JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Настоящий протокол описывает метод производства тканевых сфероидов в больших масштабах с минимальными затратами с использованием напечатанного на 3D-принтере устройства, похожего на штамп.

Аннотация

Достижения в области 3D-клеточных культур привели к разработке более физиологически значимых моделей in vitro , таких как тканевые сфероиды. Клетки, культивируемые как сфероиды, имеют более реалистичные биологические реакции, которые напоминают среду in vivo . Благодаря своим преимуществам, тканевые сфероиды представляют собой новую тенденцию к более совершенным, более надежным и более прогностическим моделям исследований с широким диапазоном биотехнологической применимости. Тем не менее, воспроизводимые платформы, которые могут обеспечить крупномасштабное производство тканевых сфероидов, стали неудовлетворенной потребностью в полном изучении и повышении их потенциала. В данной работе сообщается о крупномасштабном производстве гомогенных тканевых сфероидов с использованием недорогой и эффективной по времени методологии. Напечатанное на 3D-принтере устройство, похожее на штамп, разработано для получения до 4716 сфероидов на 6-луночный планшет. Устройство изготовлено методом стереолитографии с использованием фотоотверждаемой смолы. Конечное устройство состоит из цилиндрических микроконтактов высотой 1,3 мм и шириной 650 мкм. Такой подход позволяет быстро получать гомогенные сфероиды и совмещенные сфероиды с однородной формой и размером, а также жизнеспособностью клеток >95%. Кроме того, штампообразное устройство может быть настроено на различные размеры луночных тарелок и чашек Петри. Он легко стерилизуется и может использоваться повторно в течение длительного времени. Эффективное крупномасштабное производство гомогенных тканевых сфероидов имеет важное значение для использования их трансляции в различных областях промышленности, таких как тканевая инженерия, разработка лекарств, моделирование заболеваний и персонализированная медицина по требованию.

Введение

Тканевые сфероиды представляют собой 3D микроткани, образованные клеточной суспензией, которые подвергаются самосборке без внешних сил1. Эти сфероиды широко используются в протоколах биофабрикации из-за их сходства с ключевыми особенностями физиологической системы человека 2,3. Тканевые сфероиды обеспечивают более сходный метаболизм, динамику цитоскелета, жизнеспособность клеток, а также метаболическую и секреционную активность, чем традиционная монослойнаяклеточная культура. Благодаря своей способности к слиянию они также могут быть использованы в качестве строительных блоков (например, протоколов биопечати) для формирования сложных тканеинженерных конструкций с повышенной биологической значимостью 4,5.

Благодаря своей биологической значимости, тканевые сфероиды используются в качестве биотехнологического инструмента для протоколов, охватывающих тканевую инженерию, разработку лекарств, моделирование заболеваний и нанотоксикологическую оценку, сокращая время, затраты на пространство и испытания на животных 3,6,7,8. Тем не менее, для полного изучения и использования потенциала тканевых сфероидов крайне необходимы надежные и воспроизводимые методы, направленные на их крупномасштабное производство, и они остаются постоянной проблемой.

Несколько методологий получения сфероидов, таких как висячая капля, покрытые U-образными придонными скважинами, микрофлюидика и использование полимерной матрицы 9,10. Несмотря на то, что эти методологии проложили путь на рынке производства сфероидов, они по-прежнему являются сложными, трудоемкими, трудоемкими или дорогостоящими.

В настоящем протоколе сообщается о широкомасштабном производстве гомогенных тканевых сфероидов с использованием недорогой и эффективной по времени методологии. Мы разработали напечатанное на 3D-принтере устройство, похожее на штамп, чтобы генерировать до 4716 сфероидов на 6-луночный планшет. Кроме того, штампообразное устройство может быть адаптировано для производства большего количества сфероидов в лунке, пригодных для различных клеточных культуральных планшетов. Он легко стерилизуется и может использоваться повторно в течение длительного времени. Эффективное крупномасштабное производство гомогенных тканевых сфероидов имеет важное значение для их использования в клиниках, внося свой вклад во многие области промышленности, такие как тканевая инженерия, разработка лекарств, моделирование заболеваний и персонализированная медицина по требованию.

протокол

Для настоящего исследования была использована клеточная линия L929, мышиные фибробласты. Напечатанное на 3D-принтере биоустройство, похожее на штамп, было получено из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). На протяжении всего протокола соблюдалась надлежащая практика культивирования клеток и стерильные техники. Изготовленное устройство стерилизовали путем протирания его 70% спиртом и воздействия ультрафиолетового излучения в течение 15 минут. Среды и растворы клеточных культур нагревали до 37 °С перед контактом с клетками или тканевыми сфероидами. Схематическое изображение протокола показано на рисунке 1.

1. Подготовка неадгезивных форм из штампообразного устройства

  1. Приготовьте 2% (w/v) агарозного геля, следуя приведенным ниже инструкциям.
    1. Разведите порошок агарозы в фосфатно-солевом буфере (1x PBS) и гомогенизируйте полученную суспензию круговыми движениями.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор можно поместить в стеклянную бутылку. На этом этапе раствор агарозы не будет полупрозрачным.
    2. Поставьте стеклянную бутылку в микроволновую печь и поставьте на 30 с. Каждые 5 с останавливайте микроволновую печь, достаньте стеклянную бутылку и вручную гомогенизируйте раствор круговыми движениями. Процесс нагрева нужно выполнять до тех пор, пока раствор не достигнет жидкостно-прозрачного состояния.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Горячая плита также может быть использована в качестве альтернативы микроволновой печи. После процесса нагрева раствор должен быть полупрозрачным/прозрачным.
    3. Добавьте по 1 мл раствора агарозы в каждую лунку 6-луночного планшета, запланированного для проведения эксперимента.
    4. Подождите ~15 минут или пока агароза застынет.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для уменьшения времени затвердевания можно использовать охлаждающую пластину.
    5. Добавьте 1-2 мл раствора агарозы и аккуратно введите прибор поверх жидкой агарозы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размещение устройства должно быть выполнено с осторожностью, чтобы предотвратить появление пузырьков воздуха в интерфейсе агарозного устройства.
    6. Подождите ~30 минут или пока агароза застынет.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для уменьшения времени затвердевания можно использовать охлаждающую пластину.
    7. Аккуратно извлеките устройство из агарозы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление имеет решающее значение. Его следует осторожно удалить, чтобы сохранить элементы агарозы в целости; В противном случае агароза может нарушиться.
    8. Добавьте 2 мл среды DMEM, подождите 10 минут, выбросьте среду и замените ее свежей средой DMEM. Повторите это три раза, чтобы как следует промыть колодец.
    9. Добавьте 2 мл DMEM и поместите 6-луночный планшет в инкубатор (при температуре 37 °C при 5%CO2 и влажности 80%) до посева клеток (Рисунок 2A-F, Дополнительное видео 1).

2. Генерация тканевых сфероидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Разные клеточные линии имеют разные адгезионные свойства. Следовательно, используя эту методологию, некоторые типы клеток могут неправильно формировать тканевые сфероиды.

  1. Выращивайте клетки в соответствии с традиционной монослойной культурой (т.е. выращивайте клетки в колбах для клеточных культур с использованием DMEM с низким содержанием глюкозы с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 мкг/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) (см. Таблицу материалов). Поддерживайте температуру клеток при температуре 37 °C в инкубаторе с 5%CO2 и контролируйте, пока они не достигнут 80% конфлюенции.
  2. Достигнув желаемого места слияния, промойте клетки 1x PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать 5 мл для колб2 см 2 см, 10 мл для колб2 см 75 см и 15 мл для колб2 см 150 см.
  3. Добавьте фермент диссоциации и инкубируйте клетки в течение 2-5 минут при температуре 37 °C при 5%CO2 и влажности 80%.
    Примечание: В настоящем исследовании в качестве фермента диссоциации использовали 0,125% трипсина с 0,78 мМ этилендиамина тетрауксусной кислотой (ЭДТА) (см. Таблицу материалов).
  4. Наблюдайте за отделением клеток от колб с клеточными культурами и добавляйте питательную среду с добавлением FBS для нейтрализации фермента диссоциации клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования использовали ДМЭМ с низким уровнем глюкозы (см. Таблицу материалов) с добавлением 10% FBS.
  5. Центрифугируйте клеточную суспензию при давлении 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем посчитайте ячейки вручную.
  6. Возьмите 50 х 10по 5 клеток в пробирку и добавьте 5 мл 1х ПБС.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество засеянных клеток влияет на конечный диаметр сфероида ткани. Следовательно, можно увеличить количество клеток для получения тканевых сфероидов большего диаметра.
  7. Центрифугируйте клеточную суспензию при давлении 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  8. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки, добавьте 1 мл среды для клеточных культур и гомогенизируйте раствор.
    Примечание: В настоящем исследовании использовалась полноценная культуральная среда DMEM с низким содержанием глюкозы, дополненная 10% FBS, 100 мкг/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.
  9. Удалите 2 мл среды из 6-луночного планшета (шаг 1.1.9) и добавьте 1 мл клеточной суспензии в центр агарозной формы, образованной с помощью напечатанного на 3D-принтере биоустройства (шаг 1.1.7). Дождитесь, пока клетки осядут в микрорезекциях (~20-30 мин) и осторожно добавьте в лунку 1 мл среды для культивирования клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе нужно быть особенно осторожным. Рекомендуется аккуратно добавить среду, расположить наконечник пипетки близко к стенке лунки и дозировать в небольших количествах.
  10. Поместите 6-луночный планшет в инкубатор (при температуре 37 °C при 5%CO2 и влажности 80%) для образования тканевых сфероидов (примерно 24-48 ч, в зависимости от типа клеток) (рис. 3).
    Различные типы клеток (например, раковые клетки, первичные клетки) имеют различную кинетикусамосборки11.

Результаты

Создание однородных микрорезекций с помощью напечатанного на 3D-принтере устройства, похожего на штамп
Напечатанное на 3D-принтере устройство, похожее на штамп, было успешно изготовлено методом стереолитографии12 с использованием фотоотвержда?...

Обсуждение

Настоящий протокол описывает простой, быстрый и недорогой способ крупномасштабного производства тканевых сфероидов. В качестве основной формы использовалось напечатанное на 3D-принтере устройство, похожее на штамп, которое генерировало до 4716 сфероидов на 6-луночную ...

Раскрытие информации

Напечатанные на 3D-принтере устройства, похожие на штампы, были предложены стартапом Bioedtech, в котором Янаина Дерновшек является соучредителем и директором по инновациям. Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Фондом поддержки научных исследований штата Рио-де-Жанейро (FAPERJ, Бразилия), Координационным советом по совершенствованию кадров высшего образования (CAPES, Бразилия) и Бразильским национальным советом по научному и технологическому развитию (CNPq, Бразилия). Мы благодарим Bioedtech за предоставление устройств, похожих на штампы, используемые в этом исследовании, и профессора Бартиру Бергманн из Иммунофармакологической лаборатории за использование их установок для культивирования клеток.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
6 well plateMerckCLS3516
AgarosePromegaV3121
Biodevice Bioedtech
Biological Safety CabinetThermoFisher 51029701
CentrifugueThermoFisher 75004031
Corning 50 mL centrifuge tubesMerckCLS430829-500EA
Corning cell culture flasks surface area 75 cm2MerckCLS430641
Draft Resin FormLabsFLDRBL01
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - low glucoseMerckD6046
Fetal Bovine Serum (FBS)ThermoFisher 16000044
Form 2FormLabs
IncubatorThermoFisher 51033782
L929 cell linesStablished in the lab 
Penicillin and Streptomycin (PS)ThermoFisher 15140122
Phosphate-Buffered Saline (PBS)Merck806552
Trypsin with EDTAMerckT3924

Ссылки

  1. Laschke, M., Menger, M. Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
  2. Mekhileri, N., et al. Automated 3D bioassembly of micro-tissues for biofabrication of hybrid tissue engineered constructs. Biofabrication. 10 (2), 024103 (2018).
  3. Itoh, M., et al. Scaffold-free tubular tissues created by a bio-3D printer undergo remodeling and endothelialization when implanted in rat aortae. PLoS One. 10 (12), 0145971 (2015).
  4. Kronemberger, G., et al. The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication. Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).
  5. Mironov, V., et al. Organ printing: Tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
  6. Skardal, A., Shupe, T., Atala, A. Organoid-on-a-chip and body-on-a-chip systems for drug screening and disease modeling. Drug Discovery Today. 21 (9), 1399-1411 (2016).
  7. Garcez, P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
  8. Charelli, L., et al. Biologically produced silver chloride nanoparticles from B. megaterium modulate interleukin secretion by human adipose stem cell spheroids. Cytotechnology. 70 (6), 1655-1669 (2018).
  9. Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society Interface. 14 (127), 20160877 (2017).
  10. Achilli, T., Meyer, J., Morgan, J. Advances in the formation, use and understanding of multi-cellular spheroids. Expert Opinion on Biological Therapy. 12 (10), 1347-1360 (2012).
  11. Rolver, M., Elingaard-Larsen, L., Pedersen, S. Assessing cell viability and death in 3D spheroid cultures of cancer cells. Journal of Visualized Experiments. (148), e59714 (2019).
  12. Quan, H., et al. Photo-curing 3D printing technique and its challenges. Bioactive Materials. 5 (1), 110-115 (2020).
  13. Rodriguez-Salvador, M., Perez-Benitez, B., Padilla-Aguirre, K. Discovering the latest scientific pathways on tissue spheroids: Opportunities to innovate. International Journal of Bioprinting. 7 (1), 331 (2021).
  14. Baptista, L., et al. Adult stem cells spheroids to optimize cell colonization in scaffolds for cartilage and bone tissue engineering. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1285 (2018).
  15. Shakeri, A., Khan, S., Didar, T. Conventional and emerging strategies for the fabrication and functionalization of PDMS-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 21 (16), 3053-3075 (2021).
  16. vander Valk, J. Fetal bovine serum (FBS): Past - present - future. ALTEX. 35 (1), 99-118 (2018).
  17. vander Valk, J., Brunner, D., et al. Optimization of chemically defined cell culture media - Replacing fetal bovine serum in mammalian in vitro methods. Toxicology in Vitro. 24 (4), 1053-1063 (2010).
  18. Smyrek, I., et al. microtubules and FAK dominate different spheroid formation phases and important elements of tissue integrity. Biology Open. 8 (1), 037051 (2018).
  19. McMillen, P., Holley, S. Integration of cell-cell and cell-ECM adhesion in vertebrate morphogenesis. Current Opinion in Cell Biology. 36, 48-53 (2015).
  20. Tung, Y., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
  21. Guo, X., Li, S., Ji, Q., Lian, R., Chen, J. Enhanced viability and neural differential potential in poor post-thaw hADSCs by agarose multi-well dishes and spheroid culture. Human Cell. 28 (4), 175-189 (2015).
  22. Andréa Dernowsek, J., Rezende, R., Lopes daSilva, J. The role of information technology in the future of 3D biofabrication. Journal of 3D Printing in Medicine. 1 (1), 63-74 (2017).
  23. Garcez, P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
  24. Skardal, A., et al. Multi-tissue interactions in an integrated three-tissue organ-on-a-chip platform. Scientific Reports. 7, 8837 (2017).
  25. Armoiry, X., et al. Autologous chondrocyte implantation with chondrosphere for treating articular cartilage defects in the knee: An evidence review group perspective of a NICE single technology appraisal. PharmacoEconomics. 37 (7), 879-886 (2018).
  26. Nakamura, A., et al. Bio-3D printing iPSC-derived human chondrocytes for articular cartilage regeneration. Biofabrication. 13 (4), 044103 (2021).
  27. Mesquita, C., Charelli, L., Baptista, L., Naveira-Cotta, C., Balbino, T. Continuous-mode encapsulation of human stem cell spheroids using droplet-based glass-capillary microfluidic device for 3D bioprinting technology. Biochemical Engineering Journal. 174, 108122 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

3Din vitro

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены