Generazione di sferoidi tissutali tramite un dispositivo simile a un timbro stampato in 3D

Riepilogo

Il presente protocollo descrive una tecnica per produrre sferoidi tissutali su larga scala in modo economico utilizzando un dispositivo simile a un timbro stampato in 3D.

Abstract

I progressi nella coltura cellulare 3D hanno sviluppato modelli in vitro più rilevanti dal punto di vista fisiologico, come gli sferoidi tissutali. Le cellule coltivate come sferoidi hanno risposte biologiche più realistiche che assomigliano all'ambiente in vivo . Grazie ai loro vantaggi, gli sferoidi tissutali rappresentano una tendenza emergente verso modelli di studio superiori, più affidabili e più predittivi con un'ampia gamma di applicabilità biotecnologica. Tuttavia, le piattaforme riproducibili in grado di raggiungere la produzione su larga scala di sferoidi tissutali sono diventate un'esigenza insoddisfatta per esplorare appieno e potenziare il loro potenziale. In questo articolo, la produzione su larga scala di sferoidi tissutali omogenei è riportata utilizzando una metodologia a basso costo ed efficace in termini di tempo. È stato sviluppato un dispositivo simile a un timbro stampato in 3D per generare fino a 4.716 sferoidi per piastra a 6 pozzetti. Il dispositivo è fabbricato con il metodo della stereolitografia utilizzando una resina fotopolimerizzabile. Il dispositivo finale è composto da micropin cilindrici, con un'altezza di 1,3 mm e una larghezza di 650 μm. Questo approccio consente la rapida generazione di sferoidi omogenei e sferoidi co-coltivati con forma e dimensioni uniformi e vitalità cellulare del >95%. Inoltre, il dispositivo a forma di timbro è sintonizzabile per piastre a pozzetti di diverse dimensioni e piastre di Petri. È facilmente sterilizzabile e può essere riutilizzato per lunghi periodi. L'efficiente produzione su larga scala di sferoidi tissutali omogenei è essenziale per sfruttare la loro traduzione per molteplici aree industriali, come l'ingegneria tissutale, lo sviluppo di farmaci, la modellazione di malattie e la medicina personalizzata su richiesta.

Introduzione

Gli sferoidi tissutali sono micro-tessuti 3D formati da sospensioni cellulari che subiscono l'autoassemblaggio senza forze esterne¹. Questi sferoidi sono stati ampiamente utilizzati nei protocolli di biofabbricazione grazie alla loro somiglianza con le caratteristiche chiave del sistema fisiologico umano ^2,3. Gli sferoidi tissutali forniscono un metabolismo, una dinamica del citoscheletro, una vitalità cellulare e un'attività metabolica e secrezionale più simili rispetto alle tradizionali colture cellulari monostrato¹. Grazie alla loro capacità di fusione, possono anche essere utilizzati come elementi costitutivi (ad esempio, protocolli di bioprinting) per formare complessi costrutti di ingegneria tissutale con una maggiore rilevanza biologica ^4,5.

A causa della loro rilevanza biologica, gli sferoidi tissutali sono stati utilizzati come strumento biotecnologico per protocolli che spaziano dall'ingegneria tissutale, allo sviluppo di farmaci, alla modellazione di malattie e alla valutazione nanotossicologica, riducendo i tempi, i costi di spazio e i test sugli animali 3,6,7,8. Ciononostante, per esplorare appieno e sfruttare appieno il potenziale degli sferoidi tissutali, sono altamente necessari metodi affidabili e riproducibili che mirino alla loro produzione su larga scala, e questi rimangono una sfida continua.

Diverse metodologie producono sferoidi, come gocce sospese, pozzetti di fondo a forma di U rivestiti, microfluidica e utilizzando una matrice polimerica ^9,10. Sebbene queste metodologie abbiano aperto la strada all'interno del mercato della produzione di sferoidi, sono ancora complesse, dispendiose in termini di tempo, laboriose o costose¹⁰.

Il presente protocollo riporta la produzione su larga scala di sferoidi tissutali omogenei utilizzando una metodologia a basso costo ed efficace in termini di tempo. Abbiamo sviluppato un dispositivo simile a un timbro stampato in 3D per generare fino a 4.716 sferoidi per piastra a 6 pozzetti. Inoltre, il dispositivo a forma di timbro può essere personalizzato per produrre più sferoidi per pozzetto, adatto a diverse piastre di coltura cellulare. È facilmente sterilizzabile e può essere riutilizzato per lunghi periodi. L'efficiente produzione su larga scala di sferoidi tissutali omogenei è essenziale per tradurre il loro uso nelle cliniche, contribuendo a molteplici aree dell'industria come l'ingegneria tissutale, lo sviluppo di farmaci, la modellazione delle malattie e la medicina personalizzata su richiesta.

Protocollo

La linea cellulare L929, fibroblasti di topo, è stata utilizzata per il presente studio. Il biodispositivo stampato in 3D simile a un francobollo è stato ottenuto da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). Durante tutto il protocollo sono state seguite buone pratiche di coltura cellulare e tecniche sterili. Il dispositivo fabbricato è stato sterilizzato strofinandolo con alcol al 70% ed esponendolo alla luce UV per 15 minuti. I terreni di coltura cellulare e le soluzioni sono stati riscaldati a 37 °C prima di entrare in contatto con le cellule o gli sferoidi tissutali. Una rappresentazione schematica del protocollo è mostrata nella Figura 1.

1. Preparazione di stampi non aderenti dal dispositivo a timbro

1. Preparare il gel di agarosio al 2% (p/v) seguendo i passaggi seguenti.
   1. Diluire la polvere di agarosio in soluzione salina tamponata con fosfato (1x PBS) e omogeneizzare la sospensione risultante con movimenti circolari.
      NOTA: Questa soluzione può essere inserita in una bottiglia di vetro. In questa fase, la soluzione di agarosio non sarà traslucida.
   2. Metti la bottiglia di vetro nel microonde e impostala per 30 s. Ogni 5 s, fermare il microonde, rimuovere la bottiglia di vetro e omogeneizzare manualmente la soluzione con movimenti circolari. Il processo di riscaldamento deve essere eseguito fino a quando la soluzione non raggiunge uno stato liquido-limpido.
      NOTA: Una piastra riscaldante può essere utilizzata anche come alternativa al microonde. Dopo il processo di riscaldamento, la soluzione deve essere traslucida/limpida.
   3. Aggiungere 1 mL di soluzione di agarosio a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti prevista per l'esperimento.
   4. Attendere ~15 minuti o fino a quando l'agarosio non si solidifica.
      NOTA: Una piastra di raffreddamento può essere utilizzata per ridurre il tempo di solidificazione.
   5. Aggiungere 1-2 ml di soluzione di agarosio e inserire delicatamente il dispositivo sopra l'agarosio liquido.
      NOTA: Il posizionamento del dispositivo deve essere eseguito con attenzione per evitare bolle d'aria nell'interfaccia agarosio-dispositivo.
   6. Attendere ~30 minuti o fino a quando l'agarosio non si solidifica.
      NOTA: Una piastra di raffreddamento può essere utilizzata per ridurre il tempo di solidificazione.
   7. Rimuovere delicatamente il dispositivo dall'agarosio.
      NOTA: La rimozione è fondamentale. Bisogna rimuoverlo con cura per mantenere intatte le caratteristiche dell'agarosio; In caso contrario, l'agarosio può essere interrotto.
   8. Aggiungere 2 ml di supporto DMEM, attendere 10 minuti, eliminare il supporto e sostituirlo con DMEM nuovo. Ripeti l'operazione tre volte per lavare correttamente il pozzo.
   9. Aggiungere 2 mL di DMEM e posizionare la piastra a 6 pozzetti in un incubatore (a 37 °C con 5% di CO₂ e 80% di umidità) fino alla semina della cella (Figura 2A-F, Video supplementare 1).

2. Generazione di sferoidi tissutali

NOTA: Diverse linee cellulari hanno proprietà di adesione diverse. Quindi, utilizzando questa metodologia, alcuni tipi di cellule potrebbero non formare correttamente gli sferoidi tissutali.

1. Far crescere le cellule seguendo la tradizionale coltura monostrato (cioè, far crescere le cellule in fiasche di coltura cellulare utilizzando DMEM a basso contenuto di glucosio integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 100 μg/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina) (vedi Tabella dei materiali). Mantenere le celle a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ e monitorare fino a quando non raggiungono l'80% di confluenza.
2. Dopo aver raggiunto la confluenza desiderata, lavare le celle con 1x PBS.
   NOTA: Si consiglia di utilizzare 5 ml per palloni^da 25 cm, 10 ml per palloni da 75 cm² e 15 ml per palloni da 150 cm² .
3. Aggiungere l'enzima di dissociazione e incubare le cellule per 2-5 minuti a 37 °C in 5% di CO₂ e 80% di umidità.
   NOTA: Il presente studio ha utilizzato lo 0,125% di tripsina con 0,78 mM di acido etilendiammina tetraacetico (EDTA) come enzima di dissociazione (vedi Tabella dei materiali).
4. Osservare il distacco delle cellule dai palloni di coltura cellulare e aggiungere un terreno di coltura integrato con FBS per neutralizzare l'enzima di dissociazione cellulare.
   NOTA: Per il presente studio, è stato utilizzato DMEM a basso contenuto di glucosio (vedi Tabella dei materiali) integrato con FBS al 10%.
5. Centrifugare la sospensione cellulare a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Quindi, conta le celle manualmente.
6. Prelevare 50 x 10⁵ cellule per provetta e aggiungere 5 mL di 1x PBS.
   NOTA: Il numero di cellule seminate influenza il diametro finale dello sferoide del tessuto. Quindi, si può aumentare il numero di cellule per generare sferoidi tissutali con diametri maggiori.
7. Centrifugare la sospensione cellulare a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
8. Rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta, aggiungere 1 mL del terreno di coltura cellulare e omogeneizzare la soluzione.
   NOTA: Nel presente studio è stato utilizzato un terreno di coltura completo di DMEM a basso contenuto di glucosio, integrato con FBS al 10%, penicillina 100 μg/mL e streptomicina 100 μg/mL.
9. Rimuovere 2 mL di terreno dalla piastra a 6 pozzetti (passaggio 1.1.9) e aggiungere 1 mL di sospensione cellulare al centro dello stampo di agarosio formato dal biodispositivo stampato in 3D (passaggio 1.1.7). Attendere che le cellule si sedimentino nelle micro resezioni (~20-30 min) e aggiungere con cura 1 mL di terreno di coltura cellulare nel pozzetto.
   NOTA: È necessario prestare particolare attenzione in questo passaggio. Si consiglia di aggiungere delicatamente il terreno, posizionare il puntale della pipetta vicino alla parete del pozzetto ed erogare in piccole quantità.
10. Posizionare la piastra a 6 pozzetti nell'incubatore (a 37 °C con 5% di CO₂ e 80% di umidità) per la formazione degli sferoidi tissutali (circa 24-48 ore, a seconda del tipo di cellula) (Figura 3).
    NOTA: Diversi tipi di cellule (ad esempio, cellule tumorali, cellule primarie) hanno una cinetica di autoassemblaggio diversa¹¹.

Risultati

Generazione di micro resezioni omogenee utilizzando il dispositivo simile a un timbro stampato in 3D
Il dispositivo simile a un timbro stampato in 3D è stato prodotto con successo con il metodo della stereolitografia¹² utilizzando una resina fotopolimerizzabile (Figura 2A). Il dispositivo finale era composto da micropin cilindrici con un'altezza di 1,3 mm e una larghezza di 650 μm (Figura 2A<...

Discussione

Il presente protocollo descrive un metodo semplice, veloce ed economico per la produzione su larga scala di sferoidi tissutali. Come stampo principale è stato utilizzato un dispositivo stampato in 3D simile a un timbro, che ha generato fino a 4.716 sferoidi per piastra a 6 pozzetti. È stato dimostrato che le cellule coltivate come sferoidi hanno risposte biologiche più realistiche che assomigliano molto all'ambiente in vivo ¹. Grazie ai loro vantaggi, ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well plate	Merck	CLS3516
Agarose	Promega	V3121
Biodevice	Bioedtech
Biological Safety Cabinet	ThermoFisher	51029701
Centrifugue	ThermoFisher	75004031
Corning 50 mL centrifuge tubes	Merck	CLS430829-500EA
Corning cell culture flasks surface area 75 cm2	Merck	CLS430641
Draft Resin	FormLabs	FLDRBL01
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - low glucose	Merck	D6046
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher	16000044
Form 2	FormLabs
Incubator	ThermoFisher	51033782
L929 cell lines	Stablished in the lab
Penicillin and Streptomycin (PS)	ThermoFisher	15140122
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Merck	806552
Trypsin with EDTA	Merck	T3924