Preparazione del nervo sciatico di ratto per la neurofisiologia Ex Vivo

Riepilogo

Questo protocollo descrive la preparazione del tessuto nervoso sciatico intero di ratto per la stimolazione elettrofisiologica ex vivo e la registrazione in un bagno salino perfuso a due compartimenti regolato dall'ambiente.

Abstract

I preparati ex vivo consentono lo studio di molti processi neurofisiologici in isolamento dal resto del corpo, preservando la struttura tissutale locale. Questo lavoro descrive la preparazione dei nervi sciatici di ratto per la neurofisiologia ex vivo , compresa la preparazione del tampone, le procedure animali, la configurazione delle apparecchiature e la registrazione neurofisiologica. Questo lavoro fornisce una panoramica dei diversi tipi di esperimenti possibili con questo metodo. Il metodo delineato mira a fornire 6 ore di stimolazione e registrazione sul tessuto nervoso periferico estratto in condizioni strettamente controllate per una coerenza ottimale nei risultati. I risultati ottenuti con questo metodo sono potenziali d'azione composti in fibra A (CAP) con ampiezze da picco a picco nell'intervallo millivolt per l'intera durata dell'esperimento. Le ampiezze e le forme del CAP sono coerenti e affidabili, rendendole utili per testare e confrontare nuovi elettrodi con modelli esistenti o gli effetti di interventi sul tessuto, come l'uso di sostanze chimiche, alterazioni chirurgiche o tecniche di stimolazione neuromodulatoria. Sono stati testati sia gli elettrodi per polsini convenzionali disponibili in commercio con contatti platino-iridio che gli elettrodi di elastomero conduttivo su misura e hanno dato risultati simili in termini di risposta forza-durata dello stimolo nervoso.

Introduzione

L'attuale comprensione della funzione nervosa fondamentale come modellata in silico è carente in diversi aspetti, in particolare per quanto riguarda gli effetti della compartimentazione del tessuto nervoso al di fuori del soma, dell'assone e dei dendriti. Le interazioni assone-mielina sono ancora poco comprese, come evidenziato dal fatto che anche modelli nervosi computazionali dettagliati come MRG¹ (per i nervi dei mammiferi) che catturano adeguatamente la risposta di stimolazione elettrica convenzionale, non catturano altri comportamenti osservati sperimentalmente come il carryover di blocco ad alta frequenza² o la risposta di insorgenza secondaria³.

Questo protocollo fornisce un metodo per studiare in modo efficiente i processi neurofisiologici a livello nervoso in un modello acuto di piccoli animali da laboratorio, utilizzando un protocollo di preparazione standardizzato per isolare il nervo, controllarne l'ambiente e rimuoverlo da un contesto in vivo a un contesto ex vivo. Ciò impedirà altri processi corporei o anestetici utilizzati dai protocolli di stimolazione nervosa in vivo per alterare il comportamento nervoso e confondere i risultati misurati o la loro interpretazione ^4,5. Ciò consente lo sviluppo di modelli più realistici incentrati esclusivamente su effetti specifici dei tessuti nervosi che sono poco compresi. Questo protocollo è anche utile come banco di prova per la stimolazione nervosa e la registrazione di materiali e geometrie degli elettrodi, nonché nuovi paradigmi di stimolazione come il blocco ad alta frequenza ^2,3. Variazioni di questa tecnica sono state utilizzate in precedenza per studiare la fisiologia nervosa in condizioni strettamente controllate⁶, ad esempio, per misurare la dinamica e le proprietà dei canali ionici o gli effetti degli anestetici locali⁷.

Questa tecnica offre diversi vantaggi rispetto ad alternative come la sperimentazione acuta in vivo su piccoli animali⁸. La tecnica evita la necessità di mantenere la profondità dell'anestesia poiché il tessuto è stato estratto dal corpo, riducendo la quantità di attrezzature necessarie come un diffusore anestetico, un concentratore di ossigeno e una piastra riscaldante. Questo semplifica il protocollo sperimentale, riducendo il rischio di errori. Poiché gli anestetici possono potenzialmente alterare la funzione nervosa⁴, questa tecnica garantisce che le misure non siano confuse dagli effetti collaterali di questi composti anestetici. Infine, questa tecnica è più appropriata degli esperimenti acuti in vivo quando si studiano gli effetti di composti neurotossici come la tetrodotossina, che ucciderebbe un animale anestetizzato per paralisi.

Le sezioni nervose periferiche sono un sistema ex vivo unico poiché vi è un'alta probabilità che le fibre responsabili dei segnali neurali registrati non contengano alcun soma. Poiché questi sarebbero normalmente localizzati, per i motoneuroni, nella colonna vertebrale e per i neuroni sensoriali nei gangli della radice dorsale vicino alla colonna vertebrale, la preparazione di una sezione del nervo dei mammiferi può essere approssimativamente modellata come una raccolta di membrane tubolari con canali ionici, aperti ad entrambe le estremità⁹. Il metabolismo è mantenuto dai mitocondri situati nell'assone al momento della dissezione tissutale¹⁰. La sutura delle estremità aperte dell'axolemma è incoraggiata dopo l'estrazione per chiuderle e quindi aiutare a mantenere i gradienti ionici esistenti attraverso la membrana, che sono essenziali per la normale funzione nervosa.

Per mantenere l'omeostasi tissutale al di fuori del corpo, diverse variabili ambientali devono essere strettamente controllate. Questi sono temperatura¹¹, ossigenazione¹², osmolarità, pH^13,14 e accesso al glucosio per mantenere il metabolismo. Per questo protocollo, l'approccio consiste nell'utilizzare un tampone Krebs-Henseleit^{modificato 15,16} (mKHB) continuamente aerato con una miscela di ossigeno e anidride carbonica. L'mKHB fa parte della famiglia dei tamponi cardioplegici ^6,17 utilizzati per preservare i tessuti sezionati al di fuori del corpo, ad esempio in esperimenti ex vivo. Questi tamponi non contengono emoglobina, antibiotici o antifungini e sono, quindi, adatti solo per preparazioni che coinvolgono piccole quantità di tessuto per un tempo limitato. Il controllo del pH è stato ottenuto con la coppia redox carbonato e anidride carbonica, che richiede un'aerazione costante del tampone con anidride carbonica per mantenere l'equilibrio del pH. Questo per evitare l'uso di altri agenti tampone comuni come HEPES, che possono modificare la funzione delle cellule nervose¹⁸. Per ossigenare il tampone e fornire il controllo del pH, è stata utilizzata una miscela di anidride carbonica al 5% in ossigeno chiamata carbogeno (95_{% O} 2, 5% CO₂). Un agitatore di riscaldamento è stato utilizzato per il controllo della temperatura di un contenitore tampone e il tampone è stato perfuso attraverso un bagno nervoso e quindi rimesso in circolo nel contenitore di partenza. Un esperimento tipico durerebbe 6-8 ore prima che il nervo perda la sua vitalità e non risponda più sufficientemente alla stimolazione affinché le misure siano rappresentative del tessuto sano.

Per ottimizzare il rapporto segnale-rumore, per la registrazione sono stati utilizzati elettrodi di cloruro d'argento, che sono stati preparati secondo i metodi precedentemente descritti¹⁹. Per la stimolazione, è possibile utilizzare una combinazione di elettrodi commerciali per polsini in platino pronti all'uso e elettrodi per polsini in polimero conduttivo su misura. Gli elettrodi per polsini polimerici conduttivi hanno capacità di carica notevolmente più elevate, che sono utili quando si stimola il nervo utilizzando forme d'onda ad alta ampiezza²⁰.

Lo stimolatore utilizzato in questo protocollo è stato precedentemente descritto²⁰. Documentazione, file di progettazione e script software per utilizzarlo sono disponibili pubblicamente²¹. Altri stimolatori possono essere utilizzati per eseguire questo protocollo; tuttavia, lo stimolatore personalizzato è anche in grado di bloccare^{2,20 il blocco 2,20} di corrente alternativa ad alta frequenza (HFAC), che consente una gamma più ampia di esperimenti di neurofisiologia. Per utilizzare il blocco HFAC, si raccomandano polsini in elastomero conduttivo per evitare danni al nervo. I polsini nervosi in elastomero conduttivo sono array di elettrodi morbidi e completamente polimerici prodotti da elastomeri conduttivi come componente conduttivo e polidimetilsilossano come isolamento²². I dispositivi sono stati fabbricati in una configurazione bipolare utilizzando tecniche convenzionali di microfabbricazione laser.

Protocollo

Tutte le procedure e la cura degli animali sono state eseguite con licenze appropriate rilasciate dal Ministero degli Interni del Regno Unito ai sensi dell'Animals (Scientific Procedures) Act (1986) e sono state approvate dall'Animal Welfare and Ethical Review Board dell'Imperial College di Londra.

1. Preparazione dei buffer

NOTA: Questa parte del protocollo può essere eseguita con largo anticipo rispetto al resto del protocollo, ad eccezione delle fasi finali che prevedono la preparazione del tampone Krebs-Henseleit modificato (mKHB) a concentrazione 1x.

1. Preparare la soluzione madre 1 M CaCl₂
   1. Aggiungere 14.701 g di CaCl₂ diidrato a un becher pulito da 100 ml. Aggiungere ~75 ml di acqua deionizzata e mescolare fino alla completa dissoluzione del sale.
   2. Trasferire la soluzione in un matraccio tarato da 100 mL e aggiungere acqua deionizzata fino al raggiungimento di 100 mL di volume. Trasferire la soluzione in un flacone e conservarla in frigorifero a 4 °C.
2. Preparare 10x stock mKHB concentrato
   1. Aggiungere 66,03 g di cloruro di sodio (NaCl), 3,57 g di cloruro di potassio (KCl), 1,63 g di potassio diidrogeno fosfato (KH₂PO₄) e 1,44 g di solfato di magnesio a un becher da 2 L.
   2. Aggiungere ~ 750 ml di acqua deionizzata al becher e mescolare fino a quando i sali si sono sciolti (potrebbero esserci piccoli cristalli di sale lasciati sul fondo). Aggiungere 25 mL di soluzione madre 1 M CaCl₂ (fase 1.1) e mescolare; assicurarsi che questo sia l'ultimo sale aggiunto.
   3. Trasferire la soluzione in un matraccio tarato da 1 L e aggiungere acqua deionizzata per raggiungere un volume totale di 1 L. Trasferire la soluzione in un flacone da 1 L. Conservare concentrato 10x mKHB a 4 °C in frigorifero.
      NOTA: le scorte mKHB concentrate possono essere conservate per circa 1 mese prima della sostituzione.
3. Preparare la dissezione della capsula di Petri (rivestimento)
   1. Preparare una capsula di Petri di vetro pulita (diametro 120 mm) per il rivestimento lavando e asciugando accuratamente il piatto.
   2. Seguendo le istruzioni del produttore per l'uso e la polimerizzazione del rivestimento alcossico conforme, rivestire il fondo della capsula di Petri con ~ 3-5 mm di rivestimento versando con cura la miscela di rivestimento conforme nel piatto fino a raggiungere lo spessore desiderato.
   3. Polimerizzare il rivestimento in forno a 60 °C fino a quando non è fermo al tatto. La dissezione della capsula di Petri è ora pronta.
      NOTA: una pulizia delicata del piatto dopo ogni utilizzo assicurerà che il rivestimento duri per anni prima che sia necessaria la sostituzione. Quando si sostituisce il rivestimento, assicurarsi di rimuovere tutto il materiale di rivestimento prima di applicare un nuovo rivestimento. Si noti che il rivestimento alcosossico conforme (Table of Materials) utilizzato in questo protocollo ha una durata di conservazione inferiore a un anno.

2. Preparazioni pre-dissezione

NOTA: questo passaggio avvia l'esperimento. I passaggi seguenti devono essere eseguiti lo stesso giorno, in questo ordine.

1. Preparare 1x mKHB
   1. Preparare un becher pulito da 2 L per il buffer. Trasferire 200 mL di stock 10x mKHB al becher da 2 L. Aggiungere 2,1 g di carbonato di sodio (NaHCO₃) e 0,99 g di destrosio anidro (D-glucosio) al becher da 2 L.
   2. Aggiungere circa 1 L di acqua deionizzata al becher. Mescolare fino a quando i sali non sono stati completamente sciolti. Trasferire la soluzione in un matraccio tarato da 2 L e aggiungere acqua deionizzata per raggiungere un volume totale di 2 L.
   3. Trasferire la soluzione in un flacone di vetro da 2 L posto su un agitatore riscaldante con la temperatura impostata a 37 °C.
      NOTA: l'agitatore riscaldante più piccolo spesso non sarà in grado di raggiungere la temperatura target di 37 °C a causa dell'inerzia termica di grandi contenitori pieni d'acqua. Regolare la temperatura verso l'alto in modo che il contenuto della bottiglia raggiunga i 37 °C mescolando. Monitorare la temperatura durante l'esperimento e abbassare la temperatura impostata in caso di overshoot.
   4. Posizionare un termometro nella bottiglia da 2 L per monitorare la temperatura, utilizzando pinze per evitare che il termometro venga influenzato dalla pulce in movimento. Aerare il tampone con carbogeno per un minimo di 30 minuti per ossigenare la soluzione. Questo dovrebbe impostare il pH a 7,4. Misurare il pH con un pHmetro per assicurarsi che sia entro 0,1 unità di pH di 7,4 (a 37 °C).
      NOTA: per regolare il pH a 7,4, utilizzare acido cloridrico o idrossido di sodio quando necessario.
   5. Riempire due tubi di centrifuga da 15 mL e una bottiglia da 100 ml con mKHB e metterli sul ghiaccio per raffreddare.
      NOTA: I tubi della centrifuga e la bottiglia possono essere puliti e riutilizzati dopo ogni esperimento senza autoclave.
   6. Per le parti successive dell'esperimento, continuare ad aerare il tampone nel flacone da 2 L con carbogeno a 37 °C con agitazione continua.
      NOTA: l'uso non supervisionato del carbogeno può essere pericoloso se non sono presenti sistemi automatici per interrompere il flusso di gas in caso di perdita. Un sensore automatizzato e una valvola di intercettazione elettronica possono mitigare questo fenomeno; in caso contrario, una persona deve essere lasciata a supervisionare l'apparecchiatura se la dissezione avviene in una stanza diversa. In tutti i casi, è necessario utilizzare un sensore di ossigeno vicino alla configurazione per avvisare gli operatori quando la concentrazione di ossigeno ambientale supera il 25%. Utilizzare una stanza con ventilazione attiva, se possibile.
2. Accendere il dispositivo di acquisizione del segnale, il preamplificatore a basso rumore, il filtro del rumore di linea e l'oscilloscopio per la registrazione e la stimolazione, per consentire un tempo sufficiente per la stabilizzazione della temperatura.
3. Assicurarsi che tutte le apparecchiature di registrazione elettrica siano configurate correttamente
   1. Impostare il preamplificatore a basso rumore su ingresso accoppiato CA con il filtro passa-banda di ingresso impostato su 6 dB roll-off per decennio e frequenze di taglio impostate rispettivamente su 30 Hz e 3 kHz per i filtri passa-alto e passa-basso.
   2. Impostare il guadagno del preamplificatore a basso rumore su 100.

3. Anestesia animale ed eutanasia

NOTA: per gli studi sono state utilizzate femmine di ratto tra 250 e 330 g (Tabella dei materiali).

1. Preparare strumenti chirurgici e materiali di consumo: forbici dritte da 12 cm (smussate); Forbici a molla angolate da 2 mm; Forbici fini di 4 cm, affilate o semi-affilate; # 7 Pinza Dumont; Pinza fine angolata di 45° e seta o filo sutura 6-0.
2. Posizionare il ratto in un contenitore o in una camera di anestesia. Collegare l'ossigeno e il diffusore anestetico al contenitore. Impostare la concentrazione di anestetico (isoflurano) al 3,5% e attendere circa 10 minuti o fino a quando l'animale mostra segni di anestesia come perdita del riflesso di raddrizzamento.
3. Dopo che il ratto mostra segni di anestesia, confermare la perdita di coscienza con un test del riflesso di astinenza del pizzico della punta. Procedere solo quando non c'è prelievo della punta; in caso contrario, controllare tutte le connessioni e i livelli di anestetico nel diffusore e ripetere il passaggio 3.2.
4. Estrarre l'animale dal contenitore e procedere con la lussazione cervicale, seguita dall'incisione di un'arteria femorale per la conferma della morte.

4. Protocollo di dissezione

NOTA: Posizionare l'animale con la pancia in giù sul tavolo di dissezione. Ripeti i seguenti passaggi per entrambe le gambe. In genere, la gamba destra viene sezionata per prima.

1. Tenendo saldamente la caviglia tra il pollice, l'indice e il dito medio, recidere il tendine calcaneare usando forbici smussate dritte di 12 cm.
2. Con le forbici affilate, fai un'incisione cutanea dal tendine calcaneare lungo la parte posteriore della gamba fino alla base della colonna vertebrale, facendo attenzione a non sezionare il tessuto muscolare sottostante.
3. Usando pinze fini e forbici fini, fare incisioni accurate attraverso gli strati muscolari vicino al centro della parte posteriore della gamba fino a quando il nervo sciatico è esposto. Non appena il nervo sciatico è visibile, idratare la cavità usando mKHB ghiacciato per evitare che il nervo si secchi.
4. Usando gli emostati, tirare i lembi della pelle su ciascun lato e mantenere l'incisione aperta per un lavoro di dissezione più fine. Partendo dalla posizione dell'incisione del tendine calcaneare, con forbici fini, interrompere il muscolo sul lato mediale della gamba per liberare il nervo. Continuare a mantenere i livelli di umidità nell'area con mKHB ghiacciato.
5. Mentre il nervo è esposto mentre si muove verso l'alto della gamba, sezionare il tessuto muscolare sovrastante. Liberare il nervo più vicino alla colonna vertebrale dai tessuti connettivi fino a raggiungere la fessura spinale a quel punto c'è un nodo nel nervo. Non tentare di pulire il nervo ancora come la velocità è essenziale in questa fase.
6. Tagliare il nervo il più vicino possibile alla colonna vertebrale con forbici fini. Per facilitare la dissezione, tirare molto delicatamente l'estremità del nervo vicino alla caviglia usando una pinza. Non pizzicare mai il nervo nel mezzo, ma solo le estremità. Non tirare mai un nervo teso.
   OPZIONALE: A questo punto, se il tempo lo consente, è possibile eseguire la sutura di entrambe le estremità del nervo per aiutare a mantenere la vitalità. Mantenere la maneggevolezza al minimo per evitare danni. Se il tempo non è sufficiente (vedere il passaggio 4.5), ignorare questo passaggio e seguire il passaggio 5.2 in seguito.
7. Posizionare il nervo sezionato nel tubo della centrifuga da 15 ml riempito con mKHB (punto 2.1.5), chiudere il tubo e riposizionarlo sul ghiaccio fino all'inizio della procedura di pulizia.
8. Ripetere i passaggi 4.1-4.7 per l'altra gamba. Idealmente, ogni nervo dovrebbe richiedere 5-10 minuti per estrarre, al fine di massimizzare la vitalità dei tessuti.

5. Procedura di pulizia dei nervi

1. Riempire la capsula di Petri rivestita circa a metà strada con mKHB ossigenato refrigerato. Posizionare uno dei nervi sciatici sezionati nel piatto e appuntare entrambe le estremità del nervo al piatto in modo tale che il nervo sia dritto senza attorcigliamenti, torsioni o torsioni. Fissare il nervo il più vicino possibile alle estremità.
2. Usando suture di seta 6-0 o filo sottile, legare un doppio nodo attorno a ciascuna estremità del nervo per evitare la fuoriuscita di citosol nel tampone. Posiziona i nodi proprio accanto agli insetti sul lato più vicino al centro del nervo, in quanto ciò impedirà la fuoriuscita dal tessuto nervoso nel tampone. Non eseguire questo passaggio se il nervo è stato precedentemente legato.
3. Utilizzando il microscopio per la precisione e le forbici a molla angolate da 2 mm, rimuovere grasso, vasi sanguigni e tessuto muscolare dal nervo. Potare eventuali rami nervosi che non verranno utilizzati nel protocollo di stimolazione e registrazione.
   1. Ogni 5 minuti di pulizia, sostituire il tampone con mKHB ossigenato fresco refrigerato. Utilizzare pinze sottili per tirare su tessuti connettivi, grasso e vasi sanguigni per facilitare la dissezione.
4. Riposizionare i nervi nei tubi di trasporto riempiti con mKHB refrigerato fresco ossigenato e posizionare i tubi sul ghiaccio.

6. Configurazione dell'apparecchiatura

NOTA: la configurazione dell'apparecchiatura utilizzata per eseguire esperimenti è illustrata nella Figura 1. In breve, consiste in un bagno nervoso a doppio compartimento, una bottiglia da 2 L posta su un agitatore riscaldante, una fonte di carbogeno per l'aerazione tampone e un tubo per consentire al tampone di fluire dalla bottiglia al bagno e tornare alla bottiglia usando una pompa peristaltica. Il bagno può essere lavorato in plexiglass o stampato in 3D con materiali a tenuta stagna. Ha una profondità di circa 2 cm e la partizione che separa le due camere del bagno presenta un foro di 1,5 mm di diametro per consentire la filettatura di un nervo periferico attraverso entrambe le camere. Una camera è grande, deve essere lunga almeno 4 o 5 cm e sarà riempita con tampone. L'altra camera deve essere lunga almeno 3 cm e sarà riempita con silicone o olio minerale. Il bagno non deve essere reso troppo grande in quanto ciò degraderà il controllo della perfusione, della temperatura e del pH. Possono essere necessarie diverse dimensioni del bagno a seconda delle dimensioni del tessuto nervoso studiato.

1. Preparare un bagno nervoso pulito a doppia camera (vedere File supplementare per le specifiche di progettazione). Posizionare il bagno nervoso sotto il livello della bottiglia da 2 L posta sull'agitatore riscaldante, utilizzando teste e pinze standard da laboratorio. Collegare lo scarico del bagno all'ingresso della pompa peristaltica.
2. Collegare l'uscita della pompa peristaltica a un tubo che riporta al flacone tampone da 2 L. Collegare l'ingresso del bagno a un tubo con una valvola di flusso regolabile e inserire il tubo all'interno della bottiglia da 2 L. Utilizzare una valvola a tre vie con una siringa collegata all'uscita centrale per aiutare con l'adescamento del tubo come sifone per l'afflusso tampone assistito dalla gravità.
3. Innescare il sifone disegnando la siringa fino a quando il buffer non scorre in esso. Configurare la valvola in modo che la portata del tampone nel bagno sia ~5-6 mL·^min-1. Il flusso può essere aumentato inizialmente per riempire il bagno. Una volta che il livello del tampone del bagno ha raggiunto lo scarico, posizionare i nervi nella vasca da bagno.
4. Usando una spilla per insetti, fissare l'estremità del nervo all'angolo della camera da bagno piena di buffer. Usando una pinza fine angolata di 45° e pizzicando il nervo solo alle estremità, infilare con cura il nervo da stimolare attraverso il foro nella partizione tra le due camere da bagno.
5. Fissare l'altra estremità del nervo nella camera dell'olio del bagno con una spilla per insetti, assicurandosi che il nervo sia dritto senza essere allungato e privo di attorcigliamenti e torsioni. Utilizzando grasso siliconico, creare una guarnizione per evitare perdite tampone dalla camera tampone nella camera dell'olio. Riempire la camera dell'olio con silicone o olio minerale.
6. Posizionare i ganci degli elettrodi di registrazione Ag/AgCl nella camera del bagno d'olio e fissarli utilizzando teste e pinze. Drappeggiare la parte del nervo nel bagno d'olio sopra i ganci senza tirare il nervo teso. Non pizzicare il nervo; utilizzare pinze angolate per sollevare il nervo senza pizzicare.
7. Regolare o riparare il sigillo di grasso siliconico se si osservano perdite dopo aver spostato il nervo.
8. Collegare l'elettrodo Ag/AgCl di riferimento alla messa a terra dell'amplificatore e posizionare l'elettrodo nella camera da bagno riempita di tampone fissandolo utilizzando una pinza da laboratorio.

7. Impianto di elettrodi sul nervo nel bagno

1. Preparare un elettrodo per polsino nervoso pulito per la stimolazione secondo il riferimento²¹. Posizionare l'elettrodo nella camera da bagno riempita di tampone. Usando pinze o pinzette sottili con punte smussate o angolate, aprire l'elettrodo nella vasca da bagno per bagnare l'interno del bracciale.
2. Se le bolle rimangono, utilizzare una siringa fine per estrarre il tampone dal bagno e forzare le bolle fuori dal bracciale. Con una pinzetta sotto il nervo, aprire delicatamente il bracciale e farlo scorrere sotto il nervo. Chiudere il bracciale intorno al nervo, avendo cura di evitare qualsiasi attorcigliamento o torsione del nervo.
3. Collegare l'elettrodo di stimolazione allo stimolatore e fissare il cavo dell'elettrodo di stimolazione con del nastro adesivo. Collegare l'elettrodo di ritorno della corrente allo stimolatore e fissare il cavo con del nastro. Se si utilizza un foglio di platino quadrato come elettrodo di ritorno della corrente, posizionare il foglio lontano dal nervo nella vasca da bagno.

8. Stimolazione e registrazione

1. Collegare l'uscita del segnale TTL dello stimolatore al canale 4 dell'oscilloscopio, che verrà utilizzato per attivare l'oscilloscopio. Nella schermata dell'oscilloscopio, premere la scheda Canale trigger e specificare canale 4 come canale di attivazione. Impostare il livello di trigger su 1 V utilizzando la manopola Level .
2. Sull'oscilloscopio, impostare la risoluzione temporale su 1 ms/divisione e la risoluzione di tensione su 10 mV/divisione. Centrare il riferimento del trigger nel tempo e impostare il livello di trigger su 1 V.
   NOTA: seguire i passaggi da 8.3 a 8.6 se si utilizza lo stimolatore personalizzato (vedere Tabella dei materiali). Si presume che il software MATLAB e i driver di dispositivo siano stati installati sul computer di laboratorio utilizzando le istruzioni fornite gratuitamente online per lo stimolatore neurale personalizzato²¹. In caso contrario, seguire le istruzioni del produttore per l'uso di uno stimolatore disponibile in commercio come alternativa.
3. Collegare lo stimolatore al computer di laboratorio. Accendere lo stimolatore collegando l'alimentatore a batteria all'ingresso di alimentazione. Avviare il software MATLAB sul computer di laboratorio.
4. Esegui lo script MATLAB personalizzato: HFAC_4ch_Stimulator_Initialization.m (Table of Materials).
   NOTA: il cavo di comunicazione USB tra il computer e lo stimolatore dovrebbe lampeggiare in verde. In caso contrario, si verifica un errore di configurazione e l'alimentatore e le connessioni devono essere verificati.
5. Apri lo script MATLAB: HFAC_4ch_Monophasic_Stimulation.m (Tabella dei materiali). Modificando direttamente lo script MATLAB, imposta i parametri come segue: ampiezza dell'impulso dello stimolatore = -300 μA, larghezza dell'impulso dello stimolatore = 300 μs, numero dello stimolatore di impulsi = 10 e tempo dello stimolatore tra gli impulsi = 1 s.
6. Avviare il protocollo di stimolazione facendo clic su Esegui nel software MATLAB.

Risultati

I risultati rappresentativi che possono essere ottenuti con questo protocollo sono i potenziali d'azione composti coerenti dalle fibre nervose di tipo A all'interno del nervo sciatico. Questi potenziali d'azione hanno tipicamente un'ampiezza da picco a picco di circa 1 mV all'elettrodo e quindi di 100 mV una volta amplificati (Figura 2). Ampiezze di stimolazione e larghezze di impulso simili dovrebbero produrre ampiezze CAP simili. Gli elettrodi per polsini in elastomero conduttivo richiedon...

Discussione

In questo lavoro, abbiamo descritto un protocollo per preparare i nervi sciatici di ratto per la neurofisiologia ex vivo. L'estrazione dei tessuti richiede circa 30 minuti, compresa la manipolazione degli animali, l'anestesia, l'abbattimento e la dissezione, mentre la pulizia dei nervi, il posizionamento nel bagno e l'impianto dell'elettrodo dovrebbero richiedere altri 30 minuti prima che la registrazione possa essere avviata. La preparazione del buffer può essere eseguita in 30 minuti, anche se questo può ess...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L Glass bottle	VWR International Ltd	215-1595	Borosilicate glass
1 L Glass graduated flask	VWR International Ltd	612-3626	Borosilicate glass
2 L Glass bottle	VWR International Ltd	215-1596	Borosilicate glass
2 L Glass graduated flask	VWR International Ltd	BRND937254	Borosilicate glass
Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT	RS UK	536-2599	push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube
Alkoxy conformal coating	Farnell	1971829	ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation
Anesthetic	Chanelle	N/A	Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle
Beaker, 2 L	VWR International Ltd	213-0469	Borosilicate glass
Bipolar nerve cuff	Cortec GMBH	N/A	800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination
Bossheads	N/A	N/A	Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods
Calcium Chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902-500g	500 g in plastic bottle
Carbogen canister	BOC	N/A	F-size canister
Centrifuge Tubes, 15 mL volume	VWR International Ltd	734-0451	Falcon tubes
Conductive elastomer nerve cuff	N/A	N/A	high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference
Connector, Termimate	Mouser UK	538-505073-1100-LP	These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11)
Crocodile clip connectors	RS UK	212-1203	These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10)
Deionized Water	N/A	N/A	Obtained from deionized water dispenser
Forceps angled 45 degrees	InterFocus Ltd	91110-10	Fine forceps, student range
Forceps standard Dumont #7	InterFocus Ltd	91197-00	Student range forceps
Gas Disperson Tube, Porosity 3	Merck	12547866	N/A
Glucose anhydrous, powder	VWR International Ltd	101174Y	500 g in plastic bottle
Grippers	N/A	N/A	Standard wet laboratory rod-mounted grippers
Heating Stirrer	RS UK	768-9672	Stuart US152
Hemostats	N/A	N/A	Any hemostat >12 cm in length is suitable
Insect Pins, stainless steel, size 2	InterFocus Ltd	26001-45	N/A
Laptop computer	N/A	N/A	Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable
Line Noise Filter	Digitimer	N/A	Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter)
Low-Noise Preamplifier, SR560	Stanford Research Systems	SR560	Low-noise voltage preamplifier
Magnesium Sulphate salt	VWR International Ltd	291184P	500g in plastic bottle
MATLAB scripts	Github	https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch	Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator
MATLAB software	Mathworks	N/A	Standard package
Microscope Light, PL-2000	Photonic	N/A	Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier
Microscope, SMZ 745	Nikon	SM745	Stereoscopic Microscope
Mineral oil, non-toxic	VWR International Ltd	31911.A1	Oil for nerve bath
Nerve Bath	N/A	N/A	Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details.
Oscilloscope	LeCroy	N/A	434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers
Oxygen Hose, 1 meter	BOC	N/A	1/4" NPT terminations
Oxygen Regulator	BOC	C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar	N/A
Peristaltic Pump P-1	Pharmacia Biotech	N/A	Product may be obtained from third party supplier
Petri Dish, Glass	VWR International Ltd	391-0580	N/A
Potassium Chloride salt	Sigma Aldrich	P5405-250g	250 g in plastic bottle
Potassium Dihydrogen Sulphate salt	Merck	1.04873.0250	250 g in plastic bottle
Rat	Charles River Laboratories	N/A	Sprague Dawley, 250-330 grams, female
Reference electrode, ET072	eDaQ (Australia)	ET072-1	Silver silver-chloride reference electrode
Rod	N/A	N/A	Standard wet laboratory rods with fittings for stands
Scale	Sartorius	N/A	M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers
Scissors straight 12 cm edge	InterFocus Ltd	91400-12	blunt-blunt termination, student range
Signal Acquisition Device	Cambridge Electronic Design	Micro3-1401	Micro3-1401 Multichannel ADC
Silicone grease, non-toxic	Farnell	3821559	for sealing of bath partition
Silicone tubing, 2 mm inner diameter	N/A	N/A	N/A
Silicone tubing, 5 mm inner diameter	N/A	N/A	N/A
Silver wire	Alfa Aesar	41390	0.5 mm, annealed
Sodium Bicarbonate salt	Sigma Aldrich	S5761-500g	500 g in plastic bottle
Sodium Chloride salt	VWR International Ltd	27810.295	1 kg in plastic bottle
Spring scissors angled 2 mm edge	InterFocus Ltd	15010-09	N/A
Stand	N/A	N/A	Standard wet laboratory stands with sockets for rods
Stimulator	Digitimer	DS3	DS3 or Custom Stimulator (see references)
Stirring flea	VWR International Ltd	442-0270	For use with the heating stirrer
Syringe tip, blunt, 1 mm diameter	N/A	N/A	N/A
Syringe tip, blunt, 2 mm diameter	N/A	N/A	N/A
Syringe, plastic, 10 mL volume	N/A	N/A	syringe should have luer lock fitting
Tape, water-resistant	N/A	N/A	For securing tubing and wiring to workbench
Thermometer	VWR International Ltd	620-0806	glass thermometer
USB Power Bank	RS UK	135-1000	Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3
Valve, Leuer Lock, 3-Way	VWR International Ltd	229-7440	For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon