הכנת עצב סיאטי חולדה לנוירופיזיולוגיה Ex Vivo

Summary

פרוטוקול זה מתאר את ההכנה של רקמת עצב סיאטית שלמה של חולדה לגירוי אלקטרופיזיולוגי ex vivo ורישום באמבט מלוחים בעל שני תאים מווסתים סביבתית.

Abstract

תכשירי Ex vivo מאפשרים לחקור תהליכים נוירופיזיולוגיים רבים בבידוד משאר הגוף תוך שמירה על מבנה הרקמות המקומי. עבודה זו מתארת את ההכנה של עצבים סיאטיים של חולדות לנוירופיזיולוגיה ex vivo, כולל הכנת חיץ, הליכים בבעלי חיים, הגדרת ציוד ורישום נוירופיזיולוגי. עבודה זו מספקת סקירה כללית של סוגי הניסויים השונים האפשריים בשיטה זו. השיטה המתוארת נועדה לספק 6 שעות של גירוי ורישום על רקמת עצב היקפית שחולצה בתנאים מבוקרים היטב לעקביות אופטימלית בתוצאות. התוצאות המתקבלות בשיטה זו הן פוטנציאל פעולה מורכב מסיבי A (CAP) עם משרעת שיא לשיא בטווח המיליוולט לאורך כל משך הניסוי. משרעת וצורות CAP הן עקביות ואמינות, מה שהופך אותן לשימושיות לבדיקה והשוואה של אלקטרודות חדשות למודלים קיימים, או להשפעות של התערבויות על הרקמה, כגון שימוש בכימיקלים, שינויים כירורגיים או טכניקות גירוי נוירומודולטוריות. הן אלקטרודות שרשרת מסחריות קונבנציונליות עם מגעי פלטינה-אירידיום והן אלקטרודות אלסטומר מוליכות בהתאמה אישית נבדקו ונתנו תוצאות דומות מבחינת תגובת משך חוזק הגירוי העצבי.

Introduction

ההבנה הנוכחית של תפקוד עצבי בסיסי כפי שהיא מעוצבת בסיליקו חסרה במספר היבטים, בעיקר ביחס להשפעות של מידור רקמת העצב מחוץ לסומה, אקסון ודנדריטים. אינטראקציות אקסון-מיאלין עדיין אינן מובנות היטב, כפי שמעידה העובדה שאפילו מודלים מפורטים של עצבים חישוביים כגון MRG¹ (עבור עצבי יונקים) הלוכדים כראוי את תגובת הגירוי החשמלי הקונבנציונלית, אינם לוכדים התנהגויות אחרות שנצפו בניסוי כגון הובלת בלוק בתדר גבוה² או תגובת התפרצות משנית³.

פרוטוקול זה מספק שיטה לחקור ביעילות תהליכים נוירופיזיולוגיים ברמת העצב במודל של חיית מעבדה קטנה חריפה, תוך שימוש בפרוטוקול הכנה סטנדרטי כדי לבודד את העצב, לשלוט בסביבתו ולהסיר אותו מהקשר in vivo להקשר ex vivo. זה ימנע תהליכים אחרים בגוף או חומרי הרדמה המשמשים פרוטוקולי גירוי עצבי in vivo כדי לשנות את התנהגות העצבים ולבלבל את התוצאות הנמדדות או את^{הפרשנות} שלהם ^4,5. זה מאפשר פיתוח של מודלים מציאותיים יותר המתמקדים אך ורק בהשפעות ספציפיות לרקמות עצב שאינן מובנות היטב. פרוטוקול זה שימושי גם כנקודת בדיקה לגירוי עצבי חדש ולרישום חומרים וגיאומטריות של אלקטרודות, כמו גם כפרדיגמות גירוי חדשות כגון בלוק ^2,3 בתדר גבוה. וריאציות של טכניקה זו שימשו בעבר כדי לחקור פיזיולוגיה של העצבים בתנאים מבוקרים היטב⁶, למשל, כדי למדוד דינמיקה ותכונות של תעלת יונים או את ההשפעות של הרדמה מקומית⁷.

טכניקה זו מספקת מספר יתרונות בהשוואה לחלופות כגון ניסויים חריפים בבעלי חיים קטנים in vivo ⁸. הטכניקה מייתרת את הצורך לשמור על עומק ההרדמה כאשר הרקמה הוצאה מהגוף, ומפחיתה את כמות הציוד הנדרש כגון מפזר הרדמה, רכז חמצן וכרית חימום. זה מפשט את פרוטוקול הניסוי, מקטין את הסיכון לטעויות. מכיוון שחומרי הרדמה יכולים לשנות את תפקוד העצב⁴, טכניקה זו מבטיחה כי האמצעים לא יתבלבלו על ידי תופעות לוואי מתרכובות הרדמה אלה. לבסוף, טכניקה זו מתאימה יותר מניסויי in vivo חריפים כאשר חוקרים את ההשפעות של תרכובות נוירוטוקסיות כגון טטרודוטוקסין, אשר יהרגו חיה מורדמת על ידי שיתוק.

חתכי עצבים היקפיים הם מערכת ex vivo ייחודית שכן קיים סיכוי גבוה שהסיבים האחראים לאותות עצביים מוקלטים אינם מכילים כל סומה. כפי שבדרך כלל אלה היו ממוקמים, עבור נוירונים מוטוריים, בעמוד השדרה, ועבור נוירונים חושיים בגרעיני השורש הגבי שליד עמוד השדרה, ניתן לדגום באופן גס את הכנת קטע של עצב היונקים כאוסף של ממברנות צינוריות עם תעלות יונים, הפתוחות בשני^{הקצוות 9}. חילוף החומרים נשמר על ידי המיטוכונדריה הממוקמת באקסון בזמן כריתת רקמות¹⁰. תפירה של הקצוות הפתוחים של האקסולמה מעודדת לאחר המיצוי לסגור אותם ובכך לסייע בשמירה על שיפועים יוניים קיימים על פני הממברנה, החיוניים לתפקוד עצבי תקין.

כדי לשמור על הומאוסטזיס של רקמות מחוץ לגוף, מספר משתנים סביבתיים חייבים להיות מבוקרים היטב. אלה הם טמפרטורה¹¹, חמצון¹², אוסמולריות, pH^13,14, וגישה לגלוקוז כדי לשמור על חילוף החומרים. עבור פרוטוקול זה, הגישה היא להשתמש במאגר Krebs-Henseleit^15,16 (mKHB) שונה ברציפות עם תערובת של חמצן ופחמן דו חמצני. ה-mKHB נמצא במשפחת המאגרים הקרדיופלגיים ^6,17 המשמשים לשימור רקמות שנותחו מחוץ לגוף, למשל, בניסויי ex vivo. מאגרים אלה אינם מכילים המוגלובין, אנטיביוטיקה או אנטי פטרייתיים, ולכן הם מתאימים רק לתכשירים הכוללים כמויות קטנות של רקמות לזמן מוגבל. בקרת ה-pH הושגה עם זוג החמצונים הפחמיים והפחמן הדו-חמצני, מה שדרש אוורור מתמיד של החיץ עם פחמן דו-חמצני כדי לשמור על שיווי משקל ה-pH. זאת כדי להימנע משימוש בחומרי אגירה נפוצים אחרים כגון HEPES, אשר יכול לשנות את תפקוד תאי העצב¹⁸. כדי לחמצן את החיץ ולספק בקרת pH, נעשה שימוש בתערובת של 5% פחמן דו חמצני בחמצן הנקרא קרבוגן (95% O₂, 5% CO₂). מערבל חימום שימש לבקרת טמפרטורה של מיכל חיץ, והחוצץ הוחדר דרך אמבט עצבים, ולאחר מכן הוחזר למיכל ההתחלה. ניסוי טיפוסי יימשך 6-8 שעות לפני שהעצב מאבד את הכדאיות שלו וכבר לא מגיב מספיק לגירוי כדי שהאמצעים ייצגו רקמה בריאה.

כדי לייעל את יחס האות לרעש, אלקטרודות כסף-כלוריד שימשו להקלטה, אשר הוכנו על פי שיטות^{שתוארו קודם לכן 19}. לצורך גירוי, ניתן להשתמש בשילוב של אלקטרודות מסחריות של שרוול פלטינה מהמדף ואלקטרודות של חפתים פולימריים מוליכים בהתאמה אישית. אלקטרודות של חפתים פולימריים מוליכים הן בעלות יכולות מטען גבוהות במיוחד, אשר שימושיות בעת גירוי העצב באמצעות צורות גל משרעת גבוהות²⁰.

הממריץ המשמש בפרוטוקול זה תואר בעבר²⁰. תיעוד, קבצי עיצוב וסקריפטים של תוכנה לשימוש בהם זמינים לציבור²¹. ניתן להשתמש בממריצים אחרים כדי לבצע פרוטוקול זה; עם זאת, הממריץ המותאם אישית מסוגל גם לבלוק זרם חלופי בתדר גבוה (HFAC) ^2,20, המאפשר מגוון רחב יותר של ניסויים נוירופיזיולוגיים. כדי להשתמש בחסימת HFAC, מומלץ לאזיקים מוליכים של אלסטומר כדי למנוע נזק לעצב. אזיקי עצב אלסטומר מוליכים הם מערכי אלקטרודות רכים ופולימריים לחלוטין המופקים מאלסטומרים מוליכים כמרכיב המוליך ופולידימתילסילוקסן כבידוד²². המכשירים יוצרו בתצורה דו קוטבית תוך שימוש בטכניקות מיקרו-פבריקציה קונבנציונליות של לייזר.

Protocol

כל הטיפול והנהלים בבעלי חיים בוצעו תחת רישיונות מתאימים שהונפקו על ידי משרד הבית הבריטי תחת חוק בעלי החיים (נהלים מדעיים) (1986) ואושרו על ידי המועצה לרווחת בעלי חיים ובדיקה אתית של אימפריאל קולג 'בלונדון.

1. הכנת מאגרים

הערה: חלק זה של הפרוטוקול יכול להתבצע הרבה לפני שאר הפרוטוקול, למעט השלבים הסופיים הכרוכים בהכנת חיץ קרבס-הנסלייט (mKHB) שונה בריכוז 1x.

1. הכן 1 M CaCl_{2 פתרון} מלאי
   1. הוסיפו 14.701 גרם של CaCl₂ דיהידרט לכוס נקייה של 100 מ"ל. מוסיפים כ-75 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה ומערבבים עד לפירוק מלא של המלח.
   2. מעבירים את התמיסה לבקבוקון מדורג של 100 מ"ל ומוסיפים מים שעברו דה-יוניזציה עד להגעה לנפח של 100 מ"ל. מעבירים את הפתרון לבקבוק ומאחסנים אותו במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
2. הכן 10x מלאי mKHB מרוכז
   1. הוסיפו 66.03 גרם של נתרן כלורי (NaCl), 3.57 גרם אשלגן כלורי (KCl), 1.63 גרם אשלגן דיהידרוגן פוספט (KH₂PO₄) ו-1.44 גרם מגנזיום גופרתי לכוס 2 ליטר.
   2. מוסיפים כ-750 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה לכוס ומערבבים עד שהמלחים נמסים (ייתכן שנותרו גבישי מלח קטנים בתחתית). הוסף 25 מ"ל של תמיסת מלאי CaCl₂ של 1 M (שלב 1.1) וערבב; ודא שזהו המלח האחרון שנוסף.
   3. מעבירים את התמיסה לבקבוקון מדורג 1 ליטר ומוסיפים מים שעברו דה-יוניזציה כדי להגיע לנפח כולל של 1 L. העבירו את התמיסה לבקבוק 1 ליטר. יש לאחסן מרוכז 10x mKHB בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במקרר.
      הערה: ניתן לאחסן מלאי mKHB מרוכז למשך כחודש לפני ההחלפה.
3. להכין דיסקציה צלחת פטרי (ציפוי)
   1. מכינים צלחת פטרי מזכוכית נקייה (בקוטר 120 מ"מ) לציפוי על ידי שטיפה וייבוש של המנה בזהירות.
   2. בעקבות הוראות היצרן לשימוש וריפוי של ציפוי האלקוקסי הקונפורמי, ציפו את החלק התחתון של צלחת פטרי בכ-3-5 מ"מ של ציפוי על ידי מזיגה קפדנית של תערובת הציפוי הקונפורמי לתוך המנה עד להגעת העובי הרצוי.
   3. יש לרפא את הציפוי בתנור בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס עד שהוא מוצק למגע. צלחת פטרי הנתיחה מוכנה כעת.
      הערה: ניקוי עדין של המנה לאחר כל שימוש יבטיח שהציפוי יחזיק מעמד שנים לפני הצורך בהחלפה. בעת החלפת הציפוי, הקפד להסיר את כל חומר הציפוי לפני החלת ציפוי חדש. שים לב שלציפוי האלקוקסי הקונפורמי (טבלת החומרים) המשמש בפרוטוקול זה יש חיי מדף קצרים יותר משנה.

2. תכשירים לפני הנתיחה

הערה: שלב זה מתחיל את הניסוי. הצעדים שלהלן חייבים להתבצע באותו יום, בסדר זה.

1. הכן 1x mKHB
   1. הכינו 2 ליטר נקייה למאגר. העברת 200 מ"ל של מלאי 10x mKHB לכוס 2 ליטר. הוסיפו 2.1 גרם של נתרן פחמתי (NaHCO₃) ו-0.99 גרם של דקסטרוז נטול מים (D-גלוקוז) לכוס 2 ליטר.
   2. הוסיפו כ-1 ליטר של מים שעברו דה-יוניזציה לכוס. מערבבים עד שהמלחים נמסים לחלוטין. מעבירים את התמיסה לבקבוקון מדורג 2 ליטר ומוסיפים מים שעברו דה-יוניזציה כדי להגיע לנפח כולל של 2 ליטר.
   3. העבירו את התמיסה לבקבוק זכוכית בנפח 2 ליטר המונח על מערבל חימום כאשר הטמפרטורה נקבעה ל-37 מעלות צלזיוס.
      הערה: מערבל חימום קטן יותר לרוב לא יוכל להגיע ליעד טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בשל האינרציה התרמית של מיכלים גדולים מלאים במים. כוונו את הטמפרטורה כלפי מעלה כך שתכולת הבקבוק תגיע ל-37 מעלות צלזיוס עם ערבוב. עקוב אחר הטמפרטורה במהלך הניסוי והורד את הטמפרטורה שנקבעה במקרה של צילום יתר.
   4. מניחים מדחום בבקבוק 2 ליטר כדי לנטר את הטמפרטורה, תוך שימוש באחיזות כדי למנוע מהמדחום להיפגע מהפרעוש הבוחש. יש לאוורר את החיץ עם קרבוגן למשך 30 דקות לפחות כדי לחמצן את התמיסה. פעולה זו אמורה להגדיר את ה-pH ל-7.4. מדוד את ה- pH עם מד pH כדי לוודא שהוא נמצא בתוך 0.1 יחידות pH של 7.4 (ב- 37 °C ).
      הערה: כדי להתאים את ה-pH ל-7.4, השתמש בחומצה הידרוכלורית או נתרן הידרוקסיד בעת הצורך.
   5. מלאו שני צינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל ובקבוק אחד של 100 מ"ל עם mKHB והניחו אותם על קרח כדי להתקרר.
      הערה: ניתן לנקות את צינורות הצנטריפוגה ואת הבקבוק ולעשות בהם שימוש חוזר לאחר כל ניסוי ללא אוטוקלאבים.
   6. בחלקים מאוחרים יותר של הניסוי, המשיכו לאוורר את המאגר בבקבוק 2 ליטר עם קרבוגן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ערבוב מתמשך.
      הערה: שימוש לא מפוקח בקרבוגן עלול להיות מסוכן אם לא קיימות מערכות אוטומטיות לכיבוי זרימת הגז במקרה של דליפה. חיישן אוטומטי ושסתום כיבוי אלקטרוני יכולים למתן זאת; אחרת, יש להשאיר אדם לפקח על הציוד אם הנתיחה מתבצעת בחדר אחר. בכל המקרים, יש להשתמש בחיישן חמצן בסמוך למערך כדי להזהיר את המפעילים כאשר ריכוז החמצן הסביבתי עולה מעל 25%. השתמשו בחדר עם אוורור פעיל במידת האפשר.
2. הפעל את התקן רכישת האותות, את הקדם-מהדק בעל הרעש הנמוך, את מסנן רעשי הקו ואת האוסצילוסקופ להקלטה וגירוי, כדי לאפשר מספיק זמן לייצוב טמפרטורה.
3. ודא שכל ציוד ההקלטה החשמלי מוגדר כהלכה
   1. הגדר את הקדם-מהאמפליפייר בעל הרעש הנמוך לקלט המצומד ל-AC עם מסנן מעבר-פס הכניסה המוגדר ל-6 dB roll-off לעשור, ותדרי ניתוק המוגדרים ל-30 הרץ ו-3 קילוהרץ עבור מסנני מעבר גבוה ומעבר נמוך, בהתאמה.
   2. הגדר את הרווח של הקדם-מהאמפיפייר בעל הרעש הנמוך ל-100.

3. הרדמה של בעלי חיים והמתת חסד

הערה: נקבות חולדות בין 250 ל-330 גרם (טבלת חומרים) שימשו למחקרים.

1. להכין כלי ניתוח וחומרים מתכלים: 12 ס"מ מספריים ישרים (קהים); 2 מ"מ מספריים קפיציים זוויתיים זוויתיים; מספריים עדינים 4 ס"מ, חדים או חדים למחצה; #7 מלקחיים של דומונט; מלקחיים עדינים בזווית של 45° ומשי או חוט תפירה של 6-0.
2. מניחים את החולדה במיכל או בתא הרדמה. חברו את החמצן ואת מפזר ההרדמה למיכל. קבעו את ריכוז ההרדמה (איזופלורן) ל-3.5% והמתינו כ-10 דקות או עד שהחיה מראה סימני הרדמה כגון אובדן רפלקס הזכות.
3. לאחר שהחולדה מראה סימני הרדמה, אשרו את אובדן ההכרה באמצעות בדיקת רפלקס נסיגה מכווץ בבוהן. המשך רק כאשר אין נסיגת בוהן; אחרת, בדוק את כל החיבורים ורמות ההרדמה במפזר וחזור על שלב 3.2.
4. מוציאים את החיה מהמיכל וממשיכים עם נקע צוואר הרחם, ולאחר מכן חותכים עורק עצם הירך לאישור המוות.

4. פרוטוקול דיסקציה

הערה: הניחו את החיה עם בטנה על שולחן הנתיחה. חזור על השלבים הבאים עבור שתי הרגליים. בדרך כלל, רגל ימין מנותחת ראשונה.

1. כשהם אוחזים את הקרסול בחוזקה בין האגודל, האצבע המורה והאצבע האמצעית, מנתקים את גיד הקלקניאל באמצעות מספריים קהים ישרים בקוטר 12 ס"מ.
2. עם מספריים חדים עדינים, לעשות חתך בעור מן הגיד calcaneal לאורך החלק האחורי של הרגל כל הדרך עד לבסיס של עמוד השדרה, תוך הקפדה לא לנתח את רקמת השריר למטה.
3. באמצעות מלקחיים עדינים ומספריים עדינים, בצע חתכים זהירים דרך שכבות השרירים הסמוכות לאמצע החלק האחורי של הרגל עד שהעצב הסיאטי נחשף. ברגע שהעצב הסיאטי נראה לעין, מעניקים לחות לחלל באמצעות mKHB קר כקרח כדי למנוע מהעצב להתייבש.
4. באמצעות hemostats, למשוך את דשי העור מכל צד זה מזה, ולשמור על החתך פתוח לעבודת דיסקציה עדינה יותר. החל ממיקום החתך של גיד הקלקניאל, עם מספריים עדינים, להפריע את השריר בצד המדיאלי של הרגל כדי לשחרר את העצב. המשך לשמור על רמות הלחות באזור עם mKHB קר כקרח.
5. כאשר העצב נחשף תוך כדי תנועה במעלה הרגל, נתחו את רקמת השריר העליונה. משחררים את העצב קרוב יותר לעמוד השדרה מרקמות החיבור עד שמגיעים לשסע בעמוד השדרה ואז יש קינק בעצב. אל תנסה לנקות את העצב עדיין מכיוון שהמהירות חיונית בשלב זה.
6. נתקו את העצב קרוב ככל האפשר לעמוד השדרה עם מספריים עדינים. כדי להפוך את הנתיחה לקלה יותר, בעדינות רבה למשוך את קצה העצב ליד הקרסול באמצעות מלקחיים. לעולם אל תצבטו את העצב באמצע, אלא רק את הקצוות. לעולם אל תמשוך בעצבים.
   אופציונלי: בשלב זה, אם הזמן מאפשר, ניתן לבצע תפירה של שני קצוות העצב כדי לסייע בשמירה על כדאיות. יש לצמצם את הטיפול למינימום כדי למנוע נזק. אם אין מספיק זמן (ראה שלב 4.5), דלג על שלב זה ועקוב אחר שלב 5.2 בהמשך.
7. מניחים את העצב המנותח בצינור הצנטריפוגה 15 מ"ל המלא ב-mKHB (שלב 2.1.5), סוגרים את הצינור ומניחים את הצינור בחזרה על הקרח עד לתחילת הליך הניקוי.
8. חזור על שלבים 4.1-4.7 עבור הרגל השנייה. באופן אידיאלי, כל עצב צריך לקחת 5-10 דקות כדי לחלץ, על מנת למקסם את כדאיות הרקמה.

5. הליך ניקוי עצבים

1. מלאו את צלחת הפטרי המצופה בערך באמצע הדרך ב-mKHB מחומצן מצונן. מניחים את אחד העצבים הסיאטיים המנותחים בצלחת ומצמידים את שני קצות העצב למנה כך שהעצב ישר ללא סטיות, פיתולים או פיתולים. הצמד את העצב קרוב ככל האפשר לקצוות.
2. באמצעות 6-0 תפרי משי או חוט דק, קושרים קשר כפול סביב כל קצה של העצב כדי למנוע דליפת ציטוזול לתוך החיץ. הניחו את הקשרים ממש ליד סיכות החרקים בצד קרוב יותר למרכז העצב, שכן הדבר ימנע דליפה מרקמת העצב לתוך החיץ. אל תבצע צעד זה אם העצב כבר נקשר בעבר.
3. שימוש במיקרוסקופ לדיוק ומספריים קפיציים זוויתיים בקוטר 2 מ"מ, מסירים מהעצב שומן, כלי דם ורקמת שריר. לגזום את כל ענפי העצב שלא ישמשו בפרוטוקול הגירוי וההקלטה.
   1. כל 5 דקות של ניקוי, להחליף את המאגר עם mKHB מחומצן מצונן טרי. השתמש במלקחיים עדינים כדי למשוך רקמות חיבור, שומן וכלי דם כדי להקל על הנתיחה.
4. הניחו את העצבים בחזרה בצינורות ההובלה המלאים ב-mKHB מצונן ומחומצן טרי והניחו את הצינורות על הקרח.

6. הגדרת ציוד

הערה: מערך הציוד המשמש לביצוע ניסויים מודגם באיור 1. בקצרה, הוא מורכב מאמבטיה עצבית דו-תאית, בקבוק 2 ליטר המונח על מערבל חימום, מקור של קרבוגן לאוורור חיץ, וצינורות כדי לאפשר למאגר לזרום מהבקבוק לאמבטיה, ובחזרה לבקבוק באמצעות משאבה פריסטלטית. ניתן להכין את האמבטיה מתוך פרספקס או להדפיס בתלת-ממד מחומרים אטומים למים. עומקו כ-2 ס"מ, והמחיצה המפרידה בין שני תאי האמבטיה כוללת חור בקוטר 1.5 מ"מ המאפשר השחלה של עצב היקפי על פני שני התאים. תא אחד גדול, חייב להיות באורך של לפחות 4 או 5 ס"מ, והוא יתמלא במאגר. התא השני צריך להיות באורך של לפחות 3 ס"מ ויהיה מלא בסיליקון או בשמן מינרלי. אסור להפוך את האמבטיה לגדולה מדי מכיוון שהדבר יפגע בשליטה על זלוף, טמפרטורה ו- pH. ייתכן שיהיה צורך בגדלים שונים של אמבטיה בהתאם לגודל רקמת העצב הנחקרת.

1. הכינו אמבט עצבים נקי עם שני תאים (ראו קובץ משלים למפרטי העיצוב). מניחים את אמבט העצבים מתחת לרמה של בקבוק 2 ליטר המונח על מערבל החימום, באמצעות ראשי בוס מעבדה סטנדרטיים ותופסים. חברו את ניקוז האמבטיה לכניסת המשאבה הפריסטלטית.
2. חברו את השקע של המשאבה הפריסטלטית לצינור המוביל בחזרה לבקבוק המאגר 2 ליטר. חברו את פתח האמבטיה לצינור עם שסתום זרימה מתכוונן והניחו את הצינור בתוך בקבוק 2 ליטר. השתמש בשסתום תלת-כיווני עם מזרק המחובר לשקע האמצעי כדי לסייע בהחדרת הצינור כסיפון לזרימת חיץ בסיוע כוח הכבידה.
3. הכינו את הסיפון על ידי ציור המזרק עד שהמאגר זורם לתוכו. הגדר את השסתום כך שקצב הזרימה של החיץ לאמבטיה הוא ~ 5-6 mL·^min-1. ניתן להגדיל את הזרימה בתחילה כדי למלא את האמבטיה. לאחר שמפלס חיץ האמבטיה הגיע לניקוז, הניחו את העצבים באמבטיה.
4. באמצעות סיכת חרקים, אבטחו את קצה העצב בפינת תא האמבטיה המלא בחיץ. באמצעות מלקחיים עדינים בזווית של 45° וצביטת העצב רק בקצוות, משחילים בזהירות את העצב כדי להיות מגורה דרך החור במחיצה בין שני תאי האמבטיה.
5. יש לאבטח את הקצה השני של העצב בתא השמן של האמבטיה באמצעות סיכת חרקים, ולהבטיח שהעצב ישר מבלי להימתח והוא נקי מסטיות ופיתולים. באמצעות גריז סיליקון, יש ליצור אטימה כדי למנוע דליפת חיץ מתא החיץ לתוך תא השמן. מלאו את תא השמן בסיליקון או בשמן מינרלי.
6. הניחו את ווי האלקטרודה לרישום Ag/AgCl בתא אמבט השמן ואבטחו אותם באמצעות ראשי בוסים ותאבי אחיזה. עטפו את החלק של העצב באמבט השמן מעל הקרסים מבלי למשוך את העצב מתוח. אל תצבטו את העצב; השתמש במלקחיים זוויתיים כדי להרים את העצב מבלי לצבוט.
7. התאם או תקן את חותם השומן מסיליקון אם נצפתה דליפה כלשהי לאחר הזזת העצב.
8. חברו את אלקטרודת הייחוס Ag/AgCl לקרקע המגבר והניחו את האלקטרודה בתא הרחצה המלא בחיץ על ידי אבטחתה באמצעות מאחיזת מעבדה.

7. השתלת אלקטרודה על העצב באמבטיה

1. הכן אלקטרודה של שרוול עצב נקי לגירוי על פי הפניה²¹. מניחים את האלקטרודה בתא הרחצה מלא החיץ. באמצעות מלקחיים או פינצטה עדינה עם קצוות קהים או זוויתיים, פותחים את האלקטרודה באמבטיה כדי להרטיב את החלק הפנימי של השרוול.
2. אם נשארות בועות, השתמשו במזרק דק כדי לשאוב חיץ מהאמבטיה ולהוציא את הבועות מהשרוול בכוח. עם פינצטה מתחת לעצב, פתחו בעדינות את השרוול והחליקו אותו מתחת לעצב. סגור את השרוול סביב העצב, תוך הקפדה על הימנעות מכל סטייה או פיתול של העצב.
3. חברו את אלקטרודת הגירוי לממריץ והבטיחו את אלקטרודת הגירוי באמצעות סרט הדבקה. חברו את אלקטרודת החזרת הזרם לגורם הממריץ ואבטחו את העופרת באמצעות סרט הדבקה. אם אתה משתמש ביריעת פלטינה מרובעת כאלקטרודת ההחזרה הנוכחית, מקם את היריעה הרחק מהעצב באמבטיה.

8. גירוי והקלטה

1. חברו את פלט האות TTL הממריץ לערוץ 4 של האוסצילוסקופ, שישמש להפעלת האוסצילוסקופ. במסך האוסצילוסקופ, לחץ על הכרטיסיה ערוץ טריגר וציין את ערוץ 4 כערוץ המפעיל. הגדר את רמת ההדק ל- 1 V באמצעות כפתור הרמה .
2. באוסצילוסקופ, קבעו את רזולוציית הזמן ל-1 אלפיות השנייה/חלוקה ואת רזולוציית המתח ל-10 mV/division. מרכז את הפניית ההדק בזמן והגדר את רמת ההדק ל- 1 V.
   הערה: בצע את שלבים 8.3 עד 8.6 אם אתה משתמש בממריץ המותאם אישית (ראה טבלת חומרים). ההנחה היא כי תוכנת MATLAB ומנהלי ההתקנים הותקנו במחשב המעבדה באמצעות הוראות שסופקו באופן חופשי באינטרנט עבור הממריץ העצבי המותאם אישית²¹. אחרת, בצע את הוראות היצרן לשימוש בממריץ זמין מסחרית כחלופה.
3. חבר את הממריץ למחשב המעבדה. הפעל את הממריץ על-ידי חיבור ספק הכוח של הסוללה לכניסת החשמל. הפעל את תוכנת MATLAB במחשב המעבדה.
4. הפעל את סקריפט MATLAB המותאם אישית: HFAC_4ch_Stimulator_Initialization.m (טבלת חומרים).
   הערה: כבל התקשורת מסוג USB בין המחשב לגורם הממריץ צריך להבהב בירוק. אם לא, יש שגיאת תצורה, ויש לאמת את ספק הכוח והחיבורים.
5. פתח את סקריפט MATLAB: HFAC_4ch_Monophasic_Stimulation.m (טבלת חומרים). על ידי עריכה ישירה של סקריפט MATLAB, הגדר את הפרמטרים כדלקמן: משרעת דופק מגרה = -300 μA, רוחב דופק מגרה = 300 μs, מספר מגרה של פולסים = 10 וזמן מגרה בין פולסים = 1 s.
6. התחל את פרוטוקול הגירוי על-ידי לחיצה על הפעל בתוכנת MATLAB.

תוצאות

תוצאות מייצגות שניתן להשיג באמצעות פרוטוקול זה הן פוטנציאל הפעולה המורכב העקבי מסיבי עצב מסוג A בתוך העצב הסיאטי. לפוטנציאלי הפעולה האלה יש בדרך כלל משרעת שיא לשיא של כ-1 mV באלקטרודה ולכן 100 mV מוגברת לאחר ההגברה (איור 2). משרעת גירוי דומה ורוחב דופק אמורים להניב משרעת CAP דומה. ?...

Discussion

בעבודה זו תיארנו פרוטוקול להכנת עצבים סיאטיים של חולדות לנוירופיזיולוגיה של ex vivo. מיצוי רקמות אורך כ-30 דקות, כולל טיפול בבעלי חיים, הרדמה, קילוף וכריתה, בעוד שניקוי עצבים, מיקום באמבטיה והשתלת אלקטרודות אמורים לדרוש 30 דקות נוספות לפני שניתן יהיה להתחיל בהקלטה. ניתן לבצע הכנת חיץ תוך 30 ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L Glass bottle	VWR International Ltd	215-1595	Borosilicate glass
1 L Glass graduated flask	VWR International Ltd	612-3626	Borosilicate glass
2 L Glass bottle	VWR International Ltd	215-1596	Borosilicate glass
2 L Glass graduated flask	VWR International Ltd	BRND937254	Borosilicate glass
Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT	RS UK	536-2599	push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube
Alkoxy conformal coating	Farnell	1971829	ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation
Anesthetic	Chanelle	N/A	Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle
Beaker, 2 L	VWR International Ltd	213-0469	Borosilicate glass
Bipolar nerve cuff	Cortec GMBH	N/A	800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination
Bossheads	N/A	N/A	Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods
Calcium Chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902-500g	500 g in plastic bottle
Carbogen canister	BOC	N/A	F-size canister
Centrifuge Tubes, 15 mL volume	VWR International Ltd	734-0451	Falcon tubes
Conductive elastomer nerve cuff	N/A	N/A	high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference
Connector, Termimate	Mouser UK	538-505073-1100-LP	These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11)
Crocodile clip connectors	RS UK	212-1203	These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10)
Deionized Water	N/A	N/A	Obtained from deionized water dispenser
Forceps angled 45 degrees	InterFocus Ltd	91110-10	Fine forceps, student range
Forceps standard Dumont #7	InterFocus Ltd	91197-00	Student range forceps
Gas Disperson Tube, Porosity 3	Merck	12547866	N/A
Glucose anhydrous, powder	VWR International Ltd	101174Y	500 g in plastic bottle
Grippers	N/A	N/A	Standard wet laboratory rod-mounted grippers
Heating Stirrer	RS UK	768-9672	Stuart US152
Hemostats	N/A	N/A	Any hemostat >12 cm in length is suitable
Insect Pins, stainless steel, size 2	InterFocus Ltd	26001-45	N/A
Laptop computer	N/A	N/A	Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable
Line Noise Filter	Digitimer	N/A	Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter)
Low-Noise Preamplifier, SR560	Stanford Research Systems	SR560	Low-noise voltage preamplifier
Magnesium Sulphate salt	VWR International Ltd	291184P	500g in plastic bottle
MATLAB scripts	Github	https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch	Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator
MATLAB software	Mathworks	N/A	Standard package
Microscope Light, PL-2000	Photonic	N/A	Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier
Microscope, SMZ 745	Nikon	SM745	Stereoscopic Microscope
Mineral oil, non-toxic	VWR International Ltd	31911.A1	Oil for nerve bath
Nerve Bath	N/A	N/A	Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details.
Oscilloscope	LeCroy	N/A	434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers
Oxygen Hose, 1 meter	BOC	N/A	1/4" NPT terminations
Oxygen Regulator	BOC	C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar	N/A
Peristaltic Pump P-1	Pharmacia Biotech	N/A	Product may be obtained from third party supplier
Petri Dish, Glass	VWR International Ltd	391-0580	N/A
Potassium Chloride salt	Sigma Aldrich	P5405-250g	250 g in plastic bottle
Potassium Dihydrogen Sulphate salt	Merck	1.04873.0250	250 g in plastic bottle
Rat	Charles River Laboratories	N/A	Sprague Dawley, 250-330 grams, female
Reference electrode, ET072	eDaQ (Australia)	ET072-1	Silver silver-chloride reference electrode
Rod	N/A	N/A	Standard wet laboratory rods with fittings for stands
Scale	Sartorius	N/A	M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers
Scissors straight 12 cm edge	InterFocus Ltd	91400-12	blunt-blunt termination, student range
Signal Acquisition Device	Cambridge Electronic Design	Micro3-1401	Micro3-1401 Multichannel ADC
Silicone grease, non-toxic	Farnell	3821559	for sealing of bath partition
Silicone tubing, 2 mm inner diameter	N/A	N/A	N/A
Silicone tubing, 5 mm inner diameter	N/A	N/A	N/A
Silver wire	Alfa Aesar	41390	0.5 mm, annealed
Sodium Bicarbonate salt	Sigma Aldrich	S5761-500g	500 g in plastic bottle
Sodium Chloride salt	VWR International Ltd	27810.295	1 kg in plastic bottle
Spring scissors angled 2 mm edge	InterFocus Ltd	15010-09	N/A
Stand	N/A	N/A	Standard wet laboratory stands with sockets for rods
Stimulator	Digitimer	DS3	DS3 or Custom Stimulator (see references)
Stirring flea	VWR International Ltd	442-0270	For use with the heating stirrer
Syringe tip, blunt, 1 mm diameter	N/A	N/A	N/A
Syringe tip, blunt, 2 mm diameter	N/A	N/A	N/A
Syringe, plastic, 10 mL volume	N/A	N/A	syringe should have luer lock fitting
Tape, water-resistant	N/A	N/A	For securing tubing and wiring to workbench
Thermometer	VWR International Ltd	620-0806	glass thermometer
USB Power Bank	RS UK	135-1000	Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3
Valve, Leuer Lock, 3-Way	VWR International Ltd	229-7440	For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon