole est illustré à la figure 1.
REMARQUE: Toutes les fournitures utilisées pendant la chirurgie, y compris les instruments et solutions chirurgicales, sont stériles. L’intervention chirurgicale adhère au principe de la technique d’opération aseptique.

1. Procédure du destinataire

1. Induire une anesthésie générale par inhalation d’isoflurane à 5 % à travers une chambre d’induction de 15 x 10 x 10 cm reliée à une hotte (voir le tableau des matériaux).
2. Fixez la souris réceptrice sur la table d’opération à l’aide d’un coussin chauffant. Maintenir l’anesthésie par inhalation continue d’isoflurane à 2% à l’aide d’un masque facial sur le nez et la bouche.
   REMARQUE: La lenteur de la fréquence et du rythme respiratoires, la disparition du réflexe cornéen et l’absence du réflexe de pédale dans les orteils indiquent l’efficacité de l’anesthésie.
3. Après avoir rasé les cheveux, désinfectez la zone chirurgicale avec trois cycles alternés de gommage povidone iodée suivis d’alcool. Ensuite, inciser la peau de 1,5 à 2 cm parallèlement à la ligne médiane cervicale de l’angle mandibulaire droit à l’extrémité de la queue.
4. Disséquer ~1 cm de la veine jugulaire externe droite à l’aide d’un électro-coagulateur et de micro-pinces. Coupez la veine à l’extrémité proximale avec une pince microvasculaire atraumatique et ligaturez-la à l’extrémité distale.
5. Passez l’extrémité distale de la veine à travers un brassard barbelé en polyuréthane de 22 G (voir Tableau des matériaux) avec une extrémité conique et des rainures superficielles. Fixez la veine avec la poignée du brassard à l’aide d’une pince microvasculaire.
6. Supprimer le 8-0 Suture de ligature à l’extrémité distale, tournez la lumière sur le brassard accroché par la barbe superficielle à l’envers et fixez avec une suture chirurgicale 10-0 dans les rainures de la surface.
7. Réséquez la glande sublinguale droite pour former une fosse pour implanter le greffon cardiaque et réservez le lobe droit de la glande sous-maxillaire et le sternocléidomastoïdien droit.
8. Disséquer l’artère carotide commune droite sur ~1 cm à l’aide de micro-pinces et couper l’artère avec une pince microvasculaire atraumatique à l’extrémité proximale. À l’extrémité distale, ligaturer et couper l’artère.
9. Passez l’extrémité distale de l’artère à travers un brassard barbelé en polyuréthane de 26 G (voir Tableau des matériaux) avec une extrémité conique et des rainures sur la surface. Fixez l’artère avec la poignée du brassard à l’aide d’une pince microvasculaire.
10. Retirez la suture de ligature à l’extrémité distale, tournez la lumière à l’envers sur le brassard et fixez avec une barbe superficielle et des rainures avec une suture chirurgicale 10-0.
11. Après avoir préparé les vaisseaux du receveur, déposer 100 UI/mL de solution saline d’héparine sur les vaisseaux pour prévenir la thrombose. Couvrir l’incision cervicale avec de la gaze saline humide stérile pour une implantation ultérieure.

2. Procédure de donneur

1. Utilisez la même procédure anesthésique (étape 1.1) pour la souris donneuse.
2. Rasez les poils abdominaux à l’aide d’un rasoir électrique et désinfectez la zone chirurgicale avec trois cycles alternés de gommage povidone iodée suivis d’alcool.
3. Inciser l’abdomen (2-3 cm) avec un ciseau le long de la ligne médiane de la symphyse pubienne au sous-xiphoïde, et élargir la zone incisée avec un rétracteur.
4. Disséquer 1 cm de l’aorte abdominale et de la veine cave inférieure à l’aide d’un électrocoagulateur et d’une micro-pince, et effectuer l’héparinisation en injectant 1 mL de solution saline physiologique additionnée de 250 UI/mL d’héparine à travers la veine cave inférieure. Après cela, excisez l’aorte abdominale et la veine cave inférieure.
5. Extrayez le thorax le long de la ligne axillaire antérieure des deux côtés à l’aide d’un ciseau chirurgical pour séparer la paroi thoracique. Ligate la veine cave supérieure avec un 8-0 suture chirurgicale.
6. Insérez une aiguille du cuir chevelu au niveau de la veine cave inférieure suprahépatique. Ensuite, injectez une solution saline physiologique glacée supplémentée de 100 UI / mL d’héparine à travers l’aiguille du cuir chevelu de la veine cave inférieure suprahépatique pour perfuser le cœur du donneur jusqu’à ce que la couleur du sang s’estompe.
7. Reperfuser le cœur du donneur avec 2 à 3 mL de solution glacée d’histidine-tryptophane-cétoglutarate (HTK) (voir le tableau des matières) à l’aide d’une aiguille du cuir chevelu de l’arc aortique pour protéger le myocarde du donneur. Le temps moyen d’ischémie chaude est de 5 min.
8. Liligez la veine cave supérieure et inférieure et la veine pulmonaire avec une suture chirurgicale 5-0. Disséquer et couper l’aorte donneuse et l’artère pulmonaire avant leur ramification. Après cela, divisez la veine cave supérieure et inférieure et la veine pulmonaire pour retirer le cœur du donneur.

3. Implantation

1. Implantez le cœur du donneur dans la poche cervicale de la souris receveuse en position inversée.
2. Tirez le brassard avec une veine jugulaire receveuse éversée dans la lumière de l’artère pulmonaire donneuse pour effectuer une anastomose de bout en bout de l’artère pulmonaire donneuse à la veine jugulaire externe du receveur. Libellez le brassard en utilisant les rainures sur la surface à travers une suture chirurgicale 10-0 pour fixer l’anastomose.
3. Utiliser une procédure similaire pour l’anastomose de bout en bout de l’aorte donneuse à l’artère carotide receveuse.
4. Relâchez la pince microvasculaire atraumatique de la veine jugulaire suivie de l’artère carotide pour re-perfuser le cœur du donneur. Le temps moyen d’ischémie froide est de 15 min.
5. Fixez la greffe cardiaque et suturez-la correctement pour éviter la torsion de la greffe.
6. Fermer l’incision cervicale avec des sutures continues à l’aide d’une suture monofilament en polyamide 5-0 (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE: Retirez la suture une fois la plaie complètement guérie.
7. Gardez la souris receveuse dans une cage chaude, sèche et propre jusqu’à ce qu’elle se rétablisse de l’anesthésie.
   REMARQUE: Il faut 5-10 min pour récupérer.
8. Injecter de la buprénorphine (0,05 mg/kg) par voie sous-cutanée à la souris receveuse toutes les 6 heures pendant 48 h pour l’analgésie postopératoire.
   REMARQUE: La posologie de l’analgésie a été optimisée pour cette étude. Cependant, le régime analgésique peut être prolongé ou modifié s’il y a des signes de douleur conformément aux lignes directrices de l’établissement sur l’utilisation des animaux.

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Résultats

Dans ce modèle de transplantation cardiaque hétérotopique cervicale de souris, le taux de survie des souris receveuses était d’environ 95,2% (20 souris sur 21 ont survécu). La principale cause de décès était une hémorragie postopératoire. Le rythme cardiaque rapide avec un rythme régulier sert d’indicateur de la survie du cœur du donneur implanté.

Les souris C57BL/6 et BALB/c étaient de type MHC (H-2b) et MHC (H-2d) dans ce modèle, respectivement

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Discussion

Le modèle de transplantation cardiaque de souris contribue à l’étude des mécanismes de rejet après une transplantation cardiaque, contribuant ainsi au développement d’approches uniques pour améliorer la survie à long terme des receveurs d’allogreffe cardiaque. Cependant, la transplantation cardiaque chez la souris est une tâche complexe et difficile, nécessitant un haut niveau de techniques de microchirurgie, en particulier dans l’anastomose vasculaire^11,12,13

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	C3090954
8-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	C2090880
10-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	G0090781
22 G polyurethane cuff	B.Braun Medical Inc.	4251628-02
26 G polyurethane cuff	Suzhou Linhua Medical Instrument Co., LTD	REF383713
Anesthesia induction chamber	RWD Life Science Co., LTD	V100
Atraumatic microvascular clamp	Beyotime	FS500
BALB/c and C57BL/6 mice (20–30 g)	Centre of Experimental Animals (Army Medical University, Chongqing, China)
Buprenorphine	US Biological life Sciences	352004
Electrocoagulator	Guangzhou Runman Medical Instrument Co., LTD	ZJ1099
Gauze	Henan piaoan group Co., LTD	10210402
Heating pad	Guangzhou Dewei Biological Technology Co., LTD	DK0032
Heparin	North China Pharmaceutical Co., LTD	2101131-2
HTK solution	Shenzhen Changyi Pharmaceutical Co., LTD	YZB/Min8263-2013
Injection syringe (10 mL)	Shandong weigao group medical polymer Co., LTD	20211001
Isoflurane	RWD Life Science Co., LTD	21070201
Physiological saline	Southwest pharmaceutical Co., LTD	H50021610
Scalp needle	Hongyu Medical Group	20183150210
Shaver	Beyotime	FS600
Small animal anesthesia machine	RWD Life Science Co., LTD	R500
Surgical operation microscope	Tiannuoxiang Scientific Instrument Co. , Ltd, Beijing, China	SZX-6745
Swab	Yubei Medical Materials Co., LTD	21080274