יצירת כדורי רקמות באמצעות מכשיר דמוי בול מודפס בתלת מימד

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה לייצור ספרואידים רקמתיים בקנה מידה גדול וחסכוניים באמצעות מכשיר דמוי בול מודפס בתלת-ממד.

Abstract

ההתקדמות בתרביות תאים תלת-ממדיות פיתחה מודלים פיזיולוגיים יותר רלוונטיים במבחנה , כגון ספרואידים של רקמות. לתאים המעובדים כספרואידים יש תגובות ביולוגיות מציאותיות יותר הדומות לסביבה in vivo . בשל יתרונותיהם, ספרואידים רקמתיים מייצגים מגמה מתפתחת לעבר מודלים מעולים, אמינים יותר ומנבאים יותר עם מגוון רחב של ישימות ביוטכנולוגית. עם זאת, פלטפורמות ניתנות לשחזור שיכולות להשיג ייצור בקנה מידה גדול של ספרואידים רקמתיים הפכו לצורך שלא נענה בחקירה מלאה והגברת הפוטנציאל שלהם. כאן, הייצור בקנה מידה גדול של כדורי רקמות הומוגניים מדווח באמצעות מתודולוגיה זולה וחסכונית בזמן. מכשיר דמוי בול מודפס בתלת-ממד פותח כדי לייצר עד 4,716 ספרואידים לכל צלחת בעלת 6 בארות. המכשיר מיוצר בשיטת הסטריאוליתוגרפיה באמצעות שרף הניתן לצילום. המכשיר הסופי מורכב ממיקרופינים גליליים, בגובה של 1.3 מ"מ וברוחב של 650 מיקרומטר. גישה זו מאפשרת יצירה מהירה של ספרואידים הומוגניים וספרואידים בתרבית משותפת עם צורה וגודל אחידים ויכולת קיום תא של >95%. יתר על כן, המכשיר דמוי הבול מתאים לגדלים שונים של צלחות באר וצלחות פטרי. הוא מעוקר בקלות וניתן לעשות בו שימוש חוזר לתקופות ארוכות. הייצור היעיל בקנה מידה גדול של ספרואידים הומוגניים של רקמות חיוני כדי למנף את תרגומם לתחומים רבים בתעשייה, כגון הנדסת רקמות, פיתוח תרופות, מידול מחלות ורפואה מותאמת אישית לפי דרישה.

Introduction

ספרואידים רקמתיים הם מיקרו-רקמות תלת-ממדיות הנוצרות על ידי מתלי תאים העוברים הרכבה עצמית ללא כוחות חיצוניים¹. ספרואידים אלה היו בשימוש נרחב בפרוטוקולי ייצור ביולוגי בשל הדמיון שלהם עם תכונות מפתח של המערכת הפיזיולוגית האנושית ^2,3. ספרואידים רקמתיים מספקים מטבוליזם דומה, דינמיקה של שלד, יכולת קיום של תאים ופעילות מטבולית והפרשה דומים יותר מאשר תרבית תאים חד-שכבתית מסורתית¹. בשל יכולת ההיתוך שלהם, הם יכולים לשמש גם כאבני בניין (למשל, פרוטוקולי הדפסה ביולוגית) ליצירת מבנים מורכבים מהונדסים רקמות עם רלוונטיות ביולוגית משופרת ^4,5.

בשל הרלוונטיות הביולוגית שלהם, ספרואידים של רקמות שימשו ככלי ביוטכנולוגי לפרוטוקולים הנעים בין הנדסת רקמות, פיתוח תרופות, מידול מחלות והערכה ננוטוקסיקולוגית, הפחתת זמן, עלויות מקום וניסויים^בבעלי חיים 3,6,7,8. עם זאת, כדי לחקור ולמנף באופן מלא את הפוטנציאל של ספרואידים רקמות, שיטות אמינות וניתנות לשחזור המכוונות לייצור בקנה מידה גדול שלהם נחוצות מאוד, ואלה נותרו אתגר מתמשך.

מספר מתודולוגיות מייצרות ספרואידים, כגון טיפה תלויה, בארות תחתונות מצופות בצורת U, מיקרופלואידיקה, ושימוש במטריצה פולימרית ^9,10. למרות שמתודולוגיות אלה סללו את הדרך בשוק הייצור הכדורי, הן עדיין מורכבות, גוזלות זמן, דורשות עבודה רבה או יקרות¹⁰.

הפרוטוקול הנוכחי מדווח על ייצור בקנה מידה גדול של ספרואידים הומוגניים של רקמות תוך שימוש במתודולוגיה זולה וחסכונית בזמן. פיתחנו מכשיר דמוי בול מודפס בתלת-ממד כדי לייצר עד 4,716 ספרואידים לכל צלחת של 6 בארות. יתר על כן, ניתן להתאים את המכשיר דמוי הבול לייצור יותר ספרואידים לכל באר, המתאימים לצלחות תרבית תאים שונות. הוא ניתן לחיטוי בקלות וניתן לעשות בו שימוש חוזר לתקופות ארוכות. הייצור היעיל בקנה מידה גדול של ספרואידים הומוגניים של רקמות חיוני לתרגום השימוש בהם למרפאות, ותורם לתחומים רבים בתעשייה כגון הנדסת רקמות, פיתוח תרופות, מידול מחלות ורפואה מותאמת אישית לפי דרישה.

Protocol

קו התאים L929, פיברובלסטים של עכברים, שימש במחקר הנוכחי. המכשיר הביולוגי דמוי הבול המודפס בתלת-ממד התקבל ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים). תרגול תרבית תאים טובה וטכניקות סטריליות בוצעו לאורך כל הפרוטוקול. המכשיר המפוברק עוקר על ידי ניגובו עם 70% אלכוהול וחשיפתו לאור UV למשך 15 דקות. המדיה והתמיסות של תרביות התאים חוממו לטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני המגע עם התאים או עם כדורי הרקמה. ייצוג סכמטי של הפרוטוקול מוצג באיור 1.

1. הכנת תבניות לא דבקות מהמכשיר דמוי הבול

1. הכינו ג'ל אגרוז 2% (w/v) לפי השלבים הבאים.
   1. לדלל את אבקת האגרוז במי מלח חוצצים פוספט (1x PBS) והומוגניזציה של המתלה שנוצר עם תנועות מעגליות.
      הערה: ניתן להניח פתרון זה בבקבוק זכוכית. בשלב זה, פתרון האגרוז לא יהיה שקוף.
   2. הכניסו את בקבוק הזכוכית למיקרוגל והניחו אותו ל-30 שניות. כל 5 שניות, לעצור את המיקרוגל, להסיר את בקבוק זכוכית, באופן ידני homogenize עם תנועות מעגליות. תהליך החימום צריך להתבצע עד שהתמיסה מגיעה למצב נוזלי-צולע.
      הערה: פלטה חמה יכולה לשמש גם כחלופה למיקרוגל. לאחר תהליך החימום, התמיסה חייבת להיות שקופה/צולעת.
   3. הוסף 1 מ"ל של תמיסת אגרוז לכל באר של צלחת 6 בארות המתוכננת לניסוי.
   4. המתן ~ 15 דקות או עד שהאגרוז יתמצק.
      הערה: ניתן להשתמש בלוח קירור כדי לקצר את זמן ההתמצקות.
   5. מוסיפים 1-2 מ"ל של תמיסת האגרוז ומכניסים בעדינות את המכשיר מעל האגרוז הנוזלי.
      הערה: מיקום המכשיר חייב להיעשות בזהירות כדי למנוע בועות אוויר בממשק מכשיר האגרוז.
   6. המתן ~ 30 דקות או עד שהאגרוז יתמצק.
      הערה: ניתן להשתמש בלוח קירור כדי לקצר את זמן ההתמצקות.
   7. הסר בעדינות את המכשיר מהאגרוז.
      הערה: ההסרה היא קריטית. יש להסיר אותו בזהירות כדי לשמור על תכונות האגרוז שלמות; אחרת, האגרוז יכול להיות משובש.
   8. הוסף 2 מ"ל של מדיה DMEM, המתן 10 דקות, השליך את המדיה והחלף אותה ב- DMEM טרי. חזור על כך שלוש פעמים כדי לשטוף את הבאר כראוי.
   9. הוסיפו 2 מ"ל DMEM והניחו את צלחת 6 הקידוחים באינקובטור (בטמפרטורה של 37°C ב-5% CO₂ ו-80% לחות) עד לזריעת התא (איור 2A-F, סרטון משלים 1).

2. דור של כדורי רקמות

הערה: לשושלות תאים שונות יש תכונות הידבקות שונות. לפיכך, באמצעות מתודולוגיה זו, סוגים מסוימים של תאים עשויים שלא ליצור את כדורי הרקמה כראוי.

1. לגדל את התאים בעקבות תרבית חד-שכבתית מסורתית (כלומר, לגדל את התאים בצלוחיות תרבית תאים באמצעות DMEM עם גלוקוז נמוך בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS), 100 מיקרוגרם / מ"ל פניצילין, ו 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין) (ראה טבלת חומרים). שמור על התאים ב 37 ° C באינקובטור 5% CO₂ , ולפקח עד שהם מגיעים 80% של מפגש.
2. לאחר ההגעה למפגש הרצוי, לשטוף את התאים עם 1x PBS.
   הערה: מומלץ להשתמש 5 מ"ל עבור 25 ס"מ² צלוחיות, 10 מ"ל עבור 75 ס"מ² צלוחיות, ו 15 מ"ל עבור 150 ס"מ² צלוחיות.
3. מוסיפים את אנזים הדיסוציאציה ודגורים על התאים במשך 2-5 דקות בטמפרטורה של 37°C ב-5% CO₂ ו-80% לחות.
   הערה: המחקר הנוכחי השתמש ב-0.125% טריפסין עם 0.78 מילימטר חומצה טטראצטית אתילאנדיאמין (EDTA) כאנזים הדיסוציאציה (ראה טבלת חומרים).
4. שימו לב לניתוק התאים מצלוחיות תרבית התאים והוסיפו מדיום גידול בתוספת FBS כדי לנטרל את אנזים הדיסוציאציה של התא.
   הערה: במחקר הנוכחי, DMEM עם גלוקוז נמוך (ראה טבלת חומרים) שימש בתוספת 10% FBS.
5. צנטריפוגה את מתלה התא ב 400 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, ספור את התאים באופן ידני.
6. קח 50 x 10⁵ תאים לכל צינור ולהוסיף 5 מ"ל של 1x PBS.
   הערה: מספר התאים שנזרעו משפיע על קוטר הרקמה הסופית. לפיכך, ניתן להגדיל את מספר התא כדי ליצור כדורי רקמות בקטרים גדולים יותר.
7. צנטריפוגה את מתלה התא ב 400 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
8. מוציאים את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה, מוסיפים 1 מ"ל ממדיום תרבית התא, ומהומוגניים את התמיסה.
   הערה: במחקר הנוכחי נעשה שימוש בתרבית שלמה של DMEM עם גלוקוז נמוך, בתוספת 10% FBS, 100 מיקרוגרם/מ"ל פניצילין וסטרפטומיצין 100 מק"ג/מ"ל.
9. הסר 2 מ"ל של מדיום מהצלחת 6 בארות (שלב 1.1.9) והוסף 1 מ"ל של תרחיף התא למרכז תבנית האגרוז שנוצרה על ידי הביו-התקן המודפס בתלת-ממד (שלב 1.1.7). המתן עד שקיעת התאים בכריתות המיקרו (~ 20-30 דקות) והוסף בזהירות 1 מ"ל של מדיום תרבית תאים לבאר.
   הערה: יש להיות זהירים במיוחד בשלב זה. מומלץ להוסיף בעדינות את המדיום, למקם את קצה הפיפטה קרוב לדופן הבאר ולהוציא בכמויות קטנות.
10. הניחו את צלחת 6 הקידוחים באינקובטור (בטמפרטורה של 37°C ב-5%_CO2 ו-80% לחות) כדי שייווצרו כדורי הרקמה (בערך 24-48 שעות, תלוי בסוג התא) (איור 3).
    הערה: לסוגי תאים שונים (למשל, תאים סרטניים, תאים ראשוניים) יש קינטיקה שונה של הרכבה עצמית¹¹.

תוצאות

יצירת מיקרו-כריתות הומוגניות באמצעות מכשיר דמוי בול מודפס בתלת מימד
המכשיר דמוי הבול המודפס בתלת-ממד יוצר בהצלחה בשיטת סטריאוליתוגרפיה¹² באמצעות שרף הניתן לריפוי (איור 2A). המכשיר הסופי הורכב ממיקרופינים גליליים בגובה של 1.3 מ"מ ובר?...

Discussion

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה פשוטה, מהירה וזולה לייצור בקנה מידה גדול של ספרואידים ברקמות. מכשיר דמוי בול מודפס בתלת-ממד שימש כתבנית אב, שיצרה עד 4,716 ספרואידים לכל צלחת בעלת 6 בארות. הוכח כי לתאים המעובדים כספרואידים יש תגובות ביולוגיות מציאותיות יותר הדומות מאוד לסביבה i...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well plate	Merck	CLS3516
Agarose	Promega	V3121
Biodevice	Bioedtech
Biological Safety Cabinet	ThermoFisher	51029701
Centrifugue	ThermoFisher	75004031
Corning 50 mL centrifuge tubes	Merck	CLS430829-500EA
Corning cell culture flasks surface area 75 cm2	Merck	CLS430641
Draft Resin	FormLabs	FLDRBL01
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - low glucose	Merck	D6046
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher	16000044
Form 2	FormLabs
Incubator	ThermoFisher	51033782
L929 cell lines	Stablished in the lab
Penicillin and Streptomycin (PS)	ThermoFisher	15140122
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Merck	806552
Trypsin with EDTA	Merck	T3924