Подготовка седалищного нерва крысы к нейрофизиологии Ex Vivo

Резюме

Этот протокол описывает подготовку всей седалищной нервной ткани крысы к электрофизиологической стимуляции ex vivo и запись в экологически регулируемую двухкамерную перфузированную солевую ванну.

Аннотация

Препараты ex vivo позволяют изучать многие нейрофизиологические процессы в отрыве от остального организма при сохранении местной тканевой структуры. Эта работа описывает подготовку седалищных нервов крыс для нейрофизиологии ex vivo, включая буферную подготовку, процедуры для животных, настройку оборудования и нейрофизиологическую запись. В этой работе представлен обзор различных типов экспериментов, возможных с помощью этого метода. Описанный метод направлен на обеспечение 6 ч стимуляции и записи на извлеченной периферической нервной ткани в жестко контролируемых условиях для оптимальной согласованности результатов. Результаты, полученные с помощью этого метода, представляют собой потенциалы действия соединения А-волокна (CAP) с амплитудами от пика до пика в диапазоне милливольт в течение всей продолжительности эксперимента. Амплитуды и формы CAP являются последовательными и надежными, что делает их полезными для тестирования и сравнения новых электродов с существующими моделями или эффектами вмешательств на ткани, такими как использование химических веществ, хирургических изменений или методов нейромодулирующей стимуляции. Как обычные коммерчески доступные манжеты с платино-иридиевыми контактами, так и изготовленные на заказ проводящие эластомерные электроды были протестированы и дали аналогичные результаты с точки зрения реакции силы и продолжительности нервного стимула.

Введение

Современное понимание фундаментальной функции нерва, смоделированной in silico , отсутствует в нескольких аспектах, особенно в отношении эффектов компартментализации нервной ткани за пределами сомы, аксона и дендритов. Взаимодействия аксон-миелин все еще плохо изучены, о чем свидетельствует тот факт, что даже подробные вычислительные модели нервов, такие как MRG¹ (для нервов млекопитающих), которые адекватно захватывают обычный ответ электрической стимуляции, не фиксируют другие экспериментально наблюдаемые модели поведения, такие как перенос высокочастотного блока² или вторичный ответ начала³.

Этот протокол обеспечивает метод эффективного исследования нейрофизиологических процессов на нервном уровне в острой модели малых лабораторных животных, используя стандартизированный протокол подготовки для изоляции нерва, контроля его окружающей среды и удаления его из контекста in vivo в контекст ex vivo. Это предотвратит другие процессы в организме или анестетики, используемые протоколами стимуляции нервов in vivo для изменения поведения нервов и искажения измеренных результатов или их интерпретации ^4,5. Это позволяет разрабатывать более реалистичные модели, ориентированные исключительно на эффекты, специфичные для нервных тканей, которые плохо изучены. Этот протокол также полезен в качестве испытательного стенда для новой стимуляции нервов и регистрации электродных материалов и геометрии, а также новых парадигм стимуляции, таких как высокочастотный блок ^2,3. Вариации этого метода ранее использовались для изучения физиологии нервов в жестко контролируемых условиях⁶, например, для измерения динамики и свойств ионных каналов или эффектов местных анестетиков⁷.

Этот метод обеспечивает несколько преимуществ по сравнению с альтернативами, такими как острые эксперименты in vivo на мелких животных⁸. Этот метод устраняет необходимость поддержания глубины анестезии, поскольку ткань была извлечена из организма, уменьшая количество необходимого оборудования, такого как диффузор анестезии, концентратор кислорода и грелка. Это упрощает экспериментальный протокол, снижая риск ошибок. Поскольку анестетики могут потенциально изменять функцию нерва⁴, этот метод гарантирует, что меры не будут смешаны побочными эффектами от этих анестезирующих соединений. Наконец, этот метод более уместен, чем острые эксперименты in vivo при изучении эффектов нейротоксичных соединений, таких как тетродотоксин, которые убивают обезболенное животное параличом.

Периферические нервные участки являются уникальной системой ex vivo , поскольку существует высокая вероятность того, что волокна, ответственные за записанные нейронные сигналы, не содержат никакой сомы. Поскольку они обычно расположены, для двигательных нейронов в позвоночнике и для сенсорных нейронов в дорсальных корневых ганглиях рядом с позвоночником, подготовка участка нерва млекопитающих может быть грубо смоделирована как набор трубчатых мембран с ионными каналами, открытыми на обоих концах⁹. Метаболизм поддерживается митохондриями, расположенными в аксоне в момент рассечения ткани¹⁰. Швы открытых концов аксолеммы поощряются после экстракции, чтобы закрыть их и тем самым помочь поддерживать существующие ионные градиенты по всей мембране, которые необходимы для нормальной функции нерва.

Чтобы поддерживать тканевый гомеостаз вне организма, необходимо жестко контролировать несколько переменных окружающей среды. Это температура¹¹, оксигенация¹², осмолярность, рН^13,14 и доступ к глюкозе для поддержания метаболизма. Для этого протокола подход заключается в использовании модифицированного буфера Кребса-Хенселейта^15,16 (mKHB), непрерывно аэрированного смесью кислорода и углекислого газа. MKHB относится к семейству кардиоплегических буферов ^6,17, используемых для сохранения рассеченных тканей вне организма, например, в экспериментах ex vivo. Эти буферы не содержат гемоглобина, антибиотиков или противогрибковых препаратов и, следовательно, подходят только для препаратов с участием небольших количеств ткани в течение ограниченного времени. Контроль pH был достигнут с помощью карбонатной и углекислотной окислительно-восстановительной пары, требующей постоянной аэрации буфера углекислым газом для поддержания равновесия рН. Это делается для того, чтобы избежать использования других распространенных буферных агентов, таких как HEPES, которые могут модифицировать функцию нервных клеток¹⁸. Для насыщения буфера кислородом и обеспечения контроля рН использовалась смесь 5% углекислого газа в кислороде, называемая карбогеном (95% O₂, 5% CO₂). Нагревательную мешалку использовали для контроля температуры буферного контейнера, и буфер перфузировали через нервную ванну, а затем рециркулировали в исходный контейнер. Типичный эксперимент будет длиться 6-8 часов, прежде чем нерв потеряет свою жизнеспособность и больше не будет достаточно реагировать на стимуляцию, чтобы меры были репрезентативными для здоровой ткани.

Для оптимизации отношения сигнал/шум для записи использовали серебристо-хлоридные электроды, которые готовили согласно ранее описанным способам¹⁹. Для стимуляции может использоваться комбинация коммерческих готовых платиновых манжетных электродов и изготовленных на заказ проводящих полимерных манжетных электродов. Проводящие полимерные манжеты электроды имеют заметно более высокую емкость заряда, которые полезны при стимуляции нерва с использованием высокоамплитудных сигналов²⁰.

Стимулятор, используемый в этом протоколе, был ранее описан²⁰. Документация, файлы проектирования и программные сценарии для его использования являются общедоступными²¹. Другие стимуляторы могут быть использованы для выполнения этого протокола; однако пользовательский стимулятор также способен использовать блок^2,20 высокочастотного альтернативного тока (HFAC), что позволяет проводить более широкий спектр нейрофизиологических экспериментов. Для использования блока HFAC рекомендуются проводящие эластомерные манжеты, чтобы избежать повреждения нерва. Манжеты проводящих эластомерных нервов представляют собой мягкие и полностью полимерные электродные массивы, изготовленные из проводящих эластомеров в качестве проводящего компонента и полидиметилсилоксана в качестве изоляции²². Устройства были изготовлены в биполярной конфигурации с использованием обычных методов лазерного микропроизводства.

протокол

Все процедуры по уходу за животными были выполнены в соответствии с соответствующими лицензиями, выданными Министерством внутренних дел Великобритании в соответствии с Законом о животных (научные процедуры) (1986 год) и были одобрены Советом по благополучию и этическому надзору за животными Имперского колледжа Лондона.

1. Подготовка буферов

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть протокола может быть выполнена задолго до остальной части протокола, за исключением заключительных этапов, включающих получение модифицированного буфера Кребса-Хенселейта (mKHB) при концентрации 1x.

1. Подготовьте 1 M CaCl₂ стокового раствора
   1. Добавьте 14,701 г дигидрата_CaCl2 в чистый стакан объемом 100 мл. Добавьте ~75 мл деионизированной воды и перемешайте до полного растворения соли.
   2. Переложите раствор в градуированную колбу объемом 100 мл и добавьте деионизированную воду до тех пор, пока не будет достигнут объем 100 мл. Переложите раствор во флакон и храните в холодильнике при 4 °C.
2. Подготовьте 10-кратный концентрированный запас мКХБ
   1. Добавьте 66,03 г хлорида натрия (NaCl), 3,57 г хлорида калия (KCl), 1,63 г дигидрофосфата калия (KH₂PO₄) и 1,44 г сульфата магния в стакан 2 л.
   2. Добавьте ~750 мл деионизированной воды в стакан и перемешивайте до тех пор, пока соли не растворятся (на дне могут остаться небольшие кристаллы соли). Добавить 25 мл 1 М_CaCl2 раствора (стадия 1.1) и перемешать; убедитесь, что это последняя добавленная соль.
   3. Переложите раствор в градуированную колбу объемом 1 л и добавьте деионизированную воду до общего объема 1 л. Переложите раствор в бутылку объемом 1 л. Хранить в холодильнике концентрированный 10x мКХБ при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрированный запас mKHB может храниться в течение примерно 1 месяца до замены.
3. Приготовить рассечение чашки Петри (покрытие)
   1. Подготовьте чистую стеклянную чашку Петри (диаметром 120 мм) для покрытия, тщательно вымыв и высушив посуду.
   2. Следуя инструкциям производителя по использованию и отверждению конформного алкокси-покрытия, покройте дно чашки Петри ~ 3-5 мм покрытия, тщательно вливая конформную смесь покрытия в посуду до тех пор, пока не будет достигнута желаемая толщина.
   3. Отверните покрытие в духовке при 60 °C до тех пор, пока оно не станет твердым на ощупь. Рассечение чашки Петри готово.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Бережная очистка посуды после каждого использования гарантирует, что покрытие прослужит в течение многих лет, прежде чем потребуется замена. При замене покрытия убедитесь, что перед нанесением нового покрытия необходимо удалить весь материал покрытия. Обратите внимание, что конформное алкокси-покрытие (Таблица материалов), используемое в этом протоколе, имеет срок годности менее года.

2. Препараты перед рассечением

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом шаге запускается эксперимент. Следующие шаги должны быть выполнены в тот же день, в таком порядке.

1. Приготовьте 1x mKHB
   1. Подготовьте чистый 2-литровый стакан для буфера. Переложите 200 мл запаса 10x mKHB на стакан 2 л. Добавьте 2,1 г карбоната натрия (NaHCO₃) и 0,99 г безводной декстрозы (D-глюкозы) к стакану 2 л.
   2. Добавьте примерно 1 л деионизированной воды в стакан. Перемешивайте до полного растворения солей. Переложите раствор в градуированную колбу объемом 2 л и добавьте деионизированную воду до общего объема 2 л.
   3. Переложите раствор в стеклянную бутылку объемом 2 л, помещенную на нагревательную мешалку с температурой 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Меньшая нагревательная мешалка часто не может достичь целевой температуры 37 ° C из-за тепловой инерции больших контейнеров, полных воды. Отрегулируйте температуру вверх, чтобы содержимое бутылки достигало 37 °C при перемешивании. Следите за температурой во время эксперимента и понижайте заданную температуру в случае превышения.
   4. Поместите термометр в бутылку объемом 2 л, чтобы контролировать температуру, используя захваты, чтобы предотвратить воздействие перемешивающейся блохи на термометр. Аэрировать буфер карбогеном в течение минимум 30 мин, чтобы насытить раствор кислородом. Это должно установить pH равным 7,4. Измерьте pH с помощью pH-метра, чтобы убедиться, что он находится в пределах 0,1 единицы pH 7,4 (при 37 °C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы отрегулировать рН до 7,4, используйте соляную кислоту или гидроксид натрия, когда это необходимо.
   5. Наполните мХБ две трубки центрифуги объемом 15 мл и одну бутылку объемом 100 мл и поместите их на лед для охлаждения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифужные трубки и бутылка могут быть очищены и повторно использованы после каждого эксперимента без автоклавирования.
   6. Для более поздних частей эксперимента продолжают аэрировать буфер в 2-литровом флаконе карбогеном при 37 °C при непрерывном перемешивании.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Неконтролируемое использование карбогена может быть опасным, если отсутствуют автоматические системы отключения потока газа в случае утечки. Автоматизированный датчик и электронный запорный клапан могут смягчить это; в противном случае человек должен быть оставлен для наблюдения за оборудованием, если вскрытие происходит в другом помещении. Во всех случаях датчик кислорода следует использовать рядом с установкой, чтобы предупредить операторов, когда концентрация кислорода в окружающей среде поднимается выше 25%. По возможности используйте помещение с активной вентиляцией.
2. Включите устройство сбора сигнала, малошумящий предусилитель, фильтр линейного шума и осциллограф для записи и стимуляции, чтобы обеспечить достаточно времени для стабилизации температуры.
3. Убедитесь, что все электрорегистраторное оборудование правильно настроено
   1. Установите малошумящий предусилитель на вход, связанный с переменным током, с входным полосовым фильтром, установленным на 6 дБ в десятилетие, и частотами среза 30 Гц и 3 кГц для фильтров высоких и нижних частот соответственно.
   2. Установите коэффициент усиления малошумящего предусилителя равным 100.

3. Обезболивание и эвтаназия животных

ПРИМЕЧАНИЕ: Для исследований использовались самки крыс весом от 250 до 330 г (Таблица материалов).

1. Подготовьте хирургические инструменты и расходные материалы: 12 см прямыми ножницами (тупыми); 2 мм режущие кромки угловые пружинные ножницы; 4 см тонкие ножницы, острые или полуострые; #7 Щипцы Дюмона; 45° под углом тонкие щипцы и 6-0 шов шелка или нити.
2. Поместите крысу в контейнер для анестезии или камеру. Подключите кислород и обезболивающий диффузор к контейнеру. Установите концентрацию анестетика (изофлурана) на 3,5% и подождите примерно 10 минут или до тех пор, пока у животного не появятся признаки анестезии, такие как потеря корректирующего рефлекса.
3. После того, как у крысы появятся признаки анестезии, подтвердите потерю сознания с помощью рефлекса отмены пальца ноги. Продолжайте только тогда, когда нет снятия пальца ноги; в противном случае проверьте все соединения и уровни анестезии в диффузоре и повторите шаг 3.2.
4. Выньте животное из контейнера и приступайте к вывиху шейки матки с последующим разрезанием бедренной артерии для подтверждения смерти.

4. Протокол вскрытия

ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите животное животом вниз на стол для вскрытия. Повторите следующие шаги для обеих ног. Как правило, сначала рассекают правую ногу.

1. Крепко удерживая лодыжку между большим, указательным и средним пальцами, отрежьте пяточное сухожилие с помощью 12 см прямых тупых ножниц.
2. Тонкими острыми ножницами сделайте разрез кожи от пяточного сухожилия вдоль задней части ноги до основания позвоночника, следя за тем, чтобы не рассекать мышечную ткань внизу.
3. Используя тонкие щипцы и тонкие ножницы, делайте осторожные разрезы через мышечные слои около середины задней части ноги, пока седалищный нерв не будет обнажен. Как только седалищный нерв будет виден, увлажните полость с помощью ледяного mKHB, чтобы предотвратить высыхание нерва.
4. Используя гемостаты, раздвиньте лоскуты кожи с каждой стороны и держите разрез открытым для более тонкой работы по рассечению. Начиная с расположения разреза сухожилия пяточной кишки, тонкими ножницами прерывают мышцу на медиальной стороне ноги, чтобы освободить нерв. Продолжайте поддерживать уровень влажности в этом районе с помощью ледяного mKHB.
5. Поскольку нерв обнажается при движении вверх по ноге, рассекайте вышележащую мышечную ткань. Освободите нерв ближе к позвоночнику от соединительных тканей до достижения расщелины позвоночника, после чего в этой точке возникает перегиб в нерве. Пока не пытайтесь очистить нерв, так как скорость необходима на этом этапе.
6. Отрежьте нерв как можно ближе к позвоночнику тонкими ножницами. Чтобы сделать рассечение легче, очень осторожно потяните конец нерва возле лодыжки с помощью щипцов. Никогда не защемляйте нерв посередине, а только концы. Никогда не дергайте нерв подтянутым.
   НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: На этом этапе, если позволяет время, можно провести ушивание обоих концов нерва, чтобы помочь сохранить жизнеспособность. Сведите управляемость к минимуму, чтобы предотвратить повреждение. Если времени недостаточно (см. шаг 4.5), пропустите этот шаг и следуйте шагу 5.2 позже.
7. Поместите рассеченный нерв в центрифужную трубку объемом 15 мл, заполненную mKHB (шаг 2.1.5), закройте трубку и поместите трубку обратно на лед до начала процедуры очистки.
8. Повторите шаги 4.1-4.7 для другой ноги. В идеале, каждый нерв должен занять 5-10 минут для извлечения, чтобы максимизировать жизнеспособность ткани.

5. Процедура очистки нервов

1. Наполните покрытую оболочкой чашку Петри примерно наполовину охлажденным кислородом mKHB. Поместите один из рассеченных седалищных нервов в чашку и прикрепите оба конца нерва к чашке так, чтобы нерв был прямым без перегибов, перекрутов или скручиваний. Зажмите нерв как можно ближе к концам.
2. Используя 6-0 шелковых швов или тонкую нить, завяжите двойной узел вокруг каждого конца нерва, чтобы предотвратить утечку цитозола в буфер. Поместите узлы прямо рядом со штифтами насекомых сбоку ближе к центру нерва, так как это предотвратит утечку из нервной ткани в буфер. Не проводите этот этап, если нерв был предварительно перевязан.
3. Используя микроскоп для точности и 2 мм угловых пружинных ножниц, удалите жир, кровеносные сосуды и мышечную ткань из нерва. Обрежьте любые нервные ветви, которые не будут использоваться в протоколе стимуляции и записи.
   1. Каждые 5 мин очистки заменяйте буфер свежеохлажденным оксигенированным мКХБ. Используйте тонкие щипцы, чтобы потянуть за соединительные ткани, жир и кровеносные сосуды, чтобы облегчить рассечение.
4. Поместите нервы обратно в транспортные трубки, заполненные свежим охлажденным кислородом mKHB, и поместите трубки на лед.

6. Настройка оборудования

ПРИМЕЧАНИЕ: Установка оборудования, используемого для проведения экспериментов, проиллюстрирована на рисунке 1. Короче говоря, он состоит из двухкамерной нервной ванны, бутылки объемом 2 л, помещенной на нагревательную мешалку, источника карбогена для буферной аэрации и трубки, позволяющей буферу течь из бутылки в ванну и обратно в бутылку с помощью перистальтического насоса. Ванна может быть выточена из плексигласа или напечатана на 3D-принтере из водонепроницаемых материалов. Он имеет глубину около 2 см, а перегородка, разделяющая две камеры ванны, имеет отверстие диаметром 1,5 мм, чтобы позволить резьбу периферического нерва через обе камеры. Одна камера большая, должна быть не менее 4 или 5 см в длину и будет заполнена буфером. Другая камера должна быть длиной не менее 3 см и будет заполнена силиконом или минеральным маслом. Ванна не должна быть слишком большой, так как это ухудшит контроль перфузии, температуры и pH. Могут потребоваться различные размеры ванны в зависимости от размера исследуемой нервной ткани.

1. Подготовьте чистую двухкамерную нервную ванну (см. Дополнительный файл для спецификаций конструкции). Поместите нервную ванну ниже уровня бутылки объемом 2 л, помещенной на нагревательную мешалку, используя стандартные лабораторные головки и захваты. Подключите слив ванны к входу перистальтического насоса.
2. Подключите выходное отверстие перистальтического насоса к трубке, ведущей обратно к буферной бутылке объемом 2 л. Подключите входное отверстие для ванны к трубке с помощью регулируемого клапана потока и поместите трубку внутрь бутылки объемом 2 л. Используйте трехсторонний клапан со шприцем, соединенным со средним выпускным отверстием, чтобы помочь с заправкой трубки в качестве сифона для гравитационного буферного притока.
3. Загрунтуйте сифон, нарисовав шприц до тех пор, пока в него не потечет буфер. Сконфигурируйте клапан таким образом, чтобы скорость потока буфера в ванну составляла ~5-6 мл·^мин-1. Поток может быть увеличен изначально, чтобы заполнить ванну. Как только уровень буфера ванны достигнет дренажа, поместите нервы в ванну.
4. Используя штифт насекомого, закрепите конец нерва в углу заполненной буфером ванны камеры. Используя 45° под углом тонкие щипцы и защемляя нерв только на концах, осторожно проденьте нерв, подлежащий стимуляции, через отверстие в перегородке между двумя ванными камерами.
5. Закрепите другой конец нерва в масляной камере ванны с помощью штифта насекомого, гарантируя, что нерв будет прямым, не растягиваясь и свободным от перегибов и скручиваний. Используя силиконовую смазку, сделайте уплотнение для предотвращения утечки буфера из буферной камеры в масляную камеру. Заполните масляную камеру силиконовым или минеральным маслом.
6. Поместите крючки регистрирующих электродов Ag/AgCl в камеру масляной ванны и закрепите их с помощью головок босса и захватов. Задрапируйте часть нерва в масляной ванне над крючками, не вытягивая нерв подтянутым. Не защемляйте нерв; используйте угловые щипцы, чтобы поднять нерв без защемления.
7. Отрегулируйте или отремонтируйте силиконовое жирное уплотнение, если наблюдается какая-либо утечка после перемещения нерва.
8. Подключите опорный электрод Ag/AgCl к заземлению усилителя и поместите электрод в заполненную буфером камеру ванны, закрепив ее с помощью лабораторного захвата.

7. Имплантация электрода на нерв в ванне

1. Подготовьте чистый электрод нервной манжеты для стимуляции в соответствии со ссылкой²¹. Поместите электрод в заполненную буфером камеру ванны. Используя щипцы или тонкий пинцет с тупыми или угловыми кончиками, откройте электрод в ванне, чтобы намочить внутреннюю часть манжеты.
2. Если пузырьки остаются, используйте тонкий шприц, чтобы вытащить буфер из ванны и вытолкнуть пузырьки из манжеты. Пинцетом под нерв осторожно откройте манжету и засуньте ее под нерв. Закройте манжету вокруг нерва, заботясь о том, чтобы избежать перегиба или скручивания нерва.
3. Подключите стимулирующий электрод к стимулятору и закрепите провод стимулирующего электрода лентой. Подключите возвратный электрод тока к стимулятору и закрепите провод скотчем. Если в качестве электрода возврата тока используется квадратный платиновый лист, расположите лист подальше от нерва в ванне.

8. Стимуляция и запись

1. Подключите выходной сигнал стимулятора TTL к каналу 4 осциллографа, который будет использоваться для запуска осциллографа. На экране осциллографа нажмите вкладку Триггерный канал и укажите Канал 4 в качестве триггерного канала. Установите уровень триггера на 1 В с помощью ручки уровня .
2. На осциллографе установите временное разрешение 1 мс/деление и разрешение напряжения 10 мВ/деление. Центрируйте ссылку на триггер во времени и установите уровень триггера равным 1 В.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги с 8.3 по 8.6 при использовании пользовательского стимулятора (см. Таблицу материалов). Предполагается, что программное обеспечение MATLAB и драйверы устройств были установлены на лабораторном компьютере с использованием инструкций, свободно предоставляемых онлайн для пользовательского нейронного стимулятора²¹. В противном случае следуйте инструкциям производителя по использованию коммерчески доступного стимулятора в качестве альтернативы.
3. Подключите стимулятор к лабораторному компьютеру. Включите стимулятор, подключив блок питания аккумулятора к входу питания. Запустите программное обеспечение MATLAB на лабораторном компьютере.
4. Выполните пользовательский скрипт MATLAB: HFAC_4ch_Stimulator_Initialization.m (Таблица материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кабель связи USB между компьютером и стимулятором должен мигать зеленым цветом. Если этого не происходит, то возникает ошибка конфигурации, и блок питания и соединения должны быть проверены.
5. Откройте скрипт MATLAB: HFAC_4ch_Monophasic_Stimulation.00 (Таблица материалов). Непосредственно редактируя скрипт MATLAB, задайте параметры следующим образом: амплитуда импульса стимулятора = -300 мкА, ширина импульса стимулятора = 300 мкс, число импульсов стимулятора = 10 и время стимулятора между импульсами = 1 с.
6. Запустите протокол стимуляции, щелкнув Выполнить в программном обеспечении MATLAB.

Результаты

Репрезентативными результатами, которые могут быть получены с помощью этого протокола, являются последовательные потенциалы действия соединения из нервных волокон А-типа в седалищном нерве. Эти потенциалы действия обычно имеют амплитуду от пика до пика приблизительно 1 мВ на электро?...

Обсуждение

В этой работе мы описали протокол подготовки седалищных нервов крыс для нейрофизиологии ex vivo. Экстракция тканей занимает около 30 минут, включая обработку животных, анестезию, выбраковку и рассечение, в то время как очистка нервов, помещение в ванну и имплантация электрода должны п?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L Glass bottle	VWR International Ltd	215-1595	Borosilicate glass
1 L Glass graduated flask	VWR International Ltd	612-3626	Borosilicate glass
2 L Glass bottle	VWR International Ltd	215-1596	Borosilicate glass
2 L Glass graduated flask	VWR International Ltd	BRND937254	Borosilicate glass
Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT	RS UK	536-2599	push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube
Alkoxy conformal coating	Farnell	1971829	ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation
Anesthetic	Chanelle	N/A	Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle
Beaker, 2 L	VWR International Ltd	213-0469	Borosilicate glass
Bipolar nerve cuff	Cortec GMBH	N/A	800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination
Bossheads	N/A	N/A	Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods
Calcium Chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902-500g	500 g in plastic bottle
Carbogen canister	BOC	N/A	F-size canister
Centrifuge Tubes, 15 mL volume	VWR International Ltd	734-0451	Falcon tubes
Conductive elastomer nerve cuff	N/A	N/A	high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference
Connector, Termimate	Mouser UK	538-505073-1100-LP	These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11)
Crocodile clip connectors	RS UK	212-1203	These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10)
Deionized Water	N/A	N/A	Obtained from deionized water dispenser
Forceps angled 45 degrees	InterFocus Ltd	91110-10	Fine forceps, student range
Forceps standard Dumont #7	InterFocus Ltd	91197-00	Student range forceps
Gas Disperson Tube, Porosity 3	Merck	12547866	N/A
Glucose anhydrous, powder	VWR International Ltd	101174Y	500 g in plastic bottle
Grippers	N/A	N/A	Standard wet laboratory rod-mounted grippers
Heating Stirrer	RS UK	768-9672	Stuart US152
Hemostats	N/A	N/A	Any hemostat >12 cm in length is suitable
Insect Pins, stainless steel, size 2	InterFocus Ltd	26001-45	N/A
Laptop computer	N/A	N/A	Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable
Line Noise Filter	Digitimer	N/A	Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter)
Low-Noise Preamplifier, SR560	Stanford Research Systems	SR560	Low-noise voltage preamplifier
Magnesium Sulphate salt	VWR International Ltd	291184P	500g in plastic bottle
MATLAB scripts	Github	https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch	Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator
MATLAB software	Mathworks	N/A	Standard package
Microscope Light, PL-2000	Photonic	N/A	Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier
Microscope, SMZ 745	Nikon	SM745	Stereoscopic Microscope
Mineral oil, non-toxic	VWR International Ltd	31911.A1	Oil for nerve bath
Nerve Bath	N/A	N/A	Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details.
Oscilloscope	LeCroy	N/A	434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers
Oxygen Hose, 1 meter	BOC	N/A	1/4" NPT terminations
Oxygen Regulator	BOC	C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar	N/A
Peristaltic Pump P-1	Pharmacia Biotech	N/A	Product may be obtained from third party supplier
Petri Dish, Glass	VWR International Ltd	391-0580	N/A
Potassium Chloride salt	Sigma Aldrich	P5405-250g	250 g in plastic bottle
Potassium Dihydrogen Sulphate salt	Merck	1.04873.0250	250 g in plastic bottle
Rat	Charles River Laboratories	N/A	Sprague Dawley, 250-330 grams, female
Reference electrode, ET072	eDaQ (Australia)	ET072-1	Silver silver-chloride reference electrode
Rod	N/A	N/A	Standard wet laboratory rods with fittings for stands
Scale	Sartorius	N/A	M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers
Scissors straight 12 cm edge	InterFocus Ltd	91400-12	blunt-blunt termination, student range
Signal Acquisition Device	Cambridge Electronic Design	Micro3-1401	Micro3-1401 Multichannel ADC
Silicone grease, non-toxic	Farnell	3821559	for sealing of bath partition
Silicone tubing, 2 mm inner diameter	N/A	N/A	N/A
Silicone tubing, 5 mm inner diameter	N/A	N/A	N/A
Silver wire	Alfa Aesar	41390	0.5 mm, annealed
Sodium Bicarbonate salt	Sigma Aldrich	S5761-500g	500 g in plastic bottle
Sodium Chloride salt	VWR International Ltd	27810.295	1 kg in plastic bottle
Spring scissors angled 2 mm edge	InterFocus Ltd	15010-09	N/A
Stand	N/A	N/A	Standard wet laboratory stands with sockets for rods
Stimulator	Digitimer	DS3	DS3 or Custom Stimulator (see references)
Stirring flea	VWR International Ltd	442-0270	For use with the heating stirrer
Syringe tip, blunt, 1 mm diameter	N/A	N/A	N/A
Syringe tip, blunt, 2 mm diameter	N/A	N/A	N/A
Syringe, plastic, 10 mL volume	N/A	N/A	syringe should have luer lock fitting
Tape, water-resistant	N/A	N/A	For securing tubing and wiring to workbench
Thermometer	VWR International Ltd	620-0806	glass thermometer
USB Power Bank	RS UK	135-1000	Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3
Valve, Leuer Lock, 3-Way	VWR International Ltd	229-7440	For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon