Técnica de Cuff Modificada para Modelo de Transplante Cardíaco Heterotópico Cervical:

Resumo

No presente protocolo, um modelo de transplante cardíaco em camundongos é utilizado para investigar o mecanismo de rejeição do enxerto cardíaco. Neste modelo heterotópico de transplante cardíaco, a eficiência da operação é melhorada, e a sobrevida dos enxertos cardíacos é garantida por uma anastomose cervical término-terminal do implante cardíaco usando uma técnica de Cuff modificada.

Resumo

A rejeição do enxerto cardíaco limita a sobrevida em longo prazo dos pacientes após o transplante cardíaco. Um modelo de transplante cardíaco em camundongos é ideal para investigar o mecanismo de rejeição do aloenxerto cardíaco em estudos pré-clínicos devido à sua alta homologia com genes humanos. Esse entendimento ajudaria a desenvolver abordagens únicas para melhorar a sobrevida em longo prazo dos pacientes tratados com aloenxertos cardíacos. Em um modelo de camundongo, o implante de coração de doador abdominal é comumente realizado com anastomose término-terminal à aorta e veia cava inferior do receptor por meio de pontos. Nesse modelo, o coração do doador é implantado por anastomose término-terminal com a artéria carótida e veia jugular do receptor pela técnica de Cuff modificado. A cirurgia de transplante é realizada sem costura e, assim, pode aumentar a sobrevida do receptor, uma vez que não há interferência no suprimento sanguíneo e refluxo venoso da parte inferior do corpo. Este modelo murino ajudaria a investigar os mecanismos subjacentes à rejeição imunológica e patológica (aguda/crônica) de aloenxertos cardíacos.

Introdução

O transplante cardíaco tornou-se o tratamento padrão para a insuficiência cardíaca terminal. Mais de 5.500 transplantes cardíacos por ano são realizados nas organizações registradas na Sociedade Internacional de Transplante de Coração e Pulmão. Entre os receptores de transplante cardíaco alogênico, a taxa de rejeição em 1 ano ainda é de >10%, enquanto a taxa de rejeição em 3 anos aumentou para 36%^1,2. No entanto, faltam tratamentos profiláticos efetivos para pacientes com rejeição do enxerto cardíaco. Portanto, estudos em modelos animais são necessários para elucidar os mecanismos fisiológicos subjacentes à rejeição imunológica e patológica de aloenxertos cardíacos. Tais estudos contribuiriam para a investigação de novos alvos necessários para o desenvolvimento de drogas eficazes, o que ajudaria a prevenir a rejeição do aloenxerto cardíaco e melhoraria as taxas de sobrevida nessas populações de pacientes.

Alguns potenciais mecanismos imunológicos e fisiopatológicos de rejeição do enxerto cardíaco têm sido propostos recentemente em modelos murinos de transplante cardíaco heterotópico3,4,5. Consequentemente, o transplante cardíaco heterotópico de camundongos tornou-se um modelo pré-clínico ideal para investigar os mecanismos de rejeição imune e lesão patológica que ocorrem em aloenxertos cardíacos após o transplante cardíaco devido à sua alta homologia com genes humanos. O conceito prevalente é a realização de transplante heterotópico em modelo murino por anastomose abdominal término-terminal na aorta receptora e veia cava inferior com pontos, semelhante à anatomia humana normal. Entretanto, esse procedimento pode interferir no suprimento sanguíneo do receptor e no refluxo venoso da parte inferior do corpo⁶. Portanto, um procedimento de transplante cardíaco heterotópico modificado em um modelo de camundongo é proposto aqui.

O coração do doador é implantado com a artéria carótida e veia jugular do receptor por meio de anastomose cervical término-terminal com a técnica de Cuff modificada. Esse procedimento modificado facilitou a viabilidade operatória e garantiu a sobrevida do enxerto cardíaco sem interferir no suprimento sanguíneo e no refluxo venoso da parte inferior do corpo.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Eight Edition, National Research Council (US) 2011. Os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Hospital do Câncer da Universidade de Chongqing, Chongqing, China. Camundongos BALB/c e C57BL/6 machos, pesando 20-30 g, obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais), foram usados para o estudo do transplante cardíaco alogênico. Os camundongos C57BL/6 foram utilizados como doadores e receptores singênicos, enquanto os camundongos BALB/c serviram como receptores alogênicos. Um esquema do protocolo é mostrado na Figura 1.
NOTA: Todos os suprimentos utilizados durante a cirurgia, incluindo instrumentos e soluções cirúrgicas, são estéreis. O procedimento cirúrgico adere ao princípio da técnica de operação asséptica.

1. Procedimento do destinatário

1. Induzir anestesia geral através da inalação de isoflurano a 5% através de uma câmara de indução de 15 x 10 x 10 cm conectada a um capuz (ver Tabela de Materiais).
2. Fixe o mouse do destinatário na mesa de operação com uma almofada de aquecimento. Manter a anestesia com inalação contínua de isoflurano a 2% através de uma máscara facial sobre o nariz e a boca.
   NOTA: A frequência e o ritmo respiratórios lentos, o desaparecimento do reflexo corneano e a ausência do reflexo pedal nos pododáctilos indicam a eficácia da anestesia.
3. Após raspar os cabelos, desinfetar a área cirúrgica com três rodadas alternadas de esfoliação iodopovidona, seguidas de álcool. Em seguida, incisar a pele 1,5-2 cm paralela à linha média cervical do ângulo mandibular direito até a extremidade caudal.
4. Dissecção ~1 cm da veia jugular externa direita com eletrocoagulador e micropinça. Prender a veia na extremidade proximal com uma pinça microvascular atraumática e ligá-la na extremidade distal.
5. Passe a extremidade distal da veia através de um manguito farpado de poliuretano 22 G (ver Tabela de Materiais) com uma extremidade chanfrada e sulcos superficiais. Fixe a veia com a alça do manguito usando uma pinça microvascular.
6. Remover o 8-0 sutura de ligadura na extremidade distal, vire o lúmen sobre o manguito preso pela farpa superficial de dentro para fora e fixe com sutura cirúrgica 10-0 nos sulcos da superfície.
7. Ressecção da glândula sublingual direita para formação de fossa para implante do enxerto cardíaco, reservando o lobo direito da glândula submaxilar e o esternocleidomastoideo direito.
8. Dissecar a artéria carótida comum direita por ~1 cm usando micropinças e clipar a artéria com uma pinça microvascular atraumática na extremidade proximal. Na extremidade distal, ligadura e corta a artéria.
9. Passe a extremidade distal da artéria através de um manguito farpado de poliuretano 26 G (ver Tabela de Materiais) com uma extremidade chanfrada e sulcos na superfície. Fixar a artéria com a alça do manguito usando uma pinça microvascular.
10. Remova a sutura da ligadura na extremidade distal, vire a luz do avesso sobre o manguito e fixe com uma farpa superficial e sulcos com uma sutura cirúrgica 10-0.
11. Após o preparo dos vasos do receptor, lançar 100 UI/mL de solução salina de heparina sobre os vasos para evitar trombose. Cobrir a incisão cervical com gaze salina úmida estéril para posterior implante.

2. Procedimento do doador

1. Empregar o mesmo procedimento anestésico (passo 1.1) para o camundongo doador.
2. Raspar os cabelos abdominais usando uma navalha elétrica e desinfetar a área cirúrgica com três rodadas alternadas de esfoliação com iodopovidona seguidas de álcool.
3. Incise o abdome (2-3 cm) com uma tesoura ao longo da linha média, desde a sínfise púbica até o subxifóide, e expanda a área incisada com um afastador.
4. Dissecar 1 cm da aorta abdominal e veia cava inferior com eletrocoagulador e micropinça e heparinizar injetando-se 1 mL de soro fisiológico suplementado com 250 UI/mL de heparina pela veia cava inferior. Depois disso, excisar a aorta abdominal e veia cava inferior.
5. Excisar o tórax ao longo da linha axilar anterior em ambos os lados usando uma tesoura cirúrgica para separar a parede torácica. Ligate a veia cava superior com um 8-0 sutura cirúrgica.
6. Inserir uma agulha de couro cabeludo na veia cava inferior supra-hepática. Em seguida, injetar soro fisiológico gelado suplementado com 100 UI/mL de heparina através da agulha do couro cabeludo da veia cava inferior supra-hepática para perfundir o coração do doador até que a cor do sangue desapareça.
7. Reperfundir o coração do doador com 2-3 mL de solução gelada de histidina-triptofano-cetoglutarato (HTK) (ver Tabela de Materiais) usando uma agulha de couro cabeludo do arco aórtico para proteger o miocárdio do doador. O tempo médio de isquemia quente é de 5 min.
8. Acoplar as veias cavas superior e inferior e a veia pulmonar com sutura cirúrgica 5-0. Dissecar e cortar a aorta doadora e a artéria pulmonar antes de sua ramificação. Em seguida, divida a veia cava superior e inferior e a veia pulmonar para retirar o coração do doador.

3. Implantação

1. Implante o coração doador na bolsa cervical do camundongo receptor em posição invertida.
2. Puxar o manguito com uma veia jugular receptora evertida para dentro da luz da artéria pulmonar doadora para realizar a anastomose término-terminal da artéria pulmonar doadora com a veia jugular externa receptora. Ligate o manguito usando os sulcos na superfície através de uma sutura cirúrgica 10-0 para fixar a anastomose.
3. Empregar procedimento semelhante para anastomose término-terminal da aorta doadora com a artéria carótida receptora.
4. Solte a pinça microvascular atraumática da veia jugular seguida da artéria carótida para reperfundir o coração do doador. O tempo médio de isquemia fria é de 15 min.
5. Fixar o enxerto cardíaco e suturá-lo adequadamente para evitar a torção do enxerto.
6. Fechar a incisão cervical com suturas contínuas com fio monofilamentar de poliamida 5-0 (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Remova a sutura após a cicatrização completa da ferida.
7. Mantenha o rato receptor dentro de uma gaiola quente, seca e limpa até que se recupere da anestesia.
   NOTA: Leva 5-10 minutos para recuperar.
8. Injetar buprenorfina (0,05 mg/kg) por via subcutânea no camundongo receptor a cada 6 h por 48 h para analgesia pós-operatória.
   OBS: A dose de analgesia foi otimizada para este estudo. No entanto, o regime de analgesia pode ser estendido/modificado se houver qualquer sinal de dor, de acordo com as diretrizes institucionais de uso de animais.

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Resultados

Neste modelo de transplante cardíaco heterotópico cervical em camundongos, a taxa de sobrevivência dos camundongos receptores foi de aproximadamente 95,2% (20 dos 21 camundongos sobreviveram). A principal causa de óbito foi sangramento pós-operatório. O batimento cardíaco acelerado com ritmo regular serve como indicador da sobrevida do coração doador implantado.

Camundongos C57BL/6 e BALB/c foram do tipo MHC (H-2b) e MHC (H-2d) nesse modelo, respectivamente

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Discussão

O modelo de transplante cardíaco em camundongos contribui para a investigação dos mecanismos de rejeição após o transplante cardíaco, contribuindo para o desenvolvimento de abordagens únicas para melhorar a sobrevida em longo prazo de receptores de aloenxerto cardíaco. Entretanto, o transplante cardíaco em camundongos é uma tarefa complexa e desafiadora, exigindo alto nível de técnicas de microcirurgia, principalmente em anastomoses^{vasculares11,12,13}...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	C3090954
8-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	C2090880
10-0 Polyamide Monofilament suture	B.Braun Medical Inc.	G0090781
22 G polyurethane cuff	B.Braun Medical Inc.	4251628-02
26 G polyurethane cuff	Suzhou Linhua Medical Instrument Co., LTD	REF383713
Anesthesia induction chamber	RWD Life Science Co., LTD	V100
Atraumatic microvascular clamp	Beyotime	FS500
BALB/c and C57BL/6 mice (20–30 g)	Centre of Experimental Animals (Army Medical University, Chongqing, China)
Buprenorphine	US Biological life Sciences	352004
Electrocoagulator	Guangzhou Runman Medical Instrument Co., LTD	ZJ1099
Gauze	Henan piaoan group Co., LTD	10210402
Heating pad	Guangzhou Dewei Biological Technology Co., LTD	DK0032
Heparin	North China Pharmaceutical Co., LTD	2101131-2
HTK solution	Shenzhen Changyi Pharmaceutical Co., LTD	YZB/Min8263-2013
Injection syringe (10 mL)	Shandong weigao group medical polymer Co., LTD	20211001
Isoflurane	RWD Life Science Co., LTD	21070201
Physiological saline	Southwest pharmaceutical Co., LTD	H50021610
Scalp needle	Hongyu Medical Group	20183150210
Shaver	Beyotime	FS600
Small animal anesthesia machine	RWD Life Science Co., LTD	R500
Surgical operation microscope	Tiannuoxiang Scientific Instrument Co. , Ltd, Beijing, China	SZX-6745
Swab	Yubei Medical Materials Co., LTD	21080274