Biyomühendislik hava yolu dokusu üretmek için görüntüleme kılavuzlu biyoreaktör

Özet

Protokol, endojen epitelin sıçan trakeasından seçici olarak çıkarılmasına ve lümen yüzeyindeki eksojen hücrelerin homojen dağılımına izin veren, ardından hücre dokusu yapısının uzun süreli in vitro kültürüne izin veren görüntüleme özellikli bir biyoreaktörü tanımlar.

Özet

Hava yolu dokusunda tekrarlanan yaralanmalar akciğer fonksiyonunu bozabilir ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı gibi kronik akciğer hastalığına neden olabilir. Rejeneratif tıp ve biyoreaktör teknolojilerindeki ilerlemeler, ilaçları taramak, hastalıkları modellemek ve doku replasmanlarını mühendislik yapmak için kullanılabilecek laboratuarda yetiştirilen fonksiyonel doku ve organ yapıları üretme fırsatları sunmaktadır. Burada, minyatür bir biyoreaktör, in vitro doku manipülasyonu ve kültürü sırasında ekşi sıçan trakeasının iç lümeninin in situ olarak görselleştirilmesini sağlayan bir görüntüleme yöntemi ile birlikte tanımlanmıştır. Bu biyoreaktörü kullanarak, protokol, endojen hücresel bileşenlerin görüntüleme rehberliğinde seçici olarak çıkarılmasını gösterirken, hava yolu doku matrisinin içsel biyokimyasal özelliklerini ve ultrayapısını korur. Ayrıca, desellülarize hava yolu lümenindeki eksojen hücrelerin in situ optik izleme ile verilmesi, homojen dağılımı ve daha sonra uzamış kültürü gösterilmiştir. Sonuçlar, görüntüleme rehberliğindeki biyoreaktörün, fonksiyonel in vitro hava yolu dokularının oluşumunu kolaylaştırmak için potansiyel olarak kullanılabileceğini vurgulamaktadır.

Giriş

Solunum yolunun luminal yüzeyi, esas olarak çok siliyerli, kulüp, kadeh ve bazal kök hücrelerden oluşan bir epitel tabakası ile kaplıdır ^1,2. Epitel tabakası, akciğerin birincil savunma mekanizması olarak işlev görür ve altta yatan hava yolu dokusunu solunan patojenlere, partiküllere veya kimyasal gazlara karşı koruyan biyofiziksel bir bariyer görevi görür. Hava yolu dokusunu, hücreler arası sıkı bağlantı oluşumu, mukosiliyer klirens ve antimikrobiyal ve antioksidan sekresyon ^3,4 dahil olmak üzere çoklu mekanizmalarla korur. Kusurlu hava yolu epiteli, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH)⁵, primer siliyer diskinezi (PCD)⁶ ve kistik fibroz (KF)⁷ gibi yıkıcı solunum yolu hastalıkları ile ilişkilidir.

Çip üzerinde akciğer (LOC) teknolojisindeki ilerlemeler, insan akciğer gelişimini incelemek, çeşitli akciğer hastalıklarını modellemek ve sıkı bir şekilde düzenlenmiş in vitro ortamlarda yeni terapötik materyaller geliştirmek için bir fırsat sunmaktadır. Örneğin, hava yolu epiteli ve endotel, akciğer dokusunu değiştiren gazı taklit etmek için ince, gözenekli bir zarın zıt taraflarında kültürlenebilir, bu da sadık hastalık modellemesine ve ilaç testine izin verir⁸. Benzer şekilde, KOAH⁹ ve kistik fibroz¹⁰ gibi in vitro hava yolu hastalıklarını modellemek için in vitro hastalık modelleri oluşturulmuştur. Bununla birlikte, LOC cihazlarının en büyük zorluğu, akciğer dokusunun karmaşık üç boyutlu (3D) mimarisini ve in vitro¹¹ dinamik hücre-doku matris etkileşimlerini özetlemektir.

Son zamanlarda, ex vivo akciğer dokularının manipülasyonuna izin veren yenilikçi doku mühendisliği metodolojileri geliştirilmiştir¹². Bu metodolojiler kullanılarak, endojen hücrelerin akciğer dokusundan kimyasal, fiziksel ve mekanik işlemlerle çıkarılmasıyla reddedilen allojenik veya ksenojenik doku greftleri hazırlanabilir¹³. Ek olarak, desellülarize akciğer iskelelerindeki korunmuş doğal doku hücre dışı matrisi (ECM), implante edilmiş hücrelerin^14,15'i bağlaması^, çoğalması ve ayırt etmesi için fizyo-mimetik yapısal, biyokimyasal ve biyomekanik ipuçları sağlar.

Burada, in vitro doku manipülasyonuna ve ekşimiş sıçan trakeal dokularının kültürüne izin vermek için LOC ve doku mühendisliği teknolojilerinin birleştirilmesiyle oluşturulan görüntüleme rehberliğinde bir biyoreaktör sistemi bildirilmiştir. Bu hava yolu doku biyoreaktörünü kullanarak, protokol, hava yolu dokusunun altta yatan subepitelyal hücresel ve biyokimyasal bileşenlerini bozmadan endojen epitel hücrelerinin seçici olarak çıkarılmasını gösterir. Daha sonra, mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) gibi yeni tohumlanmış eksojen hücrelerin, hücre yüklü kollajen I jel öncesi çözeltisini aşılayarak inkar edilmiş hava yolu lümeni üzerindeki homojen dağılımını ve anlık birikimini göstereceğiz. Ayrıca biyoreaktöre entegre mikro-optik görüntüleme cihazı kullanılarak epitel çıkarılması ve endojen hücre iletimi sırasında trakea lümeninin görselleştirilmesi de yapılmaktadır. Ayrıca, trakea ve yeni implante edilen hücrelerin, 4 gün boyunca gözle görülür hücre ölümü ve doku bozulması olmadan biyoreaktörde kültürlenebileceği gösterilmiştir. Bu çalışmada kullanılan görüntüleme özellikli biyoreaktör platformunun, ince film bazlı deepitelizasyon tekniğinin ve hücre dağıtım yönteminin, in vitro hastalık modellemesi ve ilaç taraması için hava yolu dokularının oluşturulmasında yararlı olabileceğini öngörüyoruz.

Biyoreaktör, izole sıçan trakeasını kültürlemek için programlanabilir bir şırınga pompasına, perfüzyon pompasına ve vantilatöre bağlı dikdörtgen bir oda içerir. Biyoreaktör, trakeanın iç ve dış boşluklarına ayrı ayrı reaktifler (örneğin, kültür ortamı) beslemek için trakeaya veya doku kültürü odasına bağlı giriş ve çıkışlara sahiptir (Şekil 1). Özel yapım bir görüntüleme sistemi, in vitro kültürlü sıçan trakeasının içini hücresel düzeyde görselleştirmek için kullanılabilir (Şekil 2). Trakeanın endojen epiteli, deterjan bazlı bir desellülarizasyon çözeltisinin damlatılması ve ardından titreşim destekli hava yolu yıkama ile çıkarılır (Şekil 3). Tip I kollajen gibi hidrojel çözeltisi, eksojen hücrelerin denuded trakea lümeni boyunca düzgün ve anında tohumlanması için bir dağıtım aracı olarak kullanılır (Şekil 4). Biyoreaktörü inşa etmek ve deneyleri yürütmek için kullanılan tüm malzemeler Malzeme Tablosunda verilmiştir.

Protokol

Aşağıdaki hayvan dokusu protokolü, Stevens Teknoloji Enstitüsü'ndeki Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi Enstitüsü'nün (IACUC) hayvan refahı kılavuzu ve düzenlemeleri tarafından onaylanmıştır ve deney hayvanlarının kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) kılavuzlarına uygundur.

1. Görüntüleme kılavuzlu sıçan trakea biyoreaktörünün tasarımı ve yapımı

1. Sıçan trakea biyoreaktörünün tasarımı ve imalatı
   1. CAD jeneratör yazılımını kullanarak girişler, çıkışlar ve doku kültürü odası gibi ilgili tasarıma sahip biyoreaktör odasının bilgisayar destekli tasarım (CAD) modelini oluşturun. Bu etüt için, Şekil 1A-C'de sunulan geometriyi ve ölçümlendirmeleri kullanın. CAD jeneratör yazılımının öğreticisi^16,17'de bulunabilir.
   2. Oluşturulan CAD modelini bir bilgisayar sayısal kontrol (CNC) denetleyici yazılımına aktarın ve biyoreaktör odasını oluşturmak için bir CNC makinesi kullanarak politetrafloroetilen (PTFE) plastiğini kesin. CNC kontrolör yazılımının öğreticisi^18'de bulunabilir.
      NOT: PTFE'ye ek olarak, kültür odasını imal etmek için ultra yüksek moleküler ağırlıklı polietilen (UHMWPE) ve polieterimid gibi diğer plastik malzemeler de kullanılabilir.
   3. Cihazda kültürlenen doku ve hücrelerin kirlenmesini önlemek için Luer adaptörleri ve vidaları gibi tüm biyoreaktör bileşenlerini sterilize edin. Tüm biyoreaktör bileşenlerini temiz bir ortamda ana doku kültürü odasına monte edin (Şekil 1A).
2. Degrade indeksi (GRIN) lens tabanlı görüntüleme cihazının yapımı
   1. Yerinde görüntüleme aygıtını oluşturmak için, istiflenebilir bir lens tüpüne bir tüp lens yerleştirin ve bir tutma halkası kullanarak sabitleyin. Lens tüpü düzeneğini bir C montaj adaptörü aracılığıyla bilimsel bir CMOS kameraya monte edin.
   2. Kamerayı çalıştırmak ve fotoğraf ve video almak için Micro-Manager gibi bir yazılım kullanın. Uzun bir mesafede (örneğin, kameradan 10 m uzaklıkta) bulunan bir nesneyi hedefleyin ve kullanılan görüntüleme yazılımı tarafından bilgisayar ekranında nesnenin odaklanmış bir görüntüsü oluşturulana kadar tüp lensi ile kameranın görüntüleme sensörü arasındaki mesafeyi ayarlayın.
   3. Çift kenarlı süper çözünürlüklü dikroik aynaya bir filtre lensi ve montaj çubuğu, dişli kafes plakası ve kafes küpü dahil olmak üzere optik kafes sistemi bileşenlerini kullanarak cihaza bir lazer takın.
   4. Hedef lensi (20x) cihaza bağlayın. XY çevirici aracılığıyla objektif tüpünün distal ucuna bir GRIN lens (çap = 500 μm) takın. Odaklanmış mikroskobik görüntüler oluşturmak için GRIN lens ile objektif lens arasındaki mesafeyi ayarlayın (Şekil 2A,B).

2. Sıçan trakeasının izolasyonu

1. Cerrahi bölgeyi sterilize edin ve ameliyattan önce 30 dakika boyunca 121 ° C'de bir otoklav kullanarak cerrahi aletleri sterilize edin.
2. İndüksiyon odasına bir sıçan yerleştirin ve hayvanı anestezik için küçük bir buharlaştırıcı kullanarak 15 dakika boyunca% 2.5 izofluran verin. Anestezi derinliğini pedal refleksi ile değerlendirin. Bunu yapmak için, ayak parmağını sıkıca sıkıştırın ve hayvanın ayak parmağı sıkışmasına cevap vermediğini onaylayın.
3. Anesteziden sonra, izofluranı odadan çıkarın ve pulmoner vaskülatürde kanın pıhtılaşmasını önlemek için lateral kuyruk damarından 1 mL 1.000 ünite / mL heparin uygulayın.
4. Hayvanı ötenazi yapmak için, hayvanı 15-20 dakika daha% 5 izoflurana maruz bırakın. Hayvanı indüksiyon odasından çıkarın ve cerrahi tahtaya yüzü yukarı bakacak şekilde sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
5. Yapışkan bant kullanarak bacakları ve kuyruğu hareketsiz hale getirerek sıçanı cerrahi tahtaya sabitleyin. Daha sonra, sıçanın boyun ve göğüs bölgelerini% 70 izopropil alkol (IPA) kullanarak sterilize edin. Deride makas kullanarak 3-4 cm'lik bir kesi yaparak karın boşluğunu açın.
   NOT: Makasın uçlarını yukarı doğru işaret ederek cildi derin kesmemeye dikkat edin.
6. İnferior vena kavayı (IVC) makas kullanarak transekte edin ve eksanguinasyon ile ötenaziyi onaylayın.
7. Boynun orta hattında makas kullanarak bir kesi yaparak ve trakeayı açığa çıkararak trakeotomi yapın. Göğüs duvarında bir kesi yaparak ve akciğere bağlı trakea ucuna ulaşmak için kaburgalar arasında keserek orta hat torakotomi yapın. Daha sonra, trakeanın her iki ucunu kesmek ve trakeayı izole etmek için bir biseps ve makas kullanın.
8. İzolasyondan sonra, trakeayı 20 mL 1x fosfat tamponlu salin (1x PBS) kullanarak durulayın. Trakeayı sterilize edilmiş biseps kullanarak biyoreaktöre aktarın. Trakeanın iki ucunu 4-0 dikiş ipliği kullanarak Luer konektörüne sabitleyin.
9. Programlanabilir şırınga pompasını kullanarak biyoreaktör odasına 5 mL/dak akış hızında biyoreaktör odasına 5 mL kültür ortamı verin.
   NOT: Kültür ortamı, Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamı (DMEM), rekombinant insan FGF-bazik (0.1 ng / mL), fetal sığır serumu (FBS,% 10) ve antibiyotik-antimikotik (% 1) 'den oluşur.
10. Biyoreaktör kapağını akrilik plastik kapak ve vidalarla sıkıca kapatın. Kültür ortamının boru içindeki akışını önlemek için biyoreaktör haznesi boru bağlantılarını erkek/dişi Luer tapalarıyla kapatın.

3. Trakea epitelinin görüntüleme eşliğinde çıkarılması

1. Trakea lümenini parlak alanda veya floresanda görselleştirmek için, biyoreaktörü görüntüleme aşamasına yerleştirin (Şekil 3A).
2. CFSE çözeltisini 1x PBS ile seyrelterek CFSE hücre etiketleme kitinde karboksifloresein süksinimidil ester (CFSE) çözeltisi (konsantrasyon: 100 μM) hazırlayın.
   NOT: Orijinal CFSE çözeltisinin konsantrasyonu 10 mM'dir (dimetil sülfoksit (DMSO)).
3. CFSE çözeltisinin 500 μL'sini, trakea kanülüne bağlı borudan şırınga pompası aracılığıyla trakeadan 5 mL / dak akış hızında infüze edin. CFSE çözeltisi trakeayı doldurduğunda pompayı durdurun. 10 dakika bekleyin ve ardından artık dahil edilmemiş CFSE reaktifini çıkarmak için şırınga pompasını kullanarak 10 mL 1x PBS infüzyonu ile trakea lümenini yıkayın.
4. GRIN lensin distal görüntüleme ucunu, trakeanın bir ucuna takılı Luer konektörü aracılığıyla trakeaya yerleştirin. Ardından, trakea yüzeyi odaklanana kadar GRIN lensi trakeanın içinde yavaşça hareket ettirin ve 20x büyütmede parlak alanda veya floresanda fotoğraf ve video çekin.
5. Micro-Manager yazılımında parlak alan görüntüleri yakalamak için aşağıdaki adımları izleyin.
   1. Trakea lümenini aydınlatmak için kafes küpünden beyaz ışık sokun. Trakeanın aydınlık yüzeyini gerçek zamanlı olarak göstermek için Canlı simgesine tıklayın. Pozlama süresini istenen değere değiştirmek için Görüntüleme Ayarı> Pozlama (ms) özelliğini kullanın. Bu çalışmada kullanılan maruz kalma süresi 10 ms ile 50 ms aralığındadır.
   2. Görüntülerin kontrastını ve parlaklığını ayarlamak için, etkileşimli histogram ekranının uç noktasında siyah beyaz okları taşımak üzere Histogram ve Yoğunluk Ölçeklendirme penceresini kullanın. Alternatif olarak, yazılımın parlaklığı ve kontrastı otomatik olarak optimum seviyelere ayarlamasını sağlayan Otomatik Esnetme seçeneğini kullanın.
   3. Görüntüyü dondurmak için Tutturma simgesine tıklayın. Ardından, görüntüleri istenen biçimde kaydetmek için Görüntüleri Yer Değiştirmiş Olarak Dışa Aktar > Ayarla'yı kullanın. Alternatif olarak, görüntüyü doğrudan ImageJ yazılımına dışa aktarmak ve kaydetmek için ImageJ > Ayarı özelliğini kullanın.
6. Floresan modunda fotoğraf ve video elde etmek için, trakea lümenini kafes küpü boyunca CFSE'ye özgü lazer ışığıyla (CFSE: uyarma dalga boyu: 488 nm, emisyon dalga boyu: 515 nm) aydınlatın. Görüntüleri almak için 3.5.2-3.5.3 adımlarını izleyin. Fotoğraf ve video çektikten sonra, GRIN lensi trakeadan yavaşça çıkarın.
7. Aşağıda açıklandığı gibi deepitelizasyon gerçekleştirin.
   1. Damıtılmış (DI) suda %2 sodyum dodesil sülfat (SDS) desellülarizasyon çözeltisi hazırlayın. Trakea lümeni üzerinde ince bir deterjan çözeltisi filmi oluşturmak için trakea kanülünden şırınga pompasını kullanarak, trakeadan 6.3 mL / dak akış hızında 50 μL SDS damlatın.
   2. Erkek/dişi Luer tıkaçlarını kullanarak biyoreaktörün boru bağlantılarını kapatın ve biyoreaktörü bir inkübatöre aktarın. SDS'nin trakea içinde 37 ° C'de 10 dakika beklemesine izin verin. Trakea boyunca başka bir 50 μL SDS çözeltisi damlatın ve 10 dakika boyunca inkübe edin.
   3. Trakea lümenini şırınga pompası aracılığıyla 500 μL 1x PBS ile 3x için 10 mL / dak akış hızında sulayarak lize epitel ve SDS'yi çıkarın. Biyoreaktörü bir çalkalayıcıya yerleştirin ve SDS ile muamele edilen epitel hücrelerinin trakea lümeninden ayrılmasını fiziksel olarak teşvik etmek için biyoreaktörü 20 Hz frekansta ve yaklaşık 0.3 mm'lik yer değiştirme genliğinde mekanik olarak titreştirin.
      NOT: Bu çalışmada, çalkalayıcı bir subwoofer hoparlörü, bir subwoofer plaka amplifikatörü ve bir ivmeölçer monte edilerek özel olarak üretilmiştir. Bir bilgisayar tarafından sinüzoidal bir dalga formu üretildi ve yükselteç aracılığıyla çalkalayıcıya beslenirken, çalkalayıcının tepkisi ivmeölçer aracılığıyla izlendi (Şekil 3B). Ek olarak, elektromanyetik ve atalet çalkalayıcıları gibi geleneksel çalkalayıcılar, hücrelerin ayrılmasını teşvik etmek için kullanılabilir. Bunu yapmak için, çalkalayıcının frekansını ve ivmesini sırasıyla 20 Hz ve 0,5 g'ye ayarlayın (0,3 mm yer değiştirme genliğine eşdeğer).
   4. Trakea mekanik olarak titreştirilirken kalan SDS ve hücre kalıntılarını gidermek için trakea lümeninden iki kez 500 μL 1x PBS aşılayın. Epitel çıkarma prosedürünü takiben, adım 3.6'da olduğu gibi GRIN lens görüntüleme cihazını kullanarak CFSE'nin yoğunluğunu ölçerek epitel tabakasının klerensini değerlendirin (Şekil 3C).

4. Daha ileri analizler için trakea dokusu hazırlığı

1. Epitelin çıkarılmasını doğrulamak için, hematoksilin ve eozin (H & E) boyama, trikrom, pentakrom ve immün boyama gibi daha ileri doku analizleri yapın. Bunu yapmak için, trakeayı biyoreaktörden çıkarın ve gece boyunca 4 ° C'de 1x PBS'de (pH = 7.4) 30 mL% 4 nötr tamponlu paraformaldehit çözeltisine sabitleyin.
2. Aşağıdaki adımları izleyerek sabit trakea dokusunu kurutun ve gömün.
   1. Fiksasyondan sonra, trakea dokusunu 10 mL 1x PBS ile yıkayın, trakeayı 30 mL% 70 alkole aktarın ve gece boyunca 4 ° C'de tutun. Trakeayı keskin bir bıçak kullanarak küçük silindirik kesitler (~5 mm) halinde kesin ve doku bölümlerini doku gömme kasetlerine yerleştirin (uzunluk x genişlik x yükseklik: 4 cm x 2,5 cm x 0,5 cm). Her kasette iki trakea bölümü bulundurun.
   2. Bölümleri bir dizi izopropil alkol (IPA) çözeltisinde -% 85,% 90,% 95,% 100 - her çözeltinin 30 mL'sinde 1 saat boyunca dehidre edin. Sonraki çözümü eklemeden önce önceki çözümü kaldırın.
   3. Tamamlandığında, IPA çözeltisini doku kesitlerinden tamamen çıkarmak için kasetleri 2 saat boyunca 30 mL temizleme maddesine (örneğin ksilen) batırın. Bu adımı uygun havalandırma ile bir duman davlumbazında gerçekleştirin.
   4. Kasetleri 2 saat boyunca parafine batırın ve daha sonra gece boyunca 4 ° C'de parafin içine yerleştirin. Daha sonra, parafine gömülü dokuları H & E, trikrom, pentakrom ve immün boyama için bir mikrotom cihazı kullanarak ince bölümlere (5-8 μm) kesin.
3. Dokuları taramalı elektron mikroskobu (SEM) analizine hazırlamak için, trakeayı gece boyunca 4 ° C'de 1x PBS'de (pH = 7.4) 30 mL% 2.5 glutaraldehit çözeltisinde sabitleyin. Ardından, aşağıdaki adımları izleyerek SEM için sabit trakea dokusunu dehidre edin.
   1. Fiksasyondan sonra, trakea dokusunu 10 mL 1x PBS ile durulayın. Trakea dokusunu makas kullanarak uzunlamasına küçük yarı silindirli kesitler halinde (uzunluk: ~5 mm) kesin ve doku bölümlerini kasetlere yerleştirin.
   2. Bölümleri bir dizi IPA çözeltisinde -% 35,% 50,% 70,% 85,% 95 ve% 100 - her çözeltinin 30 mL'sinde 10 dakika boyunca dehidre edin. Sonraki çözümü eklemeden önce önceki çözümü kaldırın.
   3. Dokuları aşağıdaki çözeltilere batırarak hekzametildisilazan (HMDS) bazlı kurutma yöntemini uygulayın: 10 dakika boyunca %100 IPA: HMDS (2:1; v/v), ardından 10 dakika boyunca %100 IPA: HMDS (1:2; v/v) ve son olarak gece boyunca %100 HMDS.
      NOT: HMDS zehirlidir. Tüm kurutma adımları sırasında bir duman davlumbazının altında çalışın.
   4. Dokuları HMDS çözeltisinden çıkarın ve duman başlığının altında 1 saat kurumasını bekleyin. SEM görüntüleme için karbon çift taraflı iletken bant veya gümüş iletken macun kullanarak bölümü alüminyum pim saplamalarına monte edin.

5. Eksojen hücrelerin denuded trakeal lümen üzerine homojen dağılımı

1. Adım 3'teki protokolü kullanarak epitelize edilmiş bir sıçan trakeası hazırlayın. Dondurulmuş mezenkimal kök hücreleri (MSC'ler) 37 °C su banyosunda 30 sn boyunca çözün.
   NOT: Bu çalışmada, eksojen hücrelerin deepitelize trakea üzerine dağılımını göstermek için model hücre olarak mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) kullanıldı. İdeal olarak, primer hava yolu epitel hücreleri, bazal hücreler veya indüklenmiş insan pluripotent hücreleri (iPSC'ler) epitel rejenerasyonu amacıyla kullanılabilir.
2. Hücreleri bir hemositometre ile sayın ve 5 x 10⁶ hücre / mL konsantrasyonunda bir hücre çözeltisi hazırlayın. Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 2 mL CFSE çözeltisi (konsantrasyon: 100 μM) ile inkübe ederek floresan olarak etiketleyin. Hücreleri 3x için 5 mL 1x PBS ile durulayın ve hücreleri taze kültür ortamında 3 x 10⁷ hücre / mL'lik son konsantrasyonda yeniden askıya alın.
3. Hidrojel ön jel çözeltisini hücre dağıtımı için bir araç olarak hazırlayın. Bu çalışma için, MSC hücreleri için bir dağıtım aracı olarak kollajen I kullanın ve ön jeli hazırlamak için üreticinin talimatlarını izleyin. Örneğin, 3.6 mg / mL kollajen ön jeli elde etmek için, soğutulmuş nötralizasyon çözeltisinin bir kısmını, 1.5 mL'lik steril bir tüpte sıçan kuyruğu kollajeninin dokuz kısmı ile karıştırın. Ardından, yeterli karıştırma için karışımı yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin.
   NOT: Çalışmaya ve kullanıcı ihtiyaçlarına göre kollajen I yerine biyouyumlu diğer hidrojeller kullanılabilir.
4. Hidrojel çözeltisi hazırlandıktan sonra, hücreleri istenen konsantrasyonda çözeltiye hızlı bir şekilde ekleyin (örneğin, 5 x 10⁶ hücre / mL). Düzgün bir hücre-hidrojel karışımı elde etmek için, hücreleri ve jel çözeltisini bir mikropipetle hafifçe pipetleyerek karıştırın.
5. Biyoreaktör içindeki trakeanın bir ucunu bir Luer konektörü aracılığıyla programlanabilir bir şırınga pompasına takın. Şırınga pompasını kullanarak trakeanın dış yüzeyini 5 mL/dak akış hızında kaplamak için biyoreaktör odasına 37 °C'de 5 mL taze kültür ortamı sağlayın.
6. Trakea lümeni üzerinde bir hücre-hidrojel tabakası oluşturmak için şırınga pompasını kullanarak biyoreaktör içindeki de-epitelinize trakeaya hücre-hidrojel karışımının 10 μL'lik bir bolusunu uygulayın (Şekil 4).
7. Hücre enjeksiyonundan sonra, biyoreaktörü steril bir hücre kültürü inkübatörüne 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de jelasyon için yerleştirin. Kollajen I için jelleşme 30 dakika içinde gerçekleşir.
8. İmplante edilen hücrelerin dağılımını görselleştirmek için, GRIN lensi% 70 IPA veya etanol ile silerek sterilize edin ve biyoreaktörü görüntüleme aşamasına yerleştirin. Gerektiğinde hem parlak alan hem de floresan modlarında fotoğraf ve video çekin.
9. 30 dakikalık hücre tohumlamasından sonra, 1 mL / dak akış hızında bir şırınga pompası kullanarak trakea lümenine 1 mL kültür ortamı enjekte edin.
10. Biyoreaktör içindeki hücre tohumlu trakeayı istenen süre boyunca 37 ° C'de bir inkübatörde kültürleyin. Uzun süreli kültür için, trakea lümenindeki ve biyoreaktör odasındaki kültür ortamını her 24 saatte bir yenileyin. Hücre kültürü sırasında, medyayı lümen statik içinde tutun ve her 24 saatte bir değiştirin, trakea dışındaki ortam ise 5 mL / dak'da tek yönlü bir akış yoluyla sürekli olarak perfüze edilir.
11. Hücreleri belirli bir süre boyunca (örneğin, bu çalışmada 1 ve 4 gün) kültürledikten sonra, trakeayı biyoreaktörden çıkarın. Hücre büyümesini izlemek ve hücre yoğunluğunu hesaplamak için iç yüzeyleri açığa çıkarmak için trakeayı in vitro kültürün 1. ve 4. günlerinde uzunlamasına iki yarı silindirli bölüme (yani üst ve alt bölümlere) kesmek için makas kullanın. İç yüzeylerdeki hücreleri görselleştirmek için geleneksel bir floresan mikroskop kullanın.
12. Micro-Manager yazılımını kullanarak görüntüleri elde etmek için 3.5 ve 3.6 numaralı adımları izleyin. CFSE etiketli hücreleri floresan modunda görselleştirmek için bir floresein izotiyosiyanat (FITC) filtresi kullanın. Floresan mikroskop tarafından çekilen görüntüleri analiz edin ve ImageJ yazılımını kullanarak üst ve alt bölümlerdeki hücre yoğunluklarını hesaplayın. Hücre sayısını ve hücre yoğunluğunu hesaplamak için aşağıdaki adımları izleyin.
    1. ImageJ yazılımında bir görüntü açın ve Image > Type > 16 bit kullanarak görüntüyü ikili görüntüye (16 bit) dönüştürün. Ölçek çubuğunu kullanarak görüntü ölçeğini Analiz > Ayarla'yı kullanarak ayarlayın.
    2. Sayılacak hücrelerin yapılarını vurgulamak için görüntünün eşiğini ayarlayın. > eşiğini ayarlamak > resim kullanın. Hücre sayısını saymak için Analiz Et > Parçacıkları Analiz Et'i kullanın. Hücre sayısını görüntünün yüzey alanına bölerek hücrelerin yoğunluğunu hesaplayın.
13. Hücre tohumlamasından sonra canlılığı değerlendirmek için, bir hücre canlılığı kiti kullanın. Bu çalışma için, trakea dokusunu ve biyoreaktördeki hücreleri 6 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin ve hücreleri 15 dakika boyunca oda sıcaklığında 1 mL 1x PBS'de 4 mM kalsein-ve 2 mM ethidyum homodimer-1 ile lekeleyin.
14. 1x PBS ile duruladıktan sonra, bir floresan mikroskop kullanarak hücreleri görselleştirin. Adım 5.12'de açıklanan adımları kullanarak canlı ve ölü hücreleri sayın. Hücre canlılığını, toplam hücreler (hem canlı hem de ölü hücreler) başına canlı hücrelerin (kalsein-ile boyanmış) yüzdesi olarak hesaplayın.

Sonuçlar

GRIN lens tabanlı in situ görüntüleme yöntemi, trakeal iç lümenin in situ olarak görüntülenmesini sağlayabilir (Şekil 5A). Bu görüntüleme yöntemi kullanılarak doğal ve deepitelize trakeaların hem parlak alan hem de floresan görüntüleri elde edilebilir (Şekil 5B,C). CFSE etiketlemesinden önce doğal trakeadan floresan sinyal gözlenmedi (Şekil 5Bii). Bununla birlikte, trakea...

Tartışmalar

Bu çalışmada, (i) hücre çıkarılması ve eksojen hücre iletiminden sonra trakea lümeninin in situ olarak izlenmesine ve (ii) hücre tohumlu trakea dokusunun uzun süreli in vitro kültürüne izin verebilen görüntüleme rehberliğinde bir biyoreaktör oluşturduk. Bu özel yapım biyoreaktörü kullanarak, (i) deterjan ve titreşim destekli hava yolu yıkama kullanarak endojen epitel hücrelerinin trakea lümeninden seçici olarak çıkarıldığını ve (ii) hücre yüklü kollajen I pre-jeli...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1× PBS	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10-010-031
3-port connector	World Precision Instruments	14048-20
4-port connector	World Precision Instruments	14047-10
Accelerometer	STMicroelectronics	IIS3DWBTR
Achromatic doublet	Thorlabs	AC254-150-A-ML
Aluminum pin stub	TED PELLA	16111
Antibiotic-antimycotic	Thermo Fisher Scientific	15240062
Assembly rod	Thorlabs	ER1
Button head screws	McMaster-Carr	91255A274
Cage cube	Thorlabs	C4W
Carbon double-sided conductive tape	TED PELLA	16073
CFSE labelling kit	Abcam	ab113853
Citrisolv (clearing agent)	Decon	1061
C-mount adapter	Thorlabs	SM1A9
Collagen I	Advanced BioMatrix	5153
Conductive liquid silver paint	TED PELLA	16034
Dichroic mirror	Semrock	DI03-R488	Reflected laser wavelengths:  473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm
Dulbecco's modified Eagle’s medium	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11965118
Female luer bulkhead to hose barb adapter	Cole-Parmer	EW-45501-30
Female luer to tubing barb	Cole-Parmer	EW-45508-03
Female to male luer connector	Cole-Parmer	ZY-45508-80
Fetal bovine serum	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10082147
Filter lens	Chroma Technology Corp	ET535/50m
Fluorescent microscope	Nikon	Eclipse E1000 - D
Fusion 360	Autodesk
Hex nut	McMaster-Carr	91813A160
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Fisher Scientifc	AC120585000
Imaging fiber	SELFOC, NSG group	GRIN lens
Laser	Opto Engine	MDL-D-488-150mW
Lens tubes	Thorlabs	SM1L40
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen)	Thermo Fisher Scientific	L3224
MACH 3 CNC Control Software	Newfangled Solutions
Objective lens	Olympus	UCPLFLN20X
Peristaltic Pump	Cole Parmer	L/S standard digital pump system
Recombinant human FGF-basic	PeproTech	100-18B
Retaining ring	Thorlabs	SM1RR
Scientific CMOS camera	PCO Panda	PCO Panda 4.2
Sodium dodecyl sulfate	VWR	97064-472
Solidworks (2019)	Dassault Systèmes
Stackable lens tube	Thorlabs	SM1L10
Subwoofer plate amplifier	Dayton Audio	SPA250DSP
Subwoofer speaker	Dayton Audio	RSS21OHO-4	Diaphragm diameter: 21 cm
Syringe Pump	World Precision Instruments	AL-4000
Threaded cage plate	Thorlabs	CP33
Threaded luer adapter	Cole-Parmer	EW-45513-81
Tube lens	Thorlabs	AC254-150-A-ML
Tygon Tubing	Cole-Parmer	13-200-110
XY Translator	Thorlabs	CXY1