Imaging-geführter Bioreaktor zur Erzeugung von biotechnologisch hergestelltem Atemwegsgewebe

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt einen bildgebenden Bioreaktor, der die selektive Entfernung des endogenen Epithels aus der Luftröhre der Ratten und die homogene Verteilung exogener Zellen auf der Lumenoberfläche ermöglicht, gefolgt von einer langfristigen In-vitro-Kultur des Zell-Gewebe-Konstrukts.

Zusammenfassung

Wiederholte Verletzungen des Atemwegsgewebes können die Lungenfunktion beeinträchtigen und chronische Lungenerkrankungen wie chronisch obstruktive Lungenerkrankungen verursachen. Fortschritte in der regenerativen Medizin und Bioreaktortechnologien bieten Möglichkeiten, im Labor gezüchtete funktionelle Gewebe- und Organkonstrukte herzustellen, die zum Screening von Medikamenten, zum Modellieren von Krankheiten und zum Entwickeln von Gewebeersatz verwendet werden können. Hier wird ein miniaturisierter Bioreaktor in Verbindung mit einer Bildgebungsmodalität beschrieben, die eine In-situ-Visualisierung des inneren Lumens der explantierten Rattenluftröhre während der In-vitro-Gewebemanipulation und - kultur ermöglicht. Mit diesem Bioreaktor demonstriert das Protokoll die bildgebungsgeführte selektive Entfernung endogener zellulärer Komponenten unter Beibehaltung der intrinsischen biochemischen Eigenschaften und der Ultrastruktur der Atemwegsgewebematrix. Weiterhin werden die Abgabe, gleichmäßige Verteilung und anschließende verlängerte Kultur exogener Zellen auf dem dezellularisierten Atemwegslumen mit optischer Überwachung in situ gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass der bildgebende Bioreaktor potenziell verwendet werden kann, um die Bildung von funktionellem In-vitro-Atemwegsgewebe zu erleichtern.

Einleitung

Die luminale Oberfläche der Atemwege ist von einer Epithelschicht ausgekleidet, die hauptsächlich aus mehrfach beritzelten, Keulen-, Kelch- und basalen Stammzellen besteht ^1,2. Die Epithelschicht dient als primärer Abwehrmechanismus der Lunge und fungiert als biophysikalische Barriere, die das darunter liegende Atemwegsgewebe vor eingeatmeten Krankheitserregern, Partikeln oder chemischen Gasen schützt. Es schützt das Atemwegsgewebe durch mehrere Mechanismen, einschließlich interzellulärer Tight-Junction-Bildung, mukoziliärer Clearance und antimikrobieller und antioxidativer Sekretion ^3,4. Das defekte Atemwegsepithel ist mit verheerenden Atemwegserkrankungen wie chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD)⁵, primärer ziliärer Dyskinesie (PCD)⁶ und Mukoviszidose (CF)⁷ assoziiert.

Fortschritte in der Lung-on-Chip (LOC)-Technologie bieten die Möglichkeit, die Entwicklung der menschlichen Lunge zu untersuchen, verschiedene Lungenerkrankungen zu modellieren und neue therapeutische Materialien in streng regulierten In-vitro-Umgebungen zu entwickeln. Zum Beispiel können Atemwegsepithel und Endothel auf gegenüberliegenden Seiten einer dünnen, porösen Membran kultiviert werden, um das Gas nachzuahmen, das Lungengewebe austauscht, was eine originalgetreue Krankheitsmodellierung und Drogentests ermöglicht⁸. In ähnlicher Weise wurden In-vitro-Krankheitsmodelle erstellt, um Atemwegserkrankungen in vitro zu modellieren, wie COPD 9 und Mukoviszidose^10. Eine große Herausforderung von LOC-Geräten besteht jedoch darin, die komplexe dreidimensionale (3D) Architektur des Lungengewebes und die dynamischen Zell-Gewebe-Matrix-Interaktionen in vitro¹¹ zu rekapitulieren.

In jüngster Zeit wurden innovative Tissue-Engineering-Methoden entwickelt, die die Manipulation von Ex-vivo-Lungengewebe ermöglichen¹². Mit diesen Methoden können denudierte allogene oder xenogene Gewebetransplantate hergestellt werden, indem die endogenen Zellen durch chemische, physikalische und mechanische Behandlungen aus dem Lungengewebe entfernt^{werden 13}. Darüber hinaus liefert die konservierte extrazelluläre Matrix (ECM) des nativen Gewebes in den dezellularisierten Lungengerüsten die physio-mimetischen strukturellen, biochemischen und biomechanischen Hinweise für implantierte Zellen zum Anheften, Proliferationieren und Differenzieren^14,15.

Hier wird über ein bildgebungsgesteuertes Bioreaktorsystem berichtet, das durch die Kombination von LOC- und Tissue-Engineering-Technologien geschaffen wurde, um eine In-vitro-Gewebemanipulation und -kultur von explantiertem Trachealgewebe von Ratten zu ermöglichen. Mit diesem Bioreaktor für Atemwegsgewebe zeigt das Protokoll die selektive Entfernung der endogenen Epithelzellen, ohne die darunter liegenden subepithelialen zellulären und biochemischen Komponenten des Atemwegsgewebes zu stören. Als nächstes zeigen wir die homogene Verteilung und sofortige Ablagerung der neu ausgesäten exogenen Zellen, wie mesenchymale Stammzellen (MSCs), auf dem entblößten Atemwegslumen, indem wir die zellbeladene Kollagen-I-Vorgellösung einträufeln. Darüber hinaus erfolgt durch den Einsatz des in den Bioreaktor integrierten mikrooptischen Bildgebungsgerätes auch die Visualisierung des Luftröhrenlumens während der Epithelentfernung und der körpereigenen Zellabgabe. Weiterhin wird gezeigt, dass die Luftröhre und neu implantierte Zellen im Bioreaktor ohne merklichen Zelltod und Gewebeabbau für 4 Tage kultiviert werden können. Wir stellen uns vor, dass die bildgebende Bioreaktorplattform, die dünnschichtbasierte Deepithelialisierungstechnik und die in dieser Studie verwendete Zellabgabemethode für die Erzeugung von Atemwegsgewebe für die Modellierung von In-vitro-Erkrankungen und das Screening von Medikamenten nützlich sein können.

Der Bioreaktor umfasst eine rechteckige Kammer, die mit einer programmierbaren Spritzenpumpe, einer Perfusionspumpe und einem Beatmungsgerät zur Kultivierung isolierter Rattenluftröhre verbunden ist. Der Bioreaktor verfügt über Einlässe und Auslässe, die mit der Luftröhre oder der Gewebekulturkammer verbunden sind, um Reagenzien (z. B. Kulturmedien) separat an die inneren und äußeren Räume der Luftröhre zu liefern (Abbildung 1). Ein speziell entwickeltes Bildgebungssystem kann verwendet werden, um das Innere der in vitro kultivierten Rattenluftröhre auf zellulärer Ebene sichtbar zu machen (Abbildung 2). Das endogene Epithel der Luftröhre wird durch Instillation einer dezellularisierenden Lösung auf Waschmittelbasis mit anschließender vibrationsunterstützter Atemwegswäsche entfernt (Abbildung 3). Hydrogellösung, wie Typ-I-Kollagen, wird als Abgabevehikel für die gleichmäßige und sofortige Aussaat exogener Zellen über das entblößte Luftröhrenlumen verwendet (Abbildung 4). Alle Materialien, die für den Bau des Bioreaktors und die Durchführung der Experimente verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

Protokoll

Das folgende Tiergewebeprotokoll wurde von der Tierschutzrichtlinie und den Vorschriften des Institute for Animal Care and Use Committee (IACUC) am Stevens Institute of Technology genehmigt und entspricht den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) für die Verwendung von Versuchstieren.

1. Entwurf und Bau eines bildgebenden Trachea-Bioreaktors für Ratten

1. Entwicklung und Herstellung von Ratten-Luftröhren-Bioreaktoren
   1. Erstellen Sie mithilfe der CAD-Generatorsoftware ein CAD-Modell (Computer Aided Design) der Bioreaktorkammer mit relevantem Design, z. B. Einlässen, Auslässen und Gewebekulturkammern. Verwenden Sie für diese Studie die in Abbildung 1A-C dargestellte Geometrie und die Bemaßungen. Das Tutorial der CAD-Generator-Software finden Sie in^16,17.
   2. Exportieren Sie das generierte CAD-Modell in eine CNC-Steuerungssoftware (Computer Numerical Control) und schneiden Sie den Kunststoff aus Polytetrafluorethylen (PTFE) mit einer CNC-Maschine aus, um die Bioreaktorkammer zu erstellen. Das Tutorial der CNC-Steuerungssoftware finden Sie in¹⁸.
      HINWEIS: Neben PTFE können andere Kunststoffmaterialien wie ultrahochmolekulares Polyethylen (UHMWPE) und Polyetherimid zur Herstellung der Kulturkammer verwendet werden.
   3. Sterilisieren Sie alle Bioreaktorkomponenten wie Luer-Adapter und Schrauben, um eine Kontamination der im Gerät kultivierten Gewebe und Zellen zu vermeiden. Montage aller Bioreaktorkomponenten in der Hauptgewebekulturkammer in einer sauberen Umgebung (Abbildung 1A).
2. Konstruktion eines linsenbasierten Bildgebungsgeräts mit Gradientenindex (GRIN)
   1. Um das In-situ-Bildgebungsgerät zu erstellen, setzen Sie eine Röhrenlinse in ein stapelbares Linsenrohr ein und sichern Sie es mit einem Haltering. Montieren Sie die Objektiv-Tubus-Baugruppe über einen C-Mount-Adapter auf einer wissenschaftlichen CMOS-Kamera.
   2. Verwenden Sie Software wie Micro-Manager, um die Kamera zu bedienen und Fotos und Videos zu erfassen. Zielen Sie auf ein Objekt, das sich in großer Entfernung befindet (z. B. 10 m von der Kamera entfernt) und passen Sie den Abstand zwischen dem Röhrenobjektiv und dem Bildsensor der Kamera an, bis ein fokussiertes Bild des Objekts auf dem Computerbildschirm von der verwendeten Bildgebungssoftware gebildet wird.
   3. Montieren Sie eine Filterlinse auf einem zweischneidigen, hochauflösenden dichroitischen Spiegel und einen Laser mit optischen Käfigsystemkomponenten, einschließlich Montagestange, Gewindekäfigplatte und Käfigwürfel, am Gerät.
   4. Schließen Sie das Objektiv (20x) an das Gerät an. Montieren Sie eine GRIN-Linse (Durchmesser = 500 μm) am distalen Ende des Linsentubus über den XY-Übersetzer. Passen Sie den Abstand zwischen der GRIN-Linse und der Objektivlinse an, um fokussierte mikroskopische Bilder zu erstellen (Abbildung 2A,B).

2. Isolierung der Trachea der Ratte

1. Desinfizieren Sie den Operationsbereich und sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente mit einem Autoklaven bei 121 ° C für 30 Minuten vor der Operation.
2. Legen Sie eine Ratte in die Induktionskammer und geben Sie 2,5% Isofluran für 15 Minuten mit einem kleinen Verdampfer ab, um das Tier zu betäuben. Beurteilen Sie die Anästhesietiefe durch Pedalreflex. Um dies zu tun, drücken Sie den Zeh fest und bestätigen Sie, dass das Tier nicht auf die Zehenklemme reagiert.
3. Entfernen Sie nach der Anästhesie das Isofluran aus der Kammer und verabreichen Sie 1 ml 1.000 Einheit / ml Heparin durch die laterale Schwanzvene, um eine Blutgerinnung im Lungengefäßsystem zu verhindern.
4. Um das Tier einzuschläfern, setzen Sie das Tier für weitere 15-20 min 5% Isofluran aus. Entfernen Sie das Tier aus der Induktionskammer und legen Sie es in Rückenlage mit dem Gesicht nach oben auf die Operationsplatte.
5. Befestigen Sie die Ratte auf der Operationsplatte, indem Sie die Beine und den Schwanz mit Klebeband immobilisieren. Als nächstes sterilisieren Sie den Hals und die Brustregionen der Ratte mit 70% Isopropylalkohol (IPA). Öffnen Sie die Bauchhöhle, indem Sie einen 3-4 cm großen Schnitt mit einer Schere in der Haut machen.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, die Haut nicht tief zu schneiden, indem Sie die Spitzen der Schere nach oben zeigen.
6. Transezieren Sie die Vena cava inferior (IVC) mit der Schere und bestätigen Sie die Euthanasie durch Exsanguination.
7. Führen Sie die Tracheotomie durch, indem Sie einen Schnitt mit einer Schere in der Mittellinie des Halses machen und die Luftröhre freilegen. Führen Sie eine Thorakotomie der Mittellinie durch, indem Sie einen Schnitt in die Brustwand machen und zwischen den Rippen schneiden, um das mit der Lunge verbundene Luftröhrenende zu erreichen. Als nächstes verwenden Sie einen Bizeps und eine Schere, um beide Enden der Luftröhre zu schneiden und die Luftröhre zu isolieren.
8. Nach der Isolierung spülen Sie die Luftröhre mit 20 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS) aus. Übertragen Sie die Luftröhre mit sterilisiertem Bizeps in den Bioreaktor. Befestigen Sie die beiden Enden der Luftröhre mit einem 4-0-Nahtgewinde am Luer-Stecker.
9. Geben Sie 5 ml Kulturmedium mit der programmierbaren Spritzenpumpe durch die mit der Bioreaktorkammer verbundenen Schläuche mit einer Durchflussrate von 5 ml/min an die Bioreaktorkammer ab.
   HINWEIS: Das Kulturmedium besteht aus Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), rekombinantem humanem FGF-Basis- (0,1 ng / ml), fetalem Rinderserum (FBS, 10%) und Antibiotika-Antimykotikum (1%).
10. Schließen Sie den Bioreaktordeckel mit dem Deckel und den Schrauben aus Acrylkunststoff fest. Schließen Sie die Rohrverbindungen der Bioreaktorkammer mit den Luer-Steckern/Buchsen, um den Fluss des Kulturmediums im Schlauch zu verhindern.

3. Abbildungsgeführte Entfernung des Luftröhrenepithels

1. Um das Luftröhrenlumen entweder im Hellfeld oder fluoreszierend zu visualisieren, platzieren Sie den Bioreaktor auf der Bildgebungsstufe (Abbildung 3A).
2. Stellen Sie die Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE)-Lösung (Konzentration: 100 μM) im CFSE-Zellmarkierungskit her, indem Sie die CFSE-Lösung mit 1x PBS verdünnen.
   HINWEIS: Die Konzentration der ursprünglichen CFSE-Lösung beträgt 10 mM (in Dimethylsulfoxid (DMSO)).
3. 500 μL der CFSE-Lösung durch die Luftröhre über die Spritzenpumpe durch den mit der Luftröhrenkanüle verbundenen Schlauch mit einer Durchflussrate von 5 ml/min infundiert. Stoppen Sie die Pumpe, wenn die CFSE-Lösung die Luftröhre füllt. Warten Sie 10 Minuten und waschen Sie dann das Luftröhrenlumen durch Infusion von 10 ml 1x PBS mit der Spritzenpumpe, um das restliche nicht inkorporierte CFSE-Reagenz zu entfernen.
4. Führen Sie das distale abbildende Ende der GRIN-Linse über den Luer-Stecker, der an einem Ende der Luftröhre befestigt ist, in die Luftröhre ein. Bewegen Sie dann vorsichtig die GRIN-Linse in der Luftröhre, bis die Luftröhrenoberfläche fokussiert ist, und nehmen Sie Fotos und Videos in Hellfeld oder Fluoreszenz bei 20-facher Vergrößerung auf.
5. Führen Sie die folgenden Schritte aus, um Hellfeldbilder in der Micro-Manager-Software aufzunehmen.
   1. Führen Sie weißes Licht durch den Käfigwürfel ein, um das Luftröhrenlumen zu beleuchten. Klicken Sie auf das Live-Symbol , um die luminale Oberfläche der Luftröhre in Echtzeit anzuzeigen. Verwenden Sie Bildeinstellung > Belichtung (ms), um die Belichtungszeit auf den gewünschten Wert zu ändern. In dieser Studie lag die verwendete Expositionszeit im Bereich von 10 ms und 50 ms.
   2. Um den Kontrast und die Helligkeit von Bildern anzupassen, verwenden Sie das Fenster Histogramm- und Intensitätsskalierung , um Schwarz-Weiß-Pfeile am Endpunkt der interaktiven Histogrammanzeige zu verschieben. Alternativ können Sie die Option Auto Stretch verwenden, mit der die Software Helligkeit und Kontrast automatisch auf optimale Werte einstellen kann.
   3. Klicken Sie auf das Snap-Symbol , um das Bild einzufrieren. Verwenden Sie dann Festlegen > Bilder als verschoben exportieren, um die Bilder im gewünschten Format zu speichern. Alternativ können Sie Setting > ImageJ verwenden, um das Bild direkt in die ImageJ-Software zu exportieren und zu speichern.
6. Um Fotos und Videos im fluoreszierenden Modus zu erhalten, beleuchten Sie das Luftröhrenlumen mit CFSE-spezifischem Laserlicht (CFSE: Anregungswellenlänge: 488 nm, Emissionswellenlänge: 515 nm) durch den Käfigwürfel. Befolgen Sie die Schritte 3.5.2-3.5.3, um die Bilder zu erfassen. Nachdem Sie Fotos und Videos aufgenommen haben, entfernen Sie vorsichtig die GRIN-Linse aus der Luftröhre.
7. Führen Sie eine De-Epithelisierung wie unten beschrieben durch.
   1. Bereiten Sie 2% ige Natriumdodecylsulfat (SDS) Dezellularisierungslösung in destilliertem (DI) Wasser vor. Instillieren Sie 50 μL SDS durch die Luftröhre bei einer Durchflussrate von 6,3 ml / min, indem Sie die Spritzenpumpe durch die Luftröhrenkanüle verwenden, um einen dünnen Film der Waschmittellösung auf dem Luftröhrenlumen zu erzeugen.
   2. Schließen Sie die Rohrverbindungen des Bioreaktors mit männlichen / weiblichen Luer-Steckern und übergeben Sie den Bioreaktor in einen Inkubator. Lassen Sie das SDB 10 min bei 37 °C in der Luftröhre verweilen. Weitere 50 μL SDS-Lösung durch die Luftröhre instillieren und 10 min inkubieren.
   3. Entfernen Sie lysiertes Epithel und SDS, indem Sie das Trachea-Lumen mit 500 μL 1x PBS über eine Spritzenpumpe mit einer Durchflussrate von 10 ml/min für 3x bewässern. Platzieren Sie den Bioreaktor auf einem Shaker und vibrieren Sie den Bioreaktor mechanisch mit einer Frequenz von 20 Hz und einer Verschiebungsamplitude von etwa 0,3 mm, um die Ablösung von SDS-behandelten Epithelzellen vom Luftröhrenlumen physikalisch zu fördern.
      HINWEIS: In dieser Studie wurde der Shaker durch die Montage eines Subwoofer-Lautsprechers, eines Subwoofer-Plattenverstärkers und eines Beschleunigungsmessers speziell angefertigt. Eine sinusförmige Wellenform wurde von einem Computer erzeugt und über den Verstärker in den Shaker eingespeist, während die Reaktion des Shakers über den Beschleunigungsmesser überwacht wurde (Abbildung 3B). Darüber hinaus können herkömmliche Shaker, wie elektromagnetische und Trägheitsschüttler, eingesetzt werden, um die Ablösung der Zellen zu fördern. Stellen Sie dazu die Frequenz und Beschleunigung des Schüttlers auf 20 Hz bzw. 0,5 g ein (entspricht 0,3 mm Verschiebungsamplitude).
   4. Träufeln Sie 500 μL 1x PBS zweimal durch das Luftröhrenlumen, um Reste von SDS und Zellablagerungen zu entfernen, während die Luftröhre mechanisch vibriert wird. Nach dem Epithelentfernungsverfahren ist die Clearance der Epithelschicht zu bewerten, indem die Intensität der CFSE mit dem GRIN-Linsenbildgebungsgerät wie in Schritt 3.6 gemessen wird (Abbildung 3C).

4. Tracheagewebepräparation für weitere Analysen

1. Um die Epithelentfernung zu bestätigen, führen Sie weitere Gewebeanalysen durch, wie Hämatoxylin und Eosin (H & E), Trichrom, Pentachrom und Immunfärbung. Entfernen Sie dazu die Luftröhre aus dem Bioreaktor und fixieren Sie sie in 30 ml 4% neutraler gepufferter Paraformaldehydlösung in 1x PBS (pH = 7,4) bei 4 ° C über Nacht.
2. Dehydrieren und betten Sie das fixierte Luftröhrengewebe ein, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   1. Nach der Fixierung waschen Sie das Luftröhrengewebe mit 10 ml 1x PBS, übertragen Sie die Luftröhre auf 30 ml 70% Alkohol und halten Sie es über Nacht bei 4 ° C. Schneiden Sie die Luftröhre mit einer scharfen Klinge in kleine zylindrische Abschnitte (~5 mm) und setzen Sie die Gewebeabschnitte in die Gewebeeinbettungskassetten ein (Länge x Breite x Höhe: 4 cm x 2,5 cm x 0,5 cm). Bewahren Sie zwei Luftröhrenabschnitte in jeder Kassette auf.
   2. Dehydrieren Sie die Abschnitte in einer Reihe von Isopropylalkohol (IPA) -Lösungen - 85%, 90%, 95%, 100% - für 1 h in 30 ml jeder Lösung. Entfernen Sie die vorherige Lösung, bevor Sie die nächste Lösung hinzufügen.
   3. Tauchen Sie die Kassetten nach Abschluss 2 h lang in 30 ml Clearingmittel (z. B. Xylol) ein, um die IPA-Lösung vollständig aus den Gewebeabschnitten zu entfernen. Führen Sie diesen Schritt in einem Abzug mit richtiger Belüftung durch.
   4. Tauchen Sie die Kassetten für 2 h in Paraffin und betten Sie sie dann über Nacht bei 4 °C in Paraffin ein. Als nächstes schneiden Sie die in Paraffin eingebetteten Gewebe in dünne Abschnitte (5-8 μm) mit einem Mikrotomgerät für H & E, Trichrom, Pentachrom und Immunfärbung.
3. Um die Gewebe für die Analyse der Rasterelektronenmikroskopie (REM) vorzubereiten, fixieren Sie die Luftröhre in 30 ml 2,5% iger Glutaraldehydlösung in 1x PBS (pH = 7,4) bei 4 ° C über Nacht. Dann dehydrieren Sie das fixierte Luftröhrengewebe für REM, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   1. Nach der Fixierung spülen Sie das Luftröhrengewebe mit 10 ml 1x PBS aus. Schneiden Sie das Luftröhrengewebe mit einer Schere in Längsrichtung in kleine Halbwirbelabschnitte (Länge: ~5 mm) und führen Sie die Gewebeschnitte in die Kassetten ein.
   2. Dehydrieren Sie die Abschnitte in einer Reihe von IPA-Lösungen - 35%, 50%, 70%, 85%, 95% und 100% - für 10 min in 30 ml jeder Lösung. Entfernen Sie die vorherige Lösung, bevor Sie die nächste Lösung hinzufügen.
   3. Führen Sie eine auf Hexamethyldisilazan (HMDS) basierende Trocknungsmethode durch, indem Sie das Gewebe in die folgenden Lösungen tauchen: 100% IPA: HMDS (2:1; v/v) für 10 min, gefolgt von 100% IPA: HMDS (1:2; v/v) für 10 min und schließlich 100% HMDS für über Nacht.
      HINWEIS: HMDS ist giftig. Arbeiten Sie bei allen Trocknungsschritten unter einem Abzug.
   4. Entfernen Sie die Gewebe aus der HMDS-Lösung und lassen Sie sie 1 Stunde unter dem Abzug trocknen. Montieren Sie den Abschnitt auf Aluminiumstiftstümpfen mit einem doppelseitigen leitfähigen Carbonband oder einer silbernen leitfähigen Paste für die REM-Bildgebung.

5. Homogene Verteilung exogener Zellen auf das entblößte Tracheallumen

1. Bereiten Sie eine entepithelialisierte Rattenluftröhre mit dem Protokoll in Schritt 3 vor. Auftauen von gefrorenen mesenchymalen Stammzellen (MSCs) für 30 s in einem 37 °C warmen Wasserbad.
   HINWEIS: In dieser Studie haben wir mesenchymale Stammzellen (MSCs) als Modellzelle verwendet, um die Verteilung exogener Zellen auf die entepithelialisierte Luftröhre zu zeigen. Idealerweise können primäre Atemwegsepithelzellen, Basalzellen oder induzierte humane pluripotente Zellen (iPSCs) für die Regeneration von Epithelen verwendet werden.
2. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und stellen Sie eine Zelllösung mit einer Konzentration von 5 x 10⁶ Zellen/ml her. Beschriften Sie die Zellen fluoreszierend, indem Sie die Zellen mit 2 ml CFSE-Lösung (Konzentration: 100 μM) bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren. Spülen Sie die Zellen mit 5 ml 1x PBS für 3x aus und resuspendieren Sie die Zellen in frischem Kulturmedium bei einer Endkonzentration von 3 x 10⁷ Zellen / ml.
3. Bereiten Sie die Hydrogel-Vorgellösung als Vehikel für die Zellabgabe vor. Verwenden Sie für diese Studie Kollagen I als Lieferfahrzeug für MSC-Zellen und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um das Vorgel herzustellen. Um beispielsweise 3,6 mg/ml Kollagen-Vorgel zu erhalten, mischen Sie einen Teil der gekühlten Neutralisationslösung mit neun Teilen des Rattenschwanzkollagens in einem 1,5 ml sterilen Röhrchen. Dann pipettieren Sie die Mischung vorsichtig auf und ab, um sie ausreichend zu mischen.
   HINWEIS: Andere biokompatible Hydrogele können anstelle von Kollagen I je nach Studie und Benutzerbedürfnissen verwendet werden.
4. Sobald die Hydrogellösung hergestellt ist, fügen Sie die Zellen schnell der Lösung mit der gewünschten Konzentration hinzu (z. B. 5 x 10⁶ Zellen/ml). Um eine gleichmäßige Zell-Hydrogel-Mischung zu erhalten, mischen Sie die Zellen und die Gellösung durch vorsichtiges Pipettieren mit einer Mikropipette.
5. Befestigen Sie ein Ende der Luftröhre innerhalb des Bioreaktors über einen Luer-Stecker an einer programmierbaren Spritzenpumpe. Geben Sie 5 ml frisches Kulturmedium bei 37 °C in die Bioreaktorkammer ein, um die Außenfläche der Luftröhre mit der Spritzenpumpe mit einer Durchflussrate von 5 ml/min abzudecken.
6. Verabreichung eines 10 μL Bolus des Zell-Hydrogel-Gemisches in die entepithelialisierte Luftröhre innerhalb des Bioreaktors unter Verwendung der Spritzenpumpe bei einer Durchflussrate von 5 ml/min, um eine Zell-Hydrogel-Schicht auf dem Luftröhrenlumen zu erzeugen (Abbildung 4).
7. Nach der Zellinjektion wird der Bioreaktor in einen sterilen Zellkultur-Inkubator bei 37 °C und 5%_CO2 zur Gelierung gegeben. Bei Kollagen I erfolgt die Gelierung in 30 min.
8. Um die Verteilung der implantierten Zellen zu visualisieren, sterilisieren Sie die GRIN-Linse, indem Sie mit 70% IPA oder Ethanol abwischen und den Bioreaktor auf die Bildgebungsstufe stellen. Nehmen Sie bei Bedarf Fotos und Videos sowohl im Hellfeld- als auch im Fluoreszenzmodus auf.
9. Nach 30 min Zellaussaat 1 ml Kulturmedium mit einer Spritzenpumpe bei einer Durchflussrate von 1 ml/min in das Luftröhrenlumen infundieren.
10. Kultivieren Sie die zellgesäte Luftröhre im Bioreaktor in einem Inkubator bei 37 °C für die gewünschte Zeit. Für eine langfristige Kultur das Kulturmedium im Luftröhrenlumen und in der Bioreaktorkammer alle 24 h auffrischen. Halten Sie während der Zellkultur das Medium im Lumen statisch und wechseln Sie es alle 24 h, während das Medium außerhalb der Luftröhre kontinuierlich über einen unidirektionalen Fluss mit 5 ml / min durchblutet wird.
11. Nach der Kultivierung der Zellen für einen bestimmten Zeitraum (z. B. 1 und 4 Tage in dieser Studie) entfernen Sie die Luftröhre aus dem Bioreaktor. Verwenden Sie eine Schere, um die Luftröhre an den Tagen 1 und 4 der In-vitro-Kultur in zwei Halbkolbenabschnitte (dh obere und untere Abschnitte) zu schneiden, um die inneren Oberflächen zur Überwachung des Zellwachstums und zur Berechnung der Zelldichte freizulegen. Verwenden Sie ein herkömmliches Fluoreszenzmikroskop, um die Zellen auf den inneren Oberflächen sichtbar zu machen.
12. Führen Sie die Schritte 3.5 und 3.6 aus, um die Bilder mit der Micro-Manager-Software zu erfassen. Verwenden Sie einen Fluorescein-Isothiocyanat-Filter (FITC), um die CFSE-markierten Zellen im Fluoreszenzmodus zu visualisieren. Analysieren Sie die vom Fluoreszenzmikroskop aufgenommenen Bilder und berechnen Sie die Zelldichten an oberen und unteren Abschnitten mit der ImageJ-Software. Führen Sie die folgenden Schritte aus, um die Anzahl der Zellen und die Zelldichte zu berechnen.
    1. Öffnen Sie ein Bild in der ImageJ-Software und konvertieren Sie das Bild mit Image > Type > 16-Bit in ein binäres Image (16-Bit). Legen Sie den Bildmaßstab mit der Maßstabsleiste mit Analyze > Set Scale fest.
    2. Passen Sie den Schwellenwert des Bildes an, um die Strukturen der zu zählenden Zellen hervorzuheben. Verwenden Sie Bild > passen Sie > Schwellenwert an. Verwenden Sie Analyze > Analyze Particles (Analysieren Analysieren von Partikeln , um die Anzahl der Zellen zu zählen. Berechnen Sie die Dichte der Zellen, indem Sie die Anzahl der Zellen durch die Oberfläche des Bildes teilen.
13. Um die Lebensfähigkeit nach der Zellaussaat zu beurteilen, verwenden Sie ein Zelllebensfähigkeitskit. Inkubieren Sie für diese Studie das Luftröhrengewebe und die Zellen im Bioreaktor bei 37 °C für 6 h und färben Sie die Zellen mit 4 mM Calcein-AM und 2 mM Ethidium homodimer-1 in 1 ml von 1x PBS bei Raumtemperatur für 15 min.
14. Nach dem Spülen mit 1x PBS die Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop visualisieren. Zählen Sie die lebenden und toten Zellen mit den in Schritt 5.12 beschriebenen Schritten. Berechnen Sie die Zelllebensfähigkeit als Prozentsatz der lebenden Zellen (mit Calcein-AM gefärbt) pro Gesamtzelle (sowohl lebende als auch tote Zellen).

Ergebnisse

Die auf der GRIN-Linse basierende In-situ-Bildgebungsmodalität kann die Visualisierung des inneren Lumens des Tracheals in situ ermöglichen (Abbildung 5A). Mit diesem bildgebenden Verfahren können sowohl Hellfeld- als auch Fluoreszenzbilder der nativen und entepithelialisierten Luftröhren erhalten werden (Abbildung 5B,C). Vor der CFSE-Markierung wurde kein fluoreszierendes Signal von der nativen Luftröhre beobachtet (

Diskussion

In dieser Arbeit haben wir einen bildgebungsgeführten Bioreaktor entwickelt, der (i) die Überwachung des Luftröhrenlumens in situ nach der Zellentfernung und exogenen Zellabgabe und (ii) die langfristige In-vitro-Kultur des zellgesäten Luftröhrengewebes ermöglichen kann. Mit diesem speziell angefertigten Bioreaktor demonstrierten wir (i) die selektive Entfernung der endogenen Epithelzellen aus dem Luftröhrenlumen unter Verwendung von Waschmittel und vibrationsunterstützter Atemwegswäsche und (i...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1× PBS	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10-010-031
3-port connector	World Precision Instruments	14048-20
4-port connector	World Precision Instruments	14047-10
Accelerometer	STMicroelectronics	IIS3DWBTR
Achromatic doublet	Thorlabs	AC254-150-A-ML
Aluminum pin stub	TED PELLA	16111
Antibiotic-antimycotic	Thermo Fisher Scientific	15240062
Assembly rod	Thorlabs	ER1
Button head screws	McMaster-Carr	91255A274
Cage cube	Thorlabs	C4W
Carbon double-sided conductive tape	TED PELLA	16073
CFSE labelling kit	Abcam	ab113853
Citrisolv (clearing agent)	Decon	1061
C-mount adapter	Thorlabs	SM1A9
Collagen I	Advanced BioMatrix	5153
Conductive liquid silver paint	TED PELLA	16034
Dichroic mirror	Semrock	DI03-R488	Reflected laser wavelengths:  473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm
Dulbecco's modified Eagle’s medium	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11965118
Female luer bulkhead to hose barb adapter	Cole-Parmer	EW-45501-30
Female luer to tubing barb	Cole-Parmer	EW-45508-03
Female to male luer connector	Cole-Parmer	ZY-45508-80
Fetal bovine serum	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10082147
Filter lens	Chroma Technology Corp	ET535/50m
Fluorescent microscope	Nikon	Eclipse E1000 - D
Fusion 360	Autodesk
Hex nut	McMaster-Carr	91813A160
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Fisher Scientifc	AC120585000
Imaging fiber	SELFOC, NSG group	GRIN lens
Laser	Opto Engine	MDL-D-488-150mW
Lens tubes	Thorlabs	SM1L40
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen)	Thermo Fisher Scientific	L3224
MACH 3 CNC Control Software	Newfangled Solutions
Objective lens	Olympus	UCPLFLN20X
Peristaltic Pump	Cole Parmer	L/S standard digital pump system
Recombinant human FGF-basic	PeproTech	100-18B
Retaining ring	Thorlabs	SM1RR
Scientific CMOS camera	PCO Panda	PCO Panda 4.2
Sodium dodecyl sulfate	VWR	97064-472
Solidworks (2019)	Dassault Systèmes
Stackable lens tube	Thorlabs	SM1L10
Subwoofer plate amplifier	Dayton Audio	SPA250DSP
Subwoofer speaker	Dayton Audio	RSS21OHO-4	Diaphragm diameter: 21 cm
Syringe Pump	World Precision Instruments	AL-4000
Threaded cage plate	Thorlabs	CP33
Threaded luer adapter	Cole-Parmer	EW-45513-81
Tube lens	Thorlabs	AC254-150-A-ML
Tygon Tubing	Cole-Parmer	13-200-110
XY Translator	Thorlabs	CXY1