Geração de esferoides de tecido por meio de um dispositivo semelhante a um selo impresso em 3D

Resumo

O presente protocolo descreve uma técnica para produzir esferoides de tecido em larga escala de forma econômica usando um dispositivo semelhante a um selo impresso em 3D.

Resumo

Os avanços na cultura de células 3D desenvolveram modelos in vitro mais fisiologicamente relevantes, como esferoides de tecido. As células cultivadas como esferóides têm respostas biológicas mais realistas que se assemelham ao ambiente in vivo . Devido às suas vantagens, os esferoides teciduais representam uma tendência emergente em direção a modelos de estudo superiores, mais confiáveis e mais preditivos com uma ampla gama de aplicabilidades biotecnológicas. No entanto, plataformas reprodutíveis que podem alcançar a produção em larga escala de esferoides de tecido tornaram-se uma necessidade não atendida para explorar e aumentar totalmente seu potencial. Aqui, a produção em larga escala de esferoides de tecidos homogêneos é relatada usando uma metodologia de baixo custo e eficiência de tempo. Um dispositivo semelhante a um selo impresso em 3D é desenvolvido para gerar até 4.716 esferoides por placa de 6 poços. O dispositivo é fabricado pelo método de estereolitografia usando uma resina fotocurável. O dispositivo final é composto por micropinos cilíndricos, com altura de 1,3 mm e largura de 650 μm. Essa abordagem permite a geração rápida de esferoides homogêneos e esferoides co-cultivados com forma e tamanho uniformes e viabilidade celular de >95%. Além disso, o dispositivo semelhante a um selo é ajustável para diferentes tamanhos de placas de poços e placas de Petri. É facilmente esterilizado e pode ser reutilizado por longos períodos. A produção eficiente em larga escala de esferoides de tecidos homogêneos é essencial para alavancar sua tradução para várias áreas da indústria, como engenharia de tecidos, desenvolvimento de medicamentos, modelagem de doenças e medicina personalizada sob demanda.

Introdução

Os esferoides teciduais são microtecidos 3D formados por suspensões celulares que se automontam sem forças externas¹. Esses esferoides têm sido amplamente utilizados em protocolos de biofabricação devido à sua semelhança com as principais características do sistema fisiológico humano ^2,3. Os esferoides teciduais fornecem metabolismo, dinâmica do citoesqueleto, viabilidade celular e atividade metabólica e de secreção mais semelhantes do que a cultura de células monocamada tradicional¹. Devido à sua capacidade de fusão, eles também podem ser usados como blocos de construção (por exemplo, protocolos de bioimpressão) para formar construções complexas de engenharia de tecidos com maior relevância biológica ^4,5.

Devido à sua relevância biológica, os esferoides teciduais têm sido utilizados como ferramenta biotecnológica para protocolos que abrangem engenharia de tecidos, desenvolvimento de medicamentos, modelagem de doenças e avaliação nanotoxicológica, reduzindo tempo, custos de espaço e testes em animais 3,6,7,8. No entanto, para explorar e alavancar totalmente o potencial dos esferoides teciduais, métodos confiáveis e reprodutíveis visando sua produção em larga escala são altamente necessários, e continuam sendo um desafio contínuo.

Várias metodologias produzem esferoides, como gota suspensa, poços de fundo em forma de U revestidos, microfluídica e uso de matriz polimérica ^9,10. Embora essas metodologias tenham pavimentado o caminho no mercado de produção de esferoides, elas ainda são complexas, demoradas, trabalhosas ou caras¹⁰.

O presente protocolo relata a produção em larga escala de esferoides de tecido homogêneo usando uma metodologia de baixo custo e eficiência de tempo. Desenvolvemos um dispositivo semelhante a um selo impresso em 3D para gerar até 4.716 esferoides por placa de 6 poços. Além disso, o dispositivo semelhante a um selo pode ser adaptado para produzir mais esferóides por poço, adequado para diferentes placas de cultura de células. É facilmente esterilizável e pode ser reutilizado por longos períodos. A produção eficiente em larga escala de esferoides de tecidos homogêneos é essencial para traduzir seu uso para as clínicas, contribuindo para várias áreas da indústria, como engenharia de tecidos, desenvolvimento de medicamentos, modelagem de doenças e medicina personalizada sob demanda.

Protocolo

A linhagem celular L929, fibroblastos de camundongo, foi utilizada para o presente estudo. O biodispositivo impresso em 3D semelhante a um selo foi obtido de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais). Boas práticas de cultura celular e técnicas estéreis foram seguidas durante todo o protocolo. O dispositivo fabricado foi esterilizado limpando-o com álcool 70% e expondo-o à luz ultravioleta por 15 min. Os meios e soluções de cultura celular foram aquecidos a 37 °C antes de entrar em contato com as células ou esferoides teciduais. Uma representação esquemática do protocolo é mostrada na Figura 1.

1. Preparação de moldes não aderentes a partir do dispositivo semelhante a um selo

1. Prepare o gel de agarose a 2% (p/v) seguindo as etapas abaixo.
   1. Diluir o pó de agarose em solução salina tamponada com fosfato (1x PBS) e homogeneizar a suspensão resultante com movimentos circulares.
      NOTA: Esta solução pode ser colocada em uma garrafa de vidro. Nesta etapa, a solução de agarose não será translúcida.
   2. Coloque a garrafa de vidro no micro-ondas e deixe agir por 30 s. A cada 5 s, pare o micro-ondas, remova o frasco de vidro e homogeneize manualmente a solução com movimentos circulares. O processo de aquecimento precisa ser realizado até que a solução atinja um estado líquido-límpido.
      NOTA: Uma placa quente também pode ser usada como alternativa ao micro-ondas. Após o processo de aquecimento, a solução deve ser translúcida/límpida.
   3. Adicione 1 mL da solução de agarose a cada poço de uma placa de 6 poços planejada para o experimento.
   4. Aguarde ~ 15 min ou até que a agarose solidifique.
      NOTA: Uma placa de resfriamento pode ser usada para diminuir o tempo de solidificação.
   5. Adicione 1-2 mL da solução de agarose e insira suavemente o dispositivo acima da agarose líquida.
      NOTA: A colocação do dispositivo deve ser feita com cuidado para evitar bolhas de ar na interface agarose-dispositivo.
   6. Aguarde ~ 30 min ou até que a agarose solidifique.
      NOTA: Uma placa de resfriamento pode ser usada para diminuir o tempo de solidificação.
   7. Remova cuidadosamente o dispositivo da agarose.
      NOTA: A remoção é crítica. Deve-se removê-lo com cuidado para manter intactas as características da agarose; caso contrário, a agarose pode ser interrompida.
   8. Adicione 2 mL de mídia DMEM, aguarde 10 min, descarte a mídia e substitua-a por DMEM novo. Repita isso três vezes para lavar o poço adequadamente.
   9. Adicione 2 mL de DMEM e coloque a placa de 6 poços em uma incubadora (a 37 ° C em 5% de CO₂ e 80% de umidade) até a semeadura da célula ( Figura 2A-F, Vídeo Suplementar 1 ).

2. Geração de esferóides teciduais

NOTA: Diferentes linhagens celulares têm diferentes propriedades de adesão. Portanto, usando essa metodologia, alguns tipos de células podem não formar os esferóides do tecido adequadamente.

1. Cultive as células após a cultura tradicional de monocamada (ou seja, cultive as células em frascos de cultura de células usando DMEM com baixa glicose suplementada com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 μg/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina) (ver Tabela de Materiais). Manter as células a 37 °C em uma incubadora de CO₂ a 5% e monitorar até atingirem 80% de confluência.
2. Após atingir a confluência desejável, lave as células com 1x PBS.
   NOTA: Recomenda-se o uso de 5 mL para frascos de 25 cm² , 10 mL para frascos de 75 cm² e 15 mL para frascos de 150 cm² .
3. Adicione a enzima de dissociação e incube as células por 2-5 min a 37 ° C em 5% de CO₂ e 80% de umidade.
   NOTA: O presente estudo utilizou tripsina a 0,125% com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,78 mM como enzima de dissociação (ver Tabela de Materiais).
4. Observe o desprendimento das células dos frascos de cultura de células e adicione um meio de crescimento suplementado com FBS para neutralizar a enzima de dissociação celular.
   NOTA: Para o presente estudo, foi utilizado DMEM com baixa glicose (ver Tabela de Materiais) suplementado com 10% de FBS.
5. Centrifugue a suspensão da célula a 400 x g por 5 min em temperatura ambiente. Em seguida, conte as células manualmente.
6. Pegue 50 x 10⁵ células por tubo e adicione 5 mL de 1x PBS.
   NOTA: O número de células semeadas influencia o diâmetro final do esferóide do tecido. Assim, pode-se aumentar o número de células para gerar esferóides de tecido com diâmetros maiores.
7. Centrifugue a suspensão da célula a 400 x g por 5 min em temperatura ambiente.
8. Remover o sobrenadante com uma pipeta, adicionar 1 ml do meio de cultura celular e homogeneizar a solução.
   NOTA: No presente estudo, foi utilizado um meio de cultura completo de DMEM com baixo teor de glicose, suplementado com 10% de FBS, 100 μg/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina.
9. Remova 2 mL de meio da placa de 6 poços (etapa 1.1.9) e adicione 1 mL da suspensão celular ao centro do molde de agarose formado pelo biodispositivo impresso em 3D (etapa 1.1.7). Aguarde até que as células sedimentem nas microressecções (~ 20-30 min) e adicione cuidadosamente 1 mL de meio de cultura celular no poço.
   NOTA: É preciso ter cuidado extra nesta etapa. Recomenda-se adicionar suavemente o meio, colocar a ponta da pipeta perto da parede do poço e dispensar em pequenas quantidades.
10. Coloque a placa de 6 poços na incubadora (a 37 ° C em 5% de CO₂ e 80% de umidade) para que os esferóides do tecido se formem (aproximadamente 24-48 h, dependendo do tipo de célula) (Figura 3).
    NOTA: Diferentes tipos de células (por exemplo, células cancerígenas, células primárias) têm diferentes cinéticas de automontagem¹¹.

Resultados

Geração de microressecções homogêneas usando o dispositivo semelhante a um carimbo impresso em 3D
O dispositivo semelhante a um selo impresso em 3D foi fabricado com sucesso pelo método de estereolitografia¹² usando uma resina fotocurável (Figura 2A). O dispositivo final foi composto por micropinos cilíndricos com altura de 1,3 mm e largura de 650 μm (Figura 2A). Seu uso como ...

Discussão

O presente protocolo descreve um método simples, rápido e barato para a produção em larga escala de esferoides teciduais. Um dispositivo impresso em 3D semelhante a um selo foi usado como molde mestre, que gerou até 4.716 esferoides por placa de 6 poços. Foi demonstrado que as células cultivadas como esferóides têm respostas biológicas mais realistas que se assemelham muito ao ambiente in vivo ¹. Devido às suas vantagens, os esferoides teciduai...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well plate	Merck	CLS3516
Agarose	Promega	V3121
Biodevice	Bioedtech
Biological Safety Cabinet	ThermoFisher	51029701
Centrifugue	ThermoFisher	75004031
Corning 50 mL centrifuge tubes	Merck	CLS430829-500EA
Corning cell culture flasks surface area 75 cm2	Merck	CLS430641
Draft Resin	FormLabs	FLDRBL01
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - low glucose	Merck	D6046
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher	16000044
Form 2	FormLabs
Incubator	ThermoFisher	51033782
L929 cell lines	Stablished in the lab
Penicillin and Streptomycin (PS)	ThermoFisher	15140122
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Merck	806552
Trypsin with EDTA	Merck	T3924