Erzeugung von Gewebesphäroiden über ein 3D-gedrucktes stempelähnliches Gerät

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Technik zur kostengünstigen Herstellung von Gewebesphäroiden in großem Maßstab unter Verwendung eines 3D-gedruckten stempelähnlichen Geräts.

Zusammenfassung

Fortschritte in der 3D-Zellkultur haben physiologisch relevantere In-vitro-Modelle entwickelt, wie z. B. Gewebesphäroide. Zellen, die als Sphäroide kultiviert werden, haben realistischere biologische Reaktionen, die der In-vivo-Umgebung ähneln. Aufgrund ihrer Vorteile stellen Gewebesphäroide einen aufkommenden Trend hin zu überlegenen, zuverlässigeren und prädiktiveren Studienmodellen mit einem breiten Spektrum biotechnologischer Anwendbarkeit dar. Reproduzierbare Plattformen, die eine großtechnische Produktion von Gewebesphäroiden ermöglichen können, sind jedoch zu einem ungedeckten Bedarf geworden, um ihr Potenzial vollständig zu erforschen und zu steigern. In dieser Arbeit wird über die großtechnische Produktion von homogenen Gewebesphäroiden unter Verwendung einer kostengünstigen und zeitsparenden Methode berichtet. Ein 3D-gedrucktes stempelähnliches Gerät wird entwickelt, um bis zu 4.716 Sphäroide pro 6-Well-Platte zu erzeugen. Das Gerät wird durch das Stereolithographie-Verfahren unter Verwendung eines lichthärtenden Harzes hergestellt. Das Endprodukt besteht aus zylindrischen Mikropins mit einer Höhe von 1,3 mm und einer Breite von 650 μm. Dieser Ansatz ermöglicht die schnelle Erzeugung von homogenen Sphäroiden und co-kultivierten Sphäroiden mit einheitlicher Form und Größe und einer Zellviabilität von >95 %. Darüber hinaus ist das stempelähnliche Gerät für unterschiedliche Größen von Well-Platten und Petrischalen abstimmbar. Es ist leicht zu sterilisieren und kann über lange Zeiträume wiederverwendet werden. Die effiziente Produktion von homogenen Gewebesphäroiden in großem Maßstab ist unerlässlich, um ihre Übersetzung für verschiedene Industriebereiche wie Tissue Engineering, Arzneimittelentwicklung, Krankheitsmodellierung und personalisierte On-Demand-Medizin zu nutzen.

Einleitung

Gewebesphäroide sind 3D-Mikrogewebe, die aus Zellsuspensionen gebildet werden, die sich ohne äußere Kräfte selbst organisieren¹. Diese Sphäroide wurden aufgrund ihrer Ähnlichkeit mit Schlüsselmerkmalen des menschlichen physiologischen Systems häufig in Biofabrikationsprotokollen verwendet ^2,3. Gewebesphäroide bieten einen ähnlicheren Stoffwechsel, eine ähnliche Dynamik des Zytoskeletts, eine ähnliche Zellviabilität sowie eine ähnliche Stoffwechsel- und Sekretionsaktivität als herkömmliche Monolayer-Zellkulturen¹. Aufgrund ihrer Fusionsfähigkeit können sie auch als Bausteine (z. B. Bioprinting-Protokolle) verwendet werden, um komplexe Tissue-Engineering-Konstrukte mit erhöhter biologischer Relevanz zu bilden ^4,5.

Aufgrund ihrer biologischen Relevanz wurden Gewebesphäroide als biotechnologisches Werkzeug für Protokolle verwendet, die sich über Gewebezüchtung, Arzneimittelentwicklung, Krankheitsmodellierung und nanotoxikologische Bewertung erstrecken, wodurch Zeit, Platzkosten und Tierversuche reduziert wurden 3,6,7,8. Um das Potenzial von Gewebesphäroiden jedoch vollständig zu erforschen und zu nutzen, sind zuverlässige und reproduzierbare Methoden, die auf ihre großtechnische Produktion abzielen, dringend erforderlich, und dies bleibt eine anhaltende Herausforderung.

Mehrere Verfahren stellen Sphäroide her, wie z. B. hängende Tropfen, beschichtete U-förmige Bodenvertiefungen, Mikrofluidik und die Verwendung einer polymeren Matrix ^9,10. Obwohl diese Methoden den Weg auf dem Markt für die Herstellung von Sphäroiden geebnet haben, sind sie immer noch komplex, zeitaufwändig, arbeitsintensiv oder teuer¹⁰.

Das vorliegende Protokoll berichtet über die großtechnische Produktion von homogenen Gewebesphäroiden unter Verwendung einer kostengünstigen und zeitsparenden Methodik. Wir haben ein 3D-gedrucktes stempelähnliches Gerät entwickelt, mit dem bis zu 4.716 Sphäroide pro 6-Well-Platte erzeugt werden können. Darüber hinaus kann das stempelähnliche Gerät so angepasst werden, dass es mehr Sphäroide pro Vertiefung produziert, die für verschiedene Zellkulturplatten geeignet sind. Es ist leicht sterilisierbar und kann über lange Zeiträume wiederverwendet werden. Die effiziente Produktion von homogenen Gewebesphäroiden in großem Maßstab ist unerlässlich, um ihren Einsatz in die Kliniken zu übertragen und trägt zu mehreren Industriebereichen bei, wie z. B. Tissue Engineering, Arzneimittelentwicklung, Krankheitsmodellierung und personalisierte On-Demand-Medizin.

Protokoll

Die L929-Zelllinie, Mausfibroblasten, wurde für die vorliegende Studie verwendet. Das stempelähnliche 3D-gedruckte Biogerät wurde aus einer kommerziellen Quelle bezogen (siehe Materialtabelle). Während des gesamten Protokolls wurden gute Zellkulturpraktiken und sterile Techniken befolgt. Das hergestellte Gerät wurde sterilisiert, indem es mit 70% Alkohol abgewischt und 15 Minuten lang UV-Licht ausgesetzt wurde. Die Zellkulturmedien und -lösungen wurden auf 37 °C erwärmt, bevor sie mit den Zellen oder Gewebesphäroiden in Kontakt kamen. Eine schematische Darstellung des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Vorbereitung von nicht anhaftenden Formen aus der stempelartigen Vorrichtung

1. Bereiten Sie 2% (w/v) Agarose-Gel vor, indem Sie die folgenden Schritte befolgen.
   1. Verdünnen Sie das Agarosepulver in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS) und homogenisieren Sie die resultierende Suspension mit kreisenden Bewegungen.
      HINWEIS: Diese Lösung kann in eine Glasflasche gefüllt werden. In diesem Schritt ist die Agaroselösung nicht durchscheinend.
   2. Stellen Sie die Glasflasche in die Mikrowelle und stellen Sie sie auf 30 s ein. Stoppen Sie alle 5 s die Mikrowelle, nehmen Sie die Glasflasche heraus und homogenisieren Sie die Lösung manuell mit kreisenden Bewegungen. Der Erhitzungsprozess muss so lange durchgeführt werden, bis die Lösung einen flüssig-klaren Zustand erreicht.
      HINWEIS: Eine Kochplatte kann auch als Mikrowellenalternative verwendet werden. Nach dem Erhitzungsprozess muss die Lösung durchscheinend/klar sein.
   3. Geben Sie 1 ml der Agaroselösung in jede Vertiefung einer für das Experiment geplanten 6-Well-Platte.
   4. Warten Sie ~15 Minuten oder bis die Agarose fest wird.
      HINWEIS: Eine Kühlplatte kann verwendet werden, um die Erstarrungszeit zu verkürzen.
   5. Geben Sie 1-2 mL der Agaroselösung hinzu und führen Sie das Gerät vorsichtig über die flüssige Agarose ein.
      HINWEIS: Die Platzierung des Geräts muss sorgfältig erfolgen, um Luftblasen in der Schnittstelle zwischen Agarose und Gerät zu vermeiden.
   6. Warten Sie ~30 min oder bis die Agarose fest wird.
      HINWEIS: Eine Kühlplatte kann verwendet werden, um die Erstarrungszeit zu verkürzen.
   7. Nehmen Sie das Gerät vorsichtig aus der Agarose.
      HINWEIS: Die Entfernung ist kritisch. Man sollte es vorsichtig entfernen, um die Agarose-Merkmale intakt zu halten; Andernfalls kann die Agarose gestört werden.
   8. Fügen Sie 2 ml DMEM-Medium hinzu, warten Sie 10 Minuten, entsorgen Sie das Medium und ersetzen Sie es durch frisches DMEM. Wiederholen Sie dies dreimal, um die Mulde richtig zu waschen.
   9. Fügen Sie 2 mL DMEM hinzu und stellen Sie die 6-Well-Platte in einen Inkubator (bei 37 °C bei 5 % CO₂ und 80 % Luftfeuchtigkeit), bis die Zellen ausgesät sind (Abbildung 2A-F, Ergänzendes Video 1).

2. Erzeugung von Gewebesphäroiden

HINWEIS: Unterschiedliche Zelllinien haben unterschiedliche Adhäsionseigenschaften. Daher kann es bei dieser Methode vorkommen, dass einige Zelltypen die Gewebesphäroide nicht richtig bilden.

1. Züchten Sie die Zellen nach herkömmlicher Monolayer-Kultur (d. h. züchten Sie die Zellen in Zellkulturflaschen unter Verwendung von DMEM mit niedrigem Glukosegehalt, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 100 μg/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin) (siehe Materialtabelle). Halten Sie die Zellen in einem 5 % CO₂ -Inkubator bei 37 °C und überwachen Sie, bis sie 80 % der Konfluenz erreichen.
2. Nach Erreichen der gewünschten Konfluenz waschen Sie die Zellen mit 1x PBS.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, 5 mL für 25 cm² Flaschen, 10 mL für 75 cm² Flaschen und 15 mL für 150 cm² Flaschen zu verwenden.
3. Fügen Sie das Dissoziationsenzym hinzu und inkubieren Sie die Zellen für 2-5 min bei 37 °C bei 5 % CO₂ und 80 % Luftfeuchtigkeit.
   HINWEIS: In der vorliegenden Studie wurden 0,125 % Trypsin mit 0,78 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) als Dissoziationsenzym verwendet (siehe Materialtabelle).
4. Beobachten Sie die Ablösung der Zellen von den Zellkulturkolben und fügen Sie ein mit FBS ergänztes Wachstumsmedium hinzu, um das Zelldissoziationsenzym zu neutralisieren.
   HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurde DMEM mit niedrigem Glukosespiegel (siehe Materialtabelle) verwendet, ergänzt mit 10 % FBS.
5. Die Zellsuspension wird bei 400 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Zählen Sie dann die Zellen manuell.
6. Nehmen Sie 50 x 10⁵ Zellen pro Röhrchen und fügen Sie 5 ml 1x PBS hinzu.
   HINWEIS: Die Anzahl der ausgesäten Zellen beeinflusst den endgültigen Durchmesser des Gewebesphäroids. Daher kann man die Zellzahl erhöhen, um Gewebesphäroide mit größeren Durchmessern zu erzeugen.
7. Die Zellsuspension wird bei 400 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert.
8. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette, fügen Sie 1 ml des Zellkulturmediums hinzu und homogenisieren Sie die Lösung.
   HINWEIS: In der vorliegenden Studie wurde ein vollständiges Nährmedium aus DMEM mit niedrigem Glukosegehalt, ergänzt mit 10 % FBS, 100 μg/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin, verwendet.
9. Entfernen Sie 2 mL Medium von der 6-Well-Platte (Schritt 1.1.9) und geben Sie 1 ml der Zellsuspension in die Mitte der Agaroseform, die durch das 3D-gedruckte Biogerät gebildet wird (Schritt 1.1.7). Warten Sie, bis sich die Zellen in den Mikroresektionen sedimentieren (~20-30 min) und geben Sie vorsichtig 1 mL Zellkulturmedium in die Vertiefung.
   HINWEIS: In diesem Schritt muss man besonders vorsichtig sein. Es wird empfohlen, das Medium vorsichtig hinzuzufügen, die Pipettenspitze nahe an der Well-Wand zu platzieren und in kleinen Mengen zu dosieren.
10. Legen Sie die 6-Well-Platte in den Inkubator (bei 37 °C bei 5 % CO₂ und 80 % Luftfeuchtigkeit), damit sich die Gewebesphäroide bilden können (ca. 24-48 h, je nach Zelltyp) (Abbildung 3).
    HINWEIS: Unterschiedliche Zelltypen (z. B. Krebszellen, Primärzellen) haben eine unterschiedliche Selbstorganisationskinetik¹¹.

Ergebnisse

Erzeugung von homogenen Mikroresektionen mit dem 3D-gedruckten stempelähnlichen Gerät
Das 3D-gedruckte stempelähnliche Gerät wurde erfolgreich durch das Stereolithographie-Verfahren¹² unter Verwendung eines lichthärtenden Harzes hergestellt (Abbildung 2A). Das endgültige Gerät bestand aus zylindrischen Mikropins mit einer Höhe von 1,3 mm und einer Breite von 650 μm (Abbildung 2A

Diskussion

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein einfaches, schnelles und kostengünstiges Verfahren zur großtechnischen Herstellung von Gewebesphäroiden. Als Urform wurde ein stempelähnliches 3D-gedrucktes Gerät verwendet, das bis zu 4.716 Sphäroide pro 6-Well-Platte erzeugte. Es wurde gezeigt, dass Zellen, die als Sphäroide kultiviert werden, realistischere biologische Reaktionen aufweisen, die der In-vivo-Umgebung sehr ähnlich sind¹. Aufgrund ihrer Vort...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well plate	Merck	CLS3516
Agarose	Promega	V3121
Biodevice	Bioedtech
Biological Safety Cabinet	ThermoFisher	51029701
Centrifugue	ThermoFisher	75004031
Corning 50 mL centrifuge tubes	Merck	CLS430829-500EA
Corning cell culture flasks surface area 75 cm2	Merck	CLS430641
Draft Resin	FormLabs	FLDRBL01
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - low glucose	Merck	D6046
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher	16000044
Form 2	FormLabs
Incubator	ThermoFisher	51033782
L929 cell lines	Stablished in the lab
Penicillin and Streptomycin (PS)	ThermoFisher	15140122
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Merck	806552
Trypsin with EDTA	Merck	T3924