Génération de sphéroïdes tissulaires à l’aide d’un dispositif imprimé en 3D semblable à un tampon

Résumé

Le protocole actuel décrit une technique permettant de produire des sphéroïdes tissulaires à grande échelle de manière rentable à l’aide d’un dispositif imprimé en 3D semblable à un tampon.

Résumé

Les progrès de la culture cellulaire 3D ont permis de développer des modèles in vitro plus pertinents sur le plan physiologique, tels que les sphéroïdes tissulaires. Les cellules cultivées sous forme de sphéroïdes ont des réponses biologiques plus réalistes qui ressemblent à l’environnement in vivo . En raison de leurs avantages, les sphéroïdes tissulaires représentent une tendance émergente vers des modèles d’étude supérieurs, plus fiables et plus prédictifs avec un large éventail d’applications biotechnologiques. Cependant, les plateformes reproductibles capables de produire à grande échelle des sphéroïdes tissulaires sont devenues un besoin non satisfait pour explorer pleinement et stimuler leur potentiel. Dans ce contexte, la production à grande échelle de sphéroïdes de tissus homogènes est rapportée à l’aide d’une méthodologie peu coûteuse et rapide. Un dispositif semblable à un tampon imprimé en 3D est développé pour générer jusqu’à 4 716 sphéroïdes par plaque à 6 puits. L’appareil est fabriqué par la méthode de la stéréolithographie à l’aide d’une résine photodurcissable. Le dispositif final est composé de microbroches cylindriques, d’une hauteur de 1,3 mm et d’une largeur de 650 μm. Cette approche permet de générer rapidement des sphéroïdes homogènes et des sphéroïdes co-cultivés avec une forme et une taille uniformes et une viabilité cellulaire de >95 %. De plus, le dispositif en forme de tampon est accordable pour différentes tailles de plaques de puits et de boîtes de Pétri. Il est facilement stérilisable et peut être réutilisé pendant de longues périodes. La production efficace à grande échelle de sphéroïdes tissulaires homogènes est essentielle pour tirer parti de leur traduction dans de multiples domaines de l’industrie, tels que l’ingénierie tissulaire, le développement de médicaments, la modélisation de maladies et la médecine personnalisée à la demande.

Introduction

Les sphéroïdes tissulaires sont des micro-tissus 3D formés par des suspensions cellulaires qui s’auto-assemblent sans forces externes¹. Ces sphéroïdes ont été largement utilisés dans les protocoles de biofabrication en raison de leur ressemblance avec les principales caractéristiques du système physiologique humain ^2,3. Les sphéroïdes tissulaires offrent un métabolisme, une dynamique du cytosquelette, une viabilité cellulaire et une activité métabolique et de sécrétion plus similaires à ceux de la culture cellulaire monocouche traditionnelle¹. En raison de leur capacité de fusion, ils peuvent également être utilisés comme blocs de construction (par exemple, des protocoles de bio-impression) pour former des constructions complexes d’ingénierie tissulaire avec une pertinence biologique accrue ^4,5.

En raison de leur pertinence biologique, les sphéroïdes tissulaires ont été utilisés comme outil biotechnologique pour des protocoles allant de l’ingénierie tissulaire, du développement de médicaments, de la modélisation de maladies et de l’évaluation nanotoxicologique, réduisant ainsi le temps, les coûts d’espace^{et les tests} sur les ^animaux. Néanmoins, pour explorer pleinement et exploiter le potentiel des sphéroïdes tissulaires, des méthodes fiables et reproductibles visant à leur production à grande échelle sont hautement nécessaires, et celles-ci restent un défi permanent.

Plusieurs méthodologies produisent des sphéroïdes, telles que des gouttes suspendues, des puits inférieurs en forme de U revêtus, la microfluidique et l’utilisation d’une matrice polymère ^9,10. Bien que ces méthodologies aient ouvert la voie sur le marché de la production de sphéroïdes, elles restent complexes, longues, gourmandes en main-d’œuvre ou coûteuses¹⁰.

Le protocole actuel fait état de la production à grande échelle de sphéroïdes tissulaires homogènes à l’aide d’une méthodologie peu coûteuse et rapide. Nous avons développé un dispositif de type tampon imprimé en 3D pour générer jusqu’à 4 716 sphéroïdes par plaque à 6 puits. De plus, le dispositif en forme de tampon peut être adapté pour produire plus de sphéroïdes par puits, adapté à différentes plaques de culture cellulaire. Il est facilement stérilisable et peut être réutilisé pendant de longues périodes. La production efficace à grande échelle de sphéroïdes tissulaires homogènes est essentielle pour traduire leur utilisation dans les cliniques, contribuant à de multiples domaines de l’industrie tels que l’ingénierie tissulaire, le développement de médicaments, la modélisation de maladies et la médecine personnalisée à la demande.

Protocole

La lignée cellulaire L929, des fibroblastes de souris, a été utilisée pour la présente étude. Le biodispositif imprimé en 3D, semblable à un timbre, a été obtenu à partir d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux). De bonnes pratiques de culture cellulaire et des techniques stériles ont été suivies tout au long du protocole. L’appareil fabriqué a été stérilisé en l’essuyant avec de l’alcool à 70 % et en l’exposant à la lumière UV pendant 15 minutes. Les milieux et les solutions de culture cellulaire ont été chauffés à 37 °C avant d’entrer en contact avec les cellules ou les sphéroïdes tissulaires. Une représentation schématique du protocole est illustrée à la figure 1.

1. Préparation de moules non adhérents à partir du dispositif en forme de tampon

1. Préparez un gel d’agarose à 2 % (p/v) en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Diluez la poudre d’agarose dans une solution saline tamponnée au phosphate (1x PBS) et homogénéisez la suspension résultante avec des mouvements circulaires.
      REMARQUE : Cette solution peut être placée dans une bouteille en verre. Dans cette étape, la solution d’agarose ne sera pas translucide.
   2. Placez la bouteille en verre dans le micro-ondes et réglez-la pendant 30 s. Toutes les 5 s, arrêtez le micro-ondes, retirez la bouteille en verre et homogénéisez manuellement la solution avec des mouvements circulaires. Le processus de chauffage doit être effectué jusqu’à ce que la solution atteigne un état liquide-limpide.
      REMARQUE : Une plaque chauffante peut également être utilisée comme alternative au micro-ondes. Après le processus de chauffage, la solution doit être translucide/limpide.
   3. Ajouter 1 mL de la solution d’agarose dans chaque puits d’une plaque à 6 puits prévue pour l’expérience.
   4. Attendre ~15 min ou jusqu’à ce que l’agarose se solidifie.
      REMARQUE : Une plaque de refroidissement peut être utilisée pour réduire le temps de solidification.
   5. Ajouter 1 à 2 mL de la solution d’agarose et insérer délicatement l’appareil au-dessus de l’agarose liquide.
      REMARQUE : Le placement de l’appareil doit être fait avec soin pour éviter les bulles d’air dans l’interface agarose-dispositif.
   6. Attendre ~30 min ou jusqu’à ce que l’agarose se solidifie.
      REMARQUE : Une plaque de refroidissement peut être utilisée pour réduire le temps de solidification.
   7. Retirez délicatement l’appareil de l’agarose.
      REMARQUE : Le retrait est critique. Il faut l’enlever avec précaution pour conserver les caractéristiques de l’agarose intactes ; Sinon, l’agarose peut être perturbée.
   8. Ajouter 2 ml de DMEM, attendre 10 min, jeter le support et le remplacer par du DMEM frais. Répétez cette opération trois fois pour bien laver le puits.
   9. Ajouter 2 mL de DMEM et placer la plaque à 6 puits dans un incubateur (à 37 °C avec 5 % de CO₂ et 80 % d’humidité) jusqu’à l’ensemencement des cellules (figure 2A-F, vidéo supplémentaire 1).

2. Génération de sphéroïdes tissulaires

REMARQUE : Différentes lignées cellulaires ont des propriétés d’adhésion différentes. Par conséquent, en utilisant cette méthodologie, certains types de cellules peuvent ne pas former correctement les sphéroïdes tissulaires.

1. Cultiver les cellules après une culture monocouche traditionnelle (c.-à-d. cultiver les cellules dans des flacons de culture cellulaire à l’aide de DMEM à faible teneur en glucose complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 100 μg/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine) (voir le tableau des matières). Maintenez les cellules à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ et surveillez-les jusqu’à ce qu’elles atteignent 80 % de confluence.
2. Après avoir atteint la confluence souhaitée, lavez les cellules avec 1x PBS.
   REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser 5 mL pour² flacons de 25 cm, 10 mL pour² flacons de 75 cm et 15 mL pour² flacons de 150 cm.
3. Ajoutez l’enzyme de dissociation et incubez les cellules pendant 2 à 5 minutes à 37 °C dans 5% de CO₂ et 80% d’humidité.
   REMARQUE : La présente étude a utilisé de la trypsine à 0,125 % avec 0,78 mM d’acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA) comme enzyme de dissociation (voir le tableau des matériaux).
4. Observez le détachement des cellules des fioles de culture cellulaire et ajoutez un milieu de croissance complété par du FBS pour neutraliser l’enzyme de dissociation cellulaire.
   REMARQUE : Pour la présente étude, on a utilisé du DMEM à faible teneur en glucose (voir le tableau des matières) complété par 10 % de FBS.
5. Centrifuger la suspension cellulaire à 400 x g pendant 5 min à température ambiante. Ensuite, comptez les cellules manuellement.
6. Prenez 50 x 10⁵ cellules par tube et ajoutez 5 ml de 1x PBS.
   REMARQUE : Le nombre de cellules ensemencées influence le diamètre final du sphéroïde tissulaire. Par conséquent, on peut augmenter le nombre de cellules pour générer des sphéroïdes tissulaires de plus grands diamètres.
7. Centrifuger la suspension cellulaire à 400 x g pendant 5 min à température ambiante.
8. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette, ajouter 1 mL de milieu de culture cellulaire et homogénéiser la solution.
   REMARQUE : Dans la présente étude, on a utilisé un milieu de culture complet de DMEM à faible teneur en glucose, complété par 10 % de FBS, 100 μg/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine.
9. Retirez 2 ml de milieu de la plaque à 6 puits (étape 1.1.9) et ajoutez 1 ml de suspension cellulaire au centre du moule d’agarose formé par le biodispositif imprimé en 3D (étape 1.1.7). Attendez que les cellules se sédimentent dans les microrésections (~20-30 min) et ajoutez soigneusement 1 mL de milieu de culture cellulaire dans le puits.
   REMARQUE : Il faut être très prudent dans cette étape. Il est recommandé d’ajouter délicatement le fluide, de placer la pointe de la pipette près de la paroi du puits et de distribuer en petites quantités.
10. Placez la plaque à 6 puits dans l’incubateur (à 37 °C dans 5 % de CO₂ et 80 % d’humidité) pour que les sphéroïdes tissulaires se forment (environ 24 à 48 h, selon le type de cellule) (figure 3).
    REMARQUE : Différents types de cellules (par exemple, cellules cancéreuses, cellules primaires) ont une cinétique d’auto-assemblage différente¹¹.

Résultats

Génération de micro-résections homogènes à l’aide du dispositif de type tampon imprimé en 3D
Le dispositif imprimé en 3D ressemblant à un tampon a été fabriqué avec succès par la méthode de stéréolithographie¹² à l’aide d’une résine photodurcissable (Figure 2A). Le dispositif final était composé de microbroches cylindriques d’une hauteur de 1,3 mm et d’une largeur de 650 μm (

Discussion

Le présent protocole décrit une méthode simple, rapide et peu coûteuse pour la production à grande échelle de sphéroïdes tissulaires. Un dispositif imprimé en 3D semblable à un tampon a été utilisé comme moule maître, ce qui a généré jusqu’à 4 716 sphéroïdes par plaque à 6 puits. Il a été démontré que les cellules cultivées sous forme de sphéroïdes ont des réponses biologiques plus réalistes qui ressemblent beaucoup à l’environnement in vivo

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well plate	Merck	CLS3516
Agarose	Promega	V3121
Biodevice	Bioedtech
Biological Safety Cabinet	ThermoFisher	51029701
Centrifugue	ThermoFisher	75004031
Corning 50 mL centrifuge tubes	Merck	CLS430829-500EA
Corning cell culture flasks surface area 75 cm2	Merck	CLS430641
Draft Resin	FormLabs	FLDRBL01
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - low glucose	Merck	D6046
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher	16000044
Form 2	FormLabs
Incubator	ThermoFisher	51033782
L929 cell lines	Stablished in the lab
Penicillin and Streptomycin (PS)	ThermoFisher	15140122
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Merck	806552
Trypsin with EDTA	Merck	T3924