Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול מתאר ביוריאקטור התומך בהדמיה המאפשר הסרה סלקטיבית של האפיתל האנדוגני מקנה הנשימה של החולדה והתפלגות הומוגנית של תאים אקסוגניים על פני השטח של לומן, ולאחר מכן תרבית חוץ גופית ארוכת טווח של מבנה רקמת התא.

Abstract

פגיעה חוזרת ונשנית ברקמת דרכי הנשימה עלולה לפגוע בתפקוד הריאות ולגרום למחלות ריאה כרוניות, כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית. ההתקדמות ברפואה רגנרטיבית ובטכנולוגיות ביוריאקטורים מציעה הזדמנויות לייצר מבני רקמות ואיברים פונקציונליים שגודלו במעבדה, שניתן להשתמש בהם כדי לסנן תרופות, למדל מחלות ולהנדס תחליפי רקמות. כאן מתוארת ביוריאקטור ממוזער בשילוב עם שיטת הדמיה המאפשרת הדמיה באתרה של הלומן הפנימי של קנה הנשימה של חולדה מוסברת במהלך מניפולציה של רקמת מבחנה ותרבית. באמצעות ביוריאקטור זה, הפרוטוקול מדגים הסרה סלקטיבית מונחית הדמיה של רכיבים תאיים אנדוגניים תוך שמירה על התכונות הביוכימיות הפנימיות ומבנה האולטרה-מבנה של מטריצת רקמת דרכי הנשימה. יתר על כן, ההעברה, ההתפלגות האחידה והתרבית הממושכת שלאחר מכן של תאים אקסוגניים על לומן דרכי הנשימה נטולי התאים עם ניטור אופטי באתרו מוצגים. התוצאות מדגישות כי ניתן להשתמש בביוריאקטור מונחה ההדמיה כדי להקל על יצירת רקמות אוויריות פונקציונליות במבחנה .

Introduction

המשטח הלומינלי של דרכי הנשימה מרופד בשכבה של אפיתל המורכבת בעיקר מתאי גזע רב-ציליתיים, קלאב, גביעובזלתיים 1,2. שכבת האפיתל משמשת כמנגנון הגנה עיקרי של הריאה, ופועלת כמחסום ביופיזי המגן על רקמת דרכי הנשימה הבסיסית מפני פתוגנים, חלקיקים או גזים כימיים בשאיפה. הוא מגן על רקמת דרכי הנשימה באמצעות מנגנונים מרובים, כולל היווצרות צמתים הדוקים בין-תאיים, פינוי רירית, והפרשת מיקרוביאלית ונוגדת חמצון 3,4. אפיתל דרכי הנשימה הפגום קשור למחלות נשימה הרסניות, כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD)5, דיסקינזיה סילארית ראשונית (PCD)6, וסיסטיק פיברוזיס (CF)7.

ההתקדמות בטכנולוגיית ריאה על שבב (LOC) מייצגת הזדמנות לחקור את התפתחות הריאות האנושיות, למדל מחלות ריאה שונות ולפתח חומרים טיפוליים חדשים בסביבות במבחנה המווסתות היטב. לדוגמה, אפיתל דרכי הנשימה והאנדותל יכולים להיות תרבית בצדדים מנוגדים של קרום דק ונקבובי כדי לחקות את הגז המחליף רקמת ריאה, מה שמאפשר מודלים נאמנים של מחלות ובדיקות סמים8. באופן דומה, מודלים של מחלות חוץ גופיות נוצרו כדי למדל מחלות בדרכי הנשימה במבחנה, כגון COPD9 וסיסטיק פיברוזיס10. עם זאת, אתגר גדול של התקני LOC הוא שחזור הארכיטקטורה התלת-ממדית (התלת-ממדית) המורכבת של רקמת הריאה והאינטראקציות הדינמיות בין מטריצת תאים לרקמות במבחנה11.

לאחרונה פותחו מתודולוגיות חדשניות להנדסת רקמות המאפשרות מניפולציה של רקמות ריאה ex vivo 12. באמצעות מתודולוגיות אלה, ניתן להכין שתלי רקמות אלוגניות או קסנוגניות על ידי הסרת התאים האנדוגניים מרקמת הריאה באמצעות טיפולים כימיים, פיזיקליים ומכניים13. בנוסף, המטריצה החוץ-תאית של הרקמה המקומית שהשתמרה (ECM) בפיגומי הריאה שעברו דה-תאיזציה מספקת את הרמזים המבניים הפיזיו-מימטיים, הביוכימיים והביו-מכניים עבור תאים מושתלים כדי לחבר, להתרבות ולהבדיל14,15.

כאן מדווחת מערכת ביוריאקטור מונחית הדמיה שנוצרה על ידי שילוב של טכנולוגיות LOC והנדסת רקמות כדי לאפשר מניפולציה של רקמת חוץ גופית ותרבית של רקמות קנה הנשימה של חולדות מוסברות. באמצעות ביוריאקטור זה של רקמת דרכי הנשימה, הפרוטוקול מדגים הסרה סלקטיבית של תאי האפיתל האנדוגניים מבלי לשבש את המרכיבים התת-תאיים והביוכימיים התת-אפיתליאליים הבסיסיים של רקמת דרכי הנשימה. לאחר מכן אנו מראים את ההתפלגות ההומוגנית ואת התצהיר המיידי של התאים האקסוגניים החדשים שנזרעו, כגון תאי גזע מזנכימליים (MSCs), על לומן דרכי הנשימה הפגוע על ידי החדרת תמיסת הקולגן I הקדם-ג'לית הטעונה בתאים. בנוסף, על ידי שימוש בהתקן ההדמיה המיקרו-אופטי המשולב בביוריאקטור, נעשה גם הדמיה של לומן קנה הנשימה במהלך הסרת אפיתל והעברת תאים אנדוגניים. יתר על כן, הוא הראה כי קנה הנשימה והתאים המושתלים החדשים יכולים להיות תרבית בביוריאקטור ללא מוות תאי מורגש והתפרקות רקמות במשך 4 ימים. אנו צופים כי פלטפורמת הביוריאקטורים התומכת בהדמיה, טכניקת הדה-אפיתליזציה המבוססת על סרט דק ושיטת העברת התאים המשמשת במחקר זה יכולות להיות שימושיות ליצירת רקמות דרכי הנשימה עבור מידול מחלות במבחנה ובדיקת תרופות.

הביוריאקטור כולל תא מלבני המחובר למשאבת מזרקים הניתנת לתכנות, משאבת פרפוזיה ומכונת הנשמה לצורך קיבוץ קנה הנשימה של חולדות מבודדות. הביוריאקטור כולל פתחים ושקעים המחוברים לקנה הנשימה או לתא תרביות הרקמה כדי לספק בנפרד ריאגנטים (למשל, מדיית תרבית) למרחבים הפנימיים והחיצוניים של קנה הנשימה (איור 1). ניתן להשתמש במערכת הדמיה שנבנתה בהתאמה אישית כדי לדמיין את פנים קנה הנשימה של חולדה בתרבית חוץ גופית ברמה התאית (איור 2). האפיתל האנדוגני של קנה הנשימה מוסר באמצעות החדרת תמיסת דה-תאיזציה מבוססת דטרגנטים ולאחריה שטיפת דרכי הנשימה בסיוע רטט (איור 3). תמיסת הידרוג'ל, כגון קולגן מסוג I, משמשת ככלי אספקה לזריעה של תאים אקסוגניים באופן אחיד ומיידי על פני לומן קנה הנשימה המנוקד (איור 4). כל החומרים המשמשים לבניית הביוריאקטור ולביצוע הניסויים מסופקים בטבלת החומרים.

Protocol

פרוטוקול רקמות בעלי החיים שלהלן אושר על ידי ההנחיות ותקנות רווחת בעלי החיים של המכון לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במכון סטיבנס לטכנולוגיה, והוא תואם את הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) לשימוש בבעלי חיים ניסיוניים.

1. תכנון ובנייה של ביוריאקטור של קנה הנשימה של חולדה מונחית הדמיה

  1. תכנון וייצור של ביוריאקטור קנה הנשימה של חולדה
    1. צור מודל תכנון בעזרת מחשב (CAD) של תא הביוריאקטור עם תכנון רלוונטי, כגון כניסות, שקעים ותא תרביות רקמה, באמצעות תוכנת מחולל CAD. לצורך מחקר זה, השתמש בגאומטריה ובממדים המוצגים באיור 1A-C. את המדריך של תוכנת גנרטור CAD ניתן למצוא ב 16,17.
    2. ייצא את מודל ה-CAD שנוצר לתוכנת בקר בקרה מספרית ממוחשבת (CNC) וחתוך את הפלסטיק של הפוליטטרפלואורואורואתילן (PTFE) באמצעות מכונת CNC ליצירת תא הביוריאקטור. את המדריך של תוכנת בקר CNC ניתן למצוא בשנת18.
      הערה: בנוסף ל- PTFE, ניתן להשתמש בחומרים פלסטיים אחרים, כגון פוליאתילן במשקל מולקולרי גבוה במיוחד (UHMWPE) ופוליאתרימיד כדי לייצר את תא התרבית.
    3. לעקר את כל רכיבי הביוריאקטור, כגון מתאמי Luer וברגים, כדי למנוע זיהום של הרקמות והתאים בתרבית במכשיר. הרכיבו את כל הרכיבים הביוריאקטורים לתא תרביות הרקמה הראשי בסביבה נקייה (איור 1A).
  2. בניית מכשיר הדמיה מבוסס עדשה (GRIN) המבוסס על אינדקס הדרגתי (GRIN)
    1. כדי ליצור את מכשיר ההדמיה in situ , הכנס עדשת צינור לתוך צינור עדשה הניתן לערימה ואבטח אותה באמצעות טבעת תמך. הרכיבו את מכלול שפופרת העדשה על מצלמת CMOS מדעית באמצעות מתאם C-mount.
    2. השתמש בתוכנה, כגון Micro-Manager, כדי להפעיל את המצלמה ולרכוש תמונות וסרטונים. כוון עצם הממוקם במרחק רב (למשל, 10 מ 'מהמצלמה) והתאם את המרחק בין עדשת הצינור לחיישן ההדמיה של המצלמה עד שתיווצר תמונה ממוקדת של האובייקט על מסך המחשב על ידי תוכנת ההדמיה שבה נעשה שימוש.
    3. הרכיבו עדשת מסנן על מראה דיכרואית בעלת רזולוציה גבוהה במיוחד ולייזר למכשיר באמצעות רכיבי מערכת כלובים אופטיים, כולל מוט הרכבה, לוחית כלוב מושחלת וקוביית כלוב.
    4. חבר את העדשה האובייקטיבית (20x) למכשיר. הרכיבו עדשת GRIN (קוטר = 500 מיקרומטר) בקצה הדיסטלי של שפופרת העדשה באמצעות מתרגם XY. התאם את המרחק בין עדשת GRIN לעדשה האובייקטיבית כדי ליצור תמונות מיקרוסקופיות ממוקדות (איור 2A,B).

2. בידוד קנה הנשימה של החולדה

  1. לחטא את האזור הכירורגי ולעקר את כלי הניתוח באמצעות אוטוקלאב בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני הניתוח.
  2. מניחים חולדה בתא האינדוקציה ומספקים 2.5% מהאיזופלורן למשך 15 דקות באמצעות מכשיר אידוי קטן כדי להרדים את החיה. להעריך את עומק ההרדמה על ידי רפלקס הדוושה. כדי לעשות זאת, לצבוט בחוזקה את הבוהן ולאשר כי החיה אינה מגיבה לצביטת הבוהן.
  3. לאחר ההרדמה, יש להסיר את האיזופלורן מהתא ולתת 1 מ"ל של 1,000 יחידות/מ"ל הפרין דרך וריד הזנב הצדדי כדי למנוע קרישת דם בכלי הדם הריאתיים.
  4. כדי להרדים את החיה, יש לחשוף את החיה ל-5% איזופלורן למשך 15-20 דקות נוספות. מוציאים את החיה מתא האינדוקציה ומניחים אותה על לוח הניתוח בתנוחת שכיבה עם הפנים כלפי מעלה.
  5. תקן את החולדה בלוח הניתוח על ידי שיתוק הרגליים והזנב באמצעות סרט דבק. לאחר מכן, לעקר את אזורי הצוואר והחזה של החולדה באמצעות 70% אלכוהול איזופרופיל (IPA). פתח את חלל הבטן על ידי ביצוע חתך 3-4 ס"מ באמצעות מספריים בעור.
    הערה: היזהר לא לחתוך את העור עמוק על ידי הפניית קצות המספריים כלפי מעלה.
  6. טרנסקט את הווריד הנבוב התחתון (IVC) באמצעות המספריים ואישר את המתת החסד על ידי אקסנגווינציה.
  7. בצעו את קנה הנשימה על ידי ביצוע חתך באמצעות מספריים בקו האמצע של הצוואר וחשיפת קנה הנשימה. בצעו את קו החזה האמצעי על ידי ביצוע חתך בדופן בית החזה וחיתוך בין הצלעות כדי להגיע לקצה קנה הנשימה המחובר לריאה. לאחר מכן, השתמש ב- bicep ובמספריים כדי לחתוך את שני הקצוות של קנה הנשימה ולבודד את קנה הנשימה.
  8. לאחר הבידוד, יש לשטוף את קנה הנשימה באמצעות 20 מ"ל של 1x מלוחים עם אגירת פוספט (1x PBS). מעבירים את קנה הנשימה לביוריאקטור באמצעות שרירי הזרוע המעוקרים. הצמידו את שני הקצוות של קנה הנשימה למחבר Luer באמצעות חוט תפר 4-0.
  9. ספק 5 מ"ל של מדיום תרבית לתא הביוריאקטור באמצעות משאבת המזרק הניתן לתכנות דרך הצינורות המחוברים לתא הביוריאקטור בקצב זרימה של 5 מ"ל לדקה.
    הערה: מדיום התרבית מורכב ממדיום הנשר המהונדס של דולבקו (DMEM), FGF-basic אנושי רקומביננטי (0.1 ננוגרם/מ"ל), סרום בקר עוברי (FBS, 10%), ואנטיביוטיקה-אנטימיקוטית (1%).
  10. סגור בחוזקה את מכסה הביוריאקטור עם מכסה הפלסטיק האקרילי והברגים. סגור את חיבורי הצינורות של תא הביוריאקטור עם תקעי ה-Luer הזכריים/נקביים כדי למנוע את זרימת מדיום התרבית בצינורות.

3. הסרה מונחית הדמיה של אפיתל קנה הנשימה

  1. כדי לדמיין את לומן קנה הנשימה בשדה בהיר או פלואורסצנטי, הניחו את הביוריאקטור על שלב ההדמיה (איור 3A).
  2. הכן תמיסת קרבוקסיפלואורסצין succinimidyl ester (CFSE) (ריכוז: 100 μM) בערכת תיוג תאי CFSE על ידי דילול תמיסת CFSE עם 1x PBS.
    הערה: הריכוז של תמיסת ה-CFSE המקורית הוא 10 mM (בדימתיל סולפוקסיד (DMSO)).
  3. החדרת 500 μL של תמיסת CFSE דרך קנה הנשימה באמצעות משאבת המזרק דרך הצינורות המחוברים לצינורית קנה הנשימה בקצב זרימה של 5 מ"ל לדקה. עצרו את המשאבה כאשר תמיסת ה-CFSE ממלאת את קנה הנשימה. המתן במשך 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף את לומן קנה הנשימה על ידי עירוי של 10 מ"ל של 1x PBS באמצעות משאבת המזרק כדי להסיר את שאריות ריאגנט CFSE לא מקורה.
  4. הכנס את קצה ההדמיה הדיסטלי של עדשת GRIN לקנה הנשימה באמצעות מחבר Luer המחובר לקצה אחד של קנה הנשימה. לאחר מכן, הזיזו בעדינות את עדשת ה-GRIN בתוך קנה הנשימה עד שמשטח קנה הנשימה יהיה ממוקד וצלמו תמונות וסרטונים בשדה בהיר או בפלואורסצנציה בהגדלה של פי 20.
  5. ללכידת תמונות בשדה בהיר בתוכנת Micro-Manager, בצע את השלבים הבאים.
    1. הכניסו אור לבן דרך קוביית הכלוב כדי להאיר את לומן קנה הנשימה. לחץ על הסמל Live כדי להציג את המשטח הזוהר של קנה הנשימה בזמן אמת. השתמש בהגדרת הדמיה > חשיפה (ms) כדי לשנות את זמן החשיפה לערך הרצוי. במחקר זה, זמן החשיפה בו נעשה שימוש היה בטווח של 10 אלפיות השנייה ו-50 אלפיות השנייה.
    2. כדי להתאים את הניגודיות והבהירות של תמונות, השתמש בחלון היסטוגרמה ו-Intensity Scaling כדי להזיז חצים בשחור-לבן בנקודת הקצה של תצוגת ההיסטוגרמה האינטראקטיבית. לחלופין, השתמש באפשרות 'מתיחה אוטומטית' המאפשרת לתוכנה לכוונן את הבהירות והניגודיות באופן אוטומטי לרמות אופטימליות.
    3. לחץ על סמל הצמד כדי להקפיא את התמונה. לאחר מכן, השתמש בהגדרה > 'ייצוא תמונות כעקורות' כדי לשמור את התמונות בתבנית הרצויה. לחלופין, השתמש בהגדרת > ImageJ כדי לייצא ישירות את התמונה לתוכנת ImageJ ולשמור אותה.
  6. כדי להשיג תמונות וסרטונים במצב פלואורסצנטי, האירו את לומן קנה הנשימה באור לייזר ספציפי ל-CFSE (CFSE: אורך גל עירור: 488 ננומטר, אורך גל פליטה: 515 ננומטר) דרך קוביית הכלוב. בצע את השלבים 3.5.2-3.5.3 כדי להשיג את התמונות. לאחר צילום תמונות וסרטונים, הסר בעדינות את עדשת ה- GRIN מקנה הנשימה.
  7. בצע דה-אפיתליזציה כמתואר להלן.
    1. מכינים 2% נתרן דודציל סולפט (SDS) תמיסת דה-תאיזציה במים מזוקקים (DI). החדרת 50 μL של SDS דרך קנה הנשימה בקצב זרימה של 6.3 מ"ל לדקה, על ידי שימוש במשאבת המזרק דרך צינורית קנה הנשימה כדי ליצור סרט דק של תמיסת חומרי הניקוי על לומן קנה הנשימה.
    2. סגור את חיבורי הצינורות של הביוריאקטור באמצעות תקעי Luer זכריים/נקביים והעביר את הביוריאקטור לחממה. אפשרו ל-SDS לשכון בתוך קנה הנשימה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. להחדיר עוד 50 μL של תמיסת SDS דרך קנה הנשימה ולדגום במשך 10 דקות.
    3. הסר אפיתל ו- SDS על ידי השקיית לומן קנה הנשימה עם 500 μL של 1x PBS באמצעות משאבת מזרק בקצב זרימה של 10 מ"ל לדקה עבור 3x. מניחים את הביוריאקטור על שייקר ורוטטים מכנית את הביוריאקטור בתדר של 20 הרץ ומשרעת תזוזה של כ-0.3 מ"מ כדי לקדם פיזית ניתוק של תאי אפיתל שטופלו ב-SDS מלומן קנה הנשימה.
      הערה: במחקר זה, השייקר נבנה בהתאמה אישית על ידי הרכבת רמקול סאב-וופר, מגבר צלחת סאב-וופר ומד תאוצה. צורת גל סינוסואידלית נוצרה על ידי מחשב והוזנה לתוך השייקר דרך המגבר, בעוד שהתגובה של השייקר הייתה מנוטרת באמצעות מד התאוצה (איור 3B). בנוסף, שייקרים קונבנציונליים, כגון שייקרים אלקטרומגנטיים ואינרציה, יכולים לשמש לקידום ניתוק התאים. לשם כך, הגדר את התדר וההאצה של השייקר ל-20 הרץ ו-0.5 גרם, בהתאמה (שווה ערך למשעת תזוזה של 0.3 מ"מ).
    4. להחדיר 500 μL של 1x PBS פעמיים דרך לומן קנה הנשימה כדי להסיר שאריות SDS ופסולת תאים בזמן קנה הנשימה רוטט מכנית. לאחר הליך הסרת האפיתל, העריכו את פינוי שכבת האפיתל על ידי מדידת עוצמת ה-CFSE באמצעות מכשיר ההדמיה של עדשת GRIN כמו בשלב 3.6 (איור 3C).

4. הכנת רקמת קנה הנשימה לניתוחים נוספים

  1. כדי לאשר את הסרת האפיתל, בצע ניתוחי רקמות נוספים, כגון צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E), טריכרום, פנטכרום ואימונוסטין. לשם כך, הסר את קנה הנשימה מהביוריאקטור, ותקן אותו ב-30 מ"ל של תמיסת פרפורמלדהיד נייטרלית של 4% ב-1x PBS (pH = 7.4) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
  2. לייבש ולהטמיע את רקמת קנה הנשימה הקבועה על ידי ביצוע השלבים הבאים.
    1. לאחר קיבוע, לשטוף את רקמת קנה הנשימה עם 10 מ"ל של 1x PBS, להעביר את קנה הנשימה ל 30 מ"ל של 70% אלכוהול, ולשמור אותו על 4 מעלות צלזיוס לילה. חותכים את קנה הנשימה למקטעים גליליים קטנים (כ-5 מ"מ) באמצעות להב חד ומחדירים את חלקי הרקמה לקלטות ההטבעה של הרקמה (אורך x רוחב x גובה: 4 ס"מ x 2.5 ס"מ x 0.5 ס"מ). שמור שני קטעי קנה הנשימה בכל קלטת.
    2. לייבש את החלקים בסדרה של תמיסות איזופרופיל אלכוהול (IPA) - 85%, 90%, 95%, 100% - עבור 1 שעה ב 30 מ"ל של כל תמיסה. הסר את הפתרון הקודם לפני הוספת הפתרון הבא.
    3. עם השלמתו, הטביעו את הקלטת ב-30 מ"ל של חומר סליקה (למשל, קסילן) במשך 2 שעות כדי לעקור לחלוטין את תמיסת ה-IPA מקטעי הרקמה. בצע שלב זה במכסה אדים עם אוורור תקין.
    4. טבלו את הקלטות בפרפין במשך 2 שעות, ולאחר מכן הטמיעו אותן בפרפין בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר מכן, חתכו את הרקמות המוטבעות בפרפין למקטעים דקים (5-8 מיקרומטר) באמצעות התקן מיקרוטום עבור H&E, טריכרום, פנטכרום ואימונוסטין.
  3. כדי להכין את הרקמות לסריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים (SEM) ניתוח, לתקן את קנה הנשימה ב 30 מ"ל של 2.5% תמיסת glutaraldehyde ב 1x PBS (pH = 7.4) ב 4 °C בלילה. לאחר מכן, לייבש את רקמת קנה הנשימה הקבועה עבור SEM על ידי ביצוע השלבים הבאים.
    1. לאחר קיבוע, לשטוף את רקמת קנה הנשימה עם 10 מ"ל של 1x PBS. חותכים את רקמת קנה הנשימה באורך למקטעים קטנים של חצי צילינדר (אורך: כ-5 מ"מ) באמצעות מספריים ומחדירים את חלקי הרקמה לקלטות.
    2. לייבש את החלקים בסדרה של פתרונות IPA - 35%, 50%, 70%, 85%, 95%, ו-100% - למשך 10 דקות ב-30 מ"ל של כל תמיסה. הסר את הפתרון הקודם לפני הוספת הפתרון הבא.
    3. בצע את שיטת הייבוש המבוססת על הקסמתיל-די-די-לזאן (HMDS) על-ידי טבילת הרקמות בתמיסות הבאות: 100% IPA: HMDS (2:1; v/v) למשך 10 דקות, ואחריו 100% IPA: HMDS (1:2; v/v) למשך 10 דקות, ולבסוף 100% HMDS למשך הלילה.
      הערה: HMDS הוא רעיל. יש לעבוד מתחת למכסה אדים במהלך כל שלבי הייבוש.
    4. הסר את הרקמות מתמיסת HMDS ואפשר להן להתייבש מתחת למכסה המנוע של האדים במשך שעה אחת. הרכיבו את החלק על פיני אלומיניום באמצעות סרט מוליך דו-צדדי מפחמן או משחה מוליכה כסופה להדמיית SEM.

5. התפלגות הומוגנית של תאים אקסוגניים על לומן קנה הנשימה המנוקד

  1. הכינו קנה הנשימה של חולדה שעבר דה-אפיתל באמצעות הפרוטוקול בשלב 3. הפשרה של תאי גזע מזנכימליים קפואים (MSCs) במשך 30 שניות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: במחקר זה, השתמשנו בתאי גזע מזנכימליים (MSCs) כתא מודל כדי להראות את התפלגותם של תאים אקסוגניים על קנה הנשימה הדה-אפיתליאלי. באופן אידיאלי, תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה, תאי בסיס או תאים פלוריפוטנטיים מושרים-אנושיים (iPSCs) יכולים לשמש למטרות התחדשות אפיתל.
  2. ספרו את התאים עם המוציטומטר והכינו תמיסת תאים בריכוז של 5 x 106 תאים/מ"ל. סמן את התאים באופן פלואורסצנטי על ידי דגירה של התאים ב-2 מ"ל של תמיסת CFSE (ריכוז: 100 μM) בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. שטפו את התאים ב-5 מ"ל של 1x PBS במשך 3x והחזירו את התאים לתרבית טרייה בריכוז סופי של 3 x 107 תאים/מ"ל.
  3. הכן תמיסת קדם-ג'ל הידרוג'ל ככלי להעברת תאים. לצורך מחקר זה, השתמש בקולגן I ככלי אספקה לתאי MSCs ופעל לפי הוראות היצרן כדי להכין את הקדם-ג'ל. לדוגמה, כדי לקבל 3.6 מ"ג/מ"ל קולגן לפני ג'ל, יש לערבב חלק אחד של תמיסת הנטרול המצוננת עם תשעה חלקים של קולגן זנב החולדה בצינור סטרילי של 1.5 מ"ל. לאחר מכן, טפטפו בעדינות את התערובת למעלה ולמטה לערבוב הולם.
    הערה: ניתן להשתמש בהידרוג'לים אחרים הניתנים להתאמה ביולוגית במקום קולגן I בהתאם למחקר ולצרכי המשתמש.
  4. לאחר הכנת תמיסת ההידרוג'ל, הוסיפו את התאים במהירות לתמיסה בריכוז הרצוי (למשל, 5 x 106 תאים/מ"ל). כדי לקבל תערובת תא-הידרוג'ל אחידה, ערבבו את התאים ואת תמיסת הג'ל על ידי צנרת עדינה עם מיקרופיפט.
  5. חבר קצה אחד של קנה הנשימה בתוך הביוריאקטור למשאבת מזרק ניתנת לתכנות באמצעות מחבר Luer. ספק 5 מ"ל של מדיום תרבית טרי ב-37 מעלות צלזיוס לתוך תא הביוריאקטור כדי לכסות את פני השטח החיצוניים של קנה הנשימה באמצעות משאבת המזרק בקצב זרימה של 5 מ"ל לדקה.
  6. תנו בולוס של 10 μL של תערובת התאים-הידרוג'ל לתוך קנה הנשימה שעבר דה-אפיתל בתוך הביוריאקטור באמצעות משאבת המזרק בקצב זרימה של 5 מ"ל/דקה כדי ליצור שכבת תא-הידרוג'ל על לומן קנה הנשימה (איור 4).
  7. לאחר הזרקת תאים, יש למקם את הביוריאקטור בחממת תרביות תאים סטרילית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 לג'לציה. עבור קולגן I, הג'לציה מתרחשת תוך 30 דקות.
  8. כדי לדמיין את התפלגות התאים המושתלים, עיקרו את עדשת ה-GRIN על ידי ניגוב עם 70% IPA או אתנול והניחו את הביוריאקטור על שלב ההדמיה. צלם תמונות וסרטונים הן במצבי שדה בהיר והן במצבי פלורסנט לפי הצורך.
  9. לאחר 30 דקות של זריעת תאים, מחדירים 1 מ"ל של מדיום תרבית לתוך לומן קנה הנשימה באמצעות משאבת מזרק בקצב זרימה של 1 מ"ל לדקה.
  10. תרבית את קנה הנשימה שנזרע בתאים בתוך הביוריאקטור באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס לזמן הרצוי. לתרבית ארוכת טווח, רעננו את מדיום התרבית בקנה הנשימה לומן ובתא הביוריאקטור כל 24 שעות. במהלך תרבית התאים, שמרו את המדיה בתוך הלומן סטטי ומשנים אותה כל 24 שעות, בעוד שהמדיה שמחוץ לקנה הנשימה מתפרצת באופן רציף באמצעות זרימה חד כיוונית של 5 מ"ל/דקה.
  11. לאחר התרבות התאים במשך פרק זמן מסוים (למשל, יום ו-4 ימים במחקר זה), הסירו את קנה הנשימה מהביוריאקטור. השתמש במספריים כדי לחתוך את קנה הנשימה באורך לשני חלקים חצי צילינדריים (כלומר, חלקים עליונים ותחתונים) בימים 1 ו -4 של תרבית במבחנה כדי לחשוף את המשטחים הפנימיים לניטור צמיחת התא וחישוב צפיפות התא. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי כדי לדמיין את התאים על המשטחים הפנימיים.
  12. כדי להשיג את התמונות באמצעות תוכנת Micro-Manager, בצע את השלבים 3.5 ו- 3.6. השתמש במסנן איזותיוציאנט פלואורסצנטי (FITC) כדי להמחיש את התאים המסומנים ב- CFSE במצב פלואורסצנטי. נתחו את התמונות שצולמו על ידי המיקרוסקופ הפלואורסצנטי וחשבו את צפיפות התאים בחלקים העליונים והתחתונים באמצעות תוכנת ImageJ. כדי לחשב את מספר התאים ואת צפיפות התאים, בצע את השלבים הבאים.
    1. פתח תמונה בתוכנת ImageJ והמר את התמונה לתמונה בינארית (16 סיביות) באמצעות סוג > תמונה > 16 סיביות. הגדר את קנה המידה של התמונה עם סרגל קנה המידה באמצעות נתח > קנה המידה של הסט.
    2. התאם את סף התמונה כדי להדגיש את המבנים של התאים לספירה. השתמש > תמונה התאם את סף >. השתמש ב-Analyze > ניתוח חלקיקים כדי לספור את מספר התאים. חשב את צפיפות התאים על ידי חלוקת מספר התאים בשטח הפנים של התמונה.
  13. כדי להעריך את הכדאיות לאחר זריעת תאים, השתמש בערכת כדאיות תאים. לצורך מחקר זה, דגירה של רקמת קנה הנשימה והתאים בביוריאקטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 6 שעות והכתימו את התאים ב-4 mM calcein-AM ו-2 mM ethidium homodimer-1 ב-1 מ"ל של 1x PBS בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
  14. לאחר שטיפה עם 1x PBS, דמיינו את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ספור את התאים החיים והמתים באמצעות השלבים המתוארים בשלב 5.12. חשב את הכדאיות של התאים כאחוז התאים החיים (המוכתמים ב-calcein-AM) לכל סך התאים (תאים חיים ומתים כאחד).

תוצאות

שיטת ההדמיה in situ המבוססת על עדשת GRIN יכולה לאפשר הדמיה של הלומן הפנימי של קנה הנשימה באתרו (איור 5A). באמצעות שיטת הדמיה זו, ניתן לקבל גם תמונות בשדה בהיר וגם תמונות פלואורסצנטיות של קנה הנשימה הטבעי ושל קנה הנשימה שעבר דה-אפיתל (איור 5B,C). לא נ...

Discussion

בעבודה זו יצרנו ביוריאקטור מונחה הדמיה שיכול לאפשר (1) ניטור של לומן קנה הנשימה באתרו לאחר הסרת התאים והעברת התאים האקסוגנית ו-(ii) תרבית חוץ גופית ארוכת טווח של רקמת קנה הנשימה הזורע בתאים. באמצעות ביוריאקטור זה שנבנה בהתאמה אישית, הדגמנו (1) הסרה סלקטיבית של תאי האפיתל האנדוגניים מ...

Disclosures

המחברים מצהירים על היעדר אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי תוכנית המחקר של קרן האגודה האמריקאית לרפואת החזה, קרן הבריאות של ניו ג'רזי, והקרן הלאומית למדע (פרס CAREER 2143620) לג'יי קיי; והמכונים הלאומיים לבריאות (P41 EB027062) ל- G.V.N.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1× PBSGibco, Thermo Fisher Scientific10-010-031
3-port connectorWorld Precision Instruments14048-20
4-port connectorWorld Precision Instruments14047-10
AccelerometerSTMicroelectronicsIIS3DWBTR
Achromatic doubletThorlabsAC254-150-A-ML
Aluminum pin stubTED PELLA16111
Antibiotic-antimycoticThermo Fisher Scientific15240062
Assembly rodThorlabsER1
Button head screwsMcMaster-Carr91255A274
Cage cubeThorlabsC4W
Carbon double-sided conductive tapeTED PELLA16073
CFSE labelling kitAbcamab113853
Citrisolv (clearing agent)Decon1061
C-mount adapterThorlabsSM1A9
Collagen IAdvanced BioMatrix5153
Conductive liquid silver paintTED PELLA16034
Dichroic mirrorSemrockDI03-R488Reflected laser wavelengths:  473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm
Dulbecco's modified Eagle’s mediumGibco, Thermo Fisher Scientific11965118
Female luer bulkhead to hose barb adapterCole-ParmerEW-45501-30
Female luer to tubing barbCole-ParmerEW-45508-03
Female to male luer connectorCole-ParmerZY-45508-80
Fetal bovine serumGibco, Thermo Fisher Scientific10082147
Filter lensChroma Technology CorpET535/50m
Fluorescent microscopeNikonEclipse E1000 - D
Fusion 360Autodesk
Hex nutMcMaster-Carr91813A160
Hexamethyldisilazane (HMDS)Fisher ScientifcAC120585000
Imaging fiberSELFOC, NSG groupGRIN lens
LaserOpto EngineMDL-D-488-150mW
Lens tubesThorlabsSM1L40
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen)Thermo Fisher ScientificL3224
MACH 3 CNC Control SoftwareNewfangled Solutions
Objective lensOlympusUCPLFLN20X
Peristaltic PumpCole ParmerL/S standard digital pump system
Recombinant human FGF-basicPeproTech100-18B
Retaining ringThorlabsSM1RR
Scientific CMOS cameraPCO PandaPCO Panda 4.2
Sodium dodecyl sulfateVWR97064-472
Solidworks (2019)Dassault Systèmes
Stackable lens tubeThorlabsSM1L10
Subwoofer plate amplifierDayton AudioSPA250DSP
Subwoofer speakerDayton AudioRSS21OHO-4Diaphragm diameter: 21 cm
Syringe PumpWorld Precision InstrumentsAL-4000
Threaded cage plateThorlabsCP33
Threaded luer adapterCole-ParmerEW-45513-81
Tube lensThorlabsAC254-150-A-ML
Tygon TubingCole-Parmer13-200-110
XY TranslatorThorlabsCXY1

References

  1. Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
  2. Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies. Scientific Reports. 9 (1), 500 (2019).
  3. Gohy, S., Hupin, C., Ladjemi, M. Z., Hox, V., Pilette, C. Key role of the epithelium in chronic upper airways diseases. Clinical and Experimental Allergy. 50 (2), 135-146 (2020).
  4. Ganesan, S., Comstock, A. T., Sajjan, U. S. Barrier function of airway tract epithelium. Tissue Barriers. 1 (4), 24997 (2013).
  5. De Rose, V., Molloy, K., Gohy, S., Pilette, C., Greene, C. M. Airway epithelium dysfunction in cystic fibrosis and COPD. Mediators of Inflammation. 2018, 1309746 (2018).
  6. Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the genetics of primary ciliary dyskinesia: Clinical implications. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
  7. Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 10, 74 (2019).
  8. Shrestha, J., et al. Lung-on-a-chip: the future of respiratory disease models and pharmacological studies. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (2), 213-230 (2020).
  9. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
  10. Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. , (2021).
  11. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
  12. Gilpin, S. E., Wagner, D. E. Acellular human lung scaffolds to model lung disease and tissue regeneration. European Respiratory Review. 27 (148), 180021 (2018).
  13. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).
  14. Gilpin, S. E., Charest, J. M., Ren, X., Ott, H. C. Bioengineering lungs for transplantation. Thoracic Surgery Clinics. 26 (2), 163-171 (2016).
  15. Calle, E. A., Leiby, K. L., Raredon, M. B., Niklason, L. E. Lung regeneration: steps toward clinical implementation and use. Current Opinion in Anaesthesiology. 30 (1), 23-29 (2017).
  16. Planchard, D. . Engineering Design with SOLIDWORKS 2022: A Step-by-Step Project Based Approach Utilizing 3D Solid Modeling. , (2022).
  17. Coward, C. . A Beginner's Guide to 3D Modeling: A Guide to Autodesk Fusion 360. , (2019).
  18. Meza, G., Carpio, C. D., Vinces, N., Klusmann, M. . 2018 IEEE XXV International Conference on Electronics, Electrical Engineering and Computing (INTERCON. , 1-4 (2018).
  19. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  20. Tchoukalova, Y. D., Hintze, J. M., Hayden, R. E., Lott, D. G. Tracheal decellularization using a combination of chemical, physical and bioreactor methods. The International Journal of Artificial Organs. 41 (2), 100-107 (2017).
  21. Partington, L., et al. Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds. Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).
  22. Balestrini, J. L., et al. Production of decellularized porcine lung scaffolds for use in tissue engineering. Integrative Biology. 7 (12), 1598-1610 (2015).
  23. Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. Decellularized matrices in regenerative medicine. Acta Biomaterialia. 74, 74-89 (2018).
  24. Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
  25. Huang, S. X. L., et al. The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (3), 413-425 (2015).
  26. Kim, J., O'Neill, J. D., Dorrello, N. V., Bacchetta, M., Vunjak-Novakovic, G. Targeted delivery of liquid microvolumes into the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11530-11535 (2015).
  27. Kim, J., O'Neill, J. D., Vunjak-Novakovic, G. Rapid retraction of microvolume aqueous plugs traveling in a wettable capillary. Applied Physics Letters. 107 (14), 144101 (2015).
  28. O'Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1046-1056 (2013).
  29. Sengyoku, H., et al. Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung. Organogenesis. 14 (2), 94-106 (2018).
  30. Walters, M. S., et al. Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity. Respiratory Research. 14 (1), 135 (2013).
  31. O'Neill, J. D., et al. Cross-circulation for extracorporeal support and recovery of the lung. Nature Biomedical Engineering. 1 (3), 0037 (2017).
  32. Guenthart, B. A., et al. Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform. Nature Communications. 10 (1), 1985 (2019).
  33. Chen, J., et al. Non-destructive vacuum-assisted measurement of lung elastic modulus. Acta Biomaterialia. 131, 370-380 (2021).
  34. Dorrello, N. V., et al. Functional vascularized lung grafts for lung bioengineering. Science Advances. 3 (8), 1700521 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

182

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved