Vorbereitung des Rattenischiasnervs für die Ex-vivo-Neurophysiologie

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung von ganzem Ischiasnervengewebe der Ratte für die elektrophysiologische Stimulation ex vivo und die Aufzeichnung in einem umweltregulierten, durchbluteten Salzbad mit zwei Kompartimenten.

Zusammenfassung

Ex-vivo-Präparate ermöglichen es, viele neurophysiologische Prozesse isoliert vom Rest des Körpers zu untersuchen und gleichzeitig die lokale Gewebestruktur zu erhalten. Diese Arbeit beschreibt die Vorbereitung von Rattenischiasnerven für die Ex-vivo-Neurophysiologie , einschließlich Puffervorbereitung, Tierverfahren, Geräteaufbau und neurophysiologische Aufzeichnung. Diese Arbeit gibt einen Überblick über die verschiedenen Arten von Experimenten, die mit dieser Methode möglich sind. Die skizzierte Methode zielt darauf ab, 6 h Stimulation und Aufzeichnung auf extrahiertem peripherem Nervengewebe unter streng kontrollierten Bedingungen für eine optimale Konsistenz der Ergebnisse bereitzustellen. Die mit dieser Methode erzielten Ergebnisse sind A-Faserverbindungswirkungspotentiale (CAP) mit Peak-to-Peak-Amplituden im Millivoltbereich über die gesamte Dauer des Experiments. CAP-Amplituden und -Formen sind konsistent und zuverlässig, was sie nützlich macht, um neue Elektroden mit bestehenden Modellen zu testen und zu vergleichen, oder die Auswirkungen von Eingriffen auf das Gewebe, wie die Verwendung von Chemikalien, chirurgische Veränderungen oder neuromodulatorische Stimulationstechniken. Sowohl herkömmliche handelsübliche Manschettenelektroden mit Platin-Iridium-Kontakten als auch maßgeschneiderte leitfähige Elastomerelektroden wurden getestet und lieferten ähnliche Ergebnisse in Bezug auf die Nervenreizstärke-Dauer-Reaktion.

Einleitung

Das derzeitige Verständnis der grundlegenden Nervenfunktion, wie sie in silico modelliert wird, fehlt in mehreren Aspekten, insbesondere in Bezug auf die Auswirkungen der Kompartimentierung von Nervengewebe außerhalb des Somas, Axons und der Dendriten. Axon-Myelin-Wechselwirkungen sind immer noch wenig verstanden, wie die Tatsache zeigt, dass selbst detaillierte Computernervenmodelle wie MRG¹ (für Säugetiernerven), die die konventionelle elektrische Stimulationsreaktion angemessen erfassen, andere experimentell beobachtete Verhaltensweisen wie Hochfrequenz-Blockübertragung^{2 oder sekundäre} Beginnantwort³ nicht erfassen.

Dieses Protokoll bietet eine Methode, um neurophysiologische Prozesse auf Nervenebene in einem akuten Kleinlabortiermodell effizient zu untersuchen, wobei ein standardisiertes Vorbereitungsprotokoll verwendet wird, um den Nerv zu isolieren, seine Umgebung zu kontrollieren und ihn aus einem In-vivo-Kontext in einen Ex-vivo-Kontext zu entfernen. Dies verhindert andere Körperprozesse oder Anästhetika, die von In-vivo-Nervenstimulationsprotokollen verwendet werden, um das Nervenverhalten zu verändern und die Messergebnisse oder deren Interpretation zu verfälschen ^4,5. Dies ermöglicht die Entwicklung realistischerer Modelle, die sich ausschließlich auf Effekte konzentrieren, die für Nervengewebe spezifisch sind und kaum verstanden werden. Dieses Protokoll ist auch als Testumgebung für neue Nervenstimulation und Aufzeichnung von Elektrodenmaterialien und -geometrien sowie für neue Stimulationsparadigmen wie Hochfrequenzblock ^2,3 nützlich. Variationen dieser Technik wurden zuvor verwendet, um die Nervenphysiologie unter streng kontrollierten Bedingungen zu untersuchen⁶, zum Beispiel um die Dynamik und Eigenschaften von Ionenkanälen oder die Auswirkungen von Lokalanästhetika zu messen⁷.

Diese Technik bietet mehrere Vorteile im Vergleich zu Alternativen wie akuten In-vivo-Kleintierversuchen ⁸. Die Technik macht es überflüssig, die Anästhesietiefe aufrechtzuerhalten, da das Gewebe aus dem Körper extrahiert wurde, wodurch die erforderliche Ausrüstung wie ein Anästhesiediffusor, ein Sauerstoffkonzentrator und ein Heizkissen reduziert werden. Dies vereinfacht das experimentelle Protokoll und reduziert das Risiko von Fehlern. Da Anästhetika möglicherweise die Nervenfunktion⁴ verändern können, stellt diese Technik sicher, dass die Maßnahmen nicht durch Nebenwirkungen dieser Anästhesieverbindungen beeinträchtigt werden. Schließlich ist diese Technik besser geeignet als akute In-vivo-Experimente , wenn die Auswirkungen neurotoxischer Verbindungen wie Tetrodotoxin untersucht werden, die ein betäubtes Tier durch Lähmung töten würden.

Periphere Nervenabschnitte sind ein einzigartiges Ex-vivo-System , da eine hohe Wahrscheinlichkeit besteht, dass die Fasern, die für aufgezeichnete neuronale Signale verantwortlich sind, kein Soma enthalten. Da sich diese normalerweise für Motoneuronen in der Wirbelsäule und für sensorische Neuronen in den dorsalen Wurzelganglien neben der Wirbelsäule befinden würden, kann die Vorbereitung eines Abschnitts des Säugetiernervs grob als eine Ansammlung von röhrenförmigen Membranen mit Ionenkanälen modelliert werden, die an beiden Enden offen sind⁹. Der Stoffwechsel wird durch die Mitochondrien aufrechterhalten, die sich zum Zeitpunkt der Gewebedissektion¹⁰ im Axon befinden. Das Nähen der offenen Enden des Axolemmas wird nach der Extraktion angeregt, um sie zu schließen und dadurch dazu beizutragen, bestehende ionische Gradienten über die Membran aufrechtzuerhalten, die für eine normale Nervenfunktion unerlässlich sind.

Um die Gewebehomöostase außerhalb des Körpers aufrechtzuerhalten, müssen mehrere Umweltvariablen streng kontrolliert werden. Dies sind Temperatur 11, Sauerstoffversorgung¹², Osmolarität, pH^13,14 und Zugang zu Glukose^, um den Stoffwechsel aufrechtzuerhalten. Für dieses Protokoll besteht der Ansatz darin, einen modifizierten Krebs-Henseleit-Puffer^15,16 (mKHB) zu verwenden^, der kontinuierlich mit einer Mischung aus Sauerstoff und Kohlendioxid belüftet wird. Das mKHB gehört zur Familie der kardioplegikaischen Puffer ^6,17, die zur Konservierung von seziertem Gewebe außerhalb des Körpers verwendet werden, beispielsweise in Ex-vivo-Experimenten. Diese Puffer enthalten kein Hämoglobin, keine Antibiotika oder Antimykotika und eignen sich daher nur für Präparate, bei denen kleine Gewebemengen für eine begrenzte Zeit verwendet werden. Die pH-Kontrolle wurde mit dem Karbonat- und Kohlendioxid-Redoxpaar erreicht, was eine ständige Belüftung des Puffers mit Kohlendioxid erfordert, um das pH-Gleichgewicht aufrechtzuerhalten. Dies dient dazu, die Verwendung anderer gängiger Puffermittel wie HEPES zu vermeiden, die die Nervenzellfunktion¹⁸ modifizieren können. Um den Puffer mit Sauerstoff zu versorgen und den pH-Wert zu kontrollieren, wurde eine Mischung aus 5% Kohlendioxid in Sauerstoff namens Carbogen (95%_O2, 5% CO₂) verwendet. Ein Heizrührer wurde zur Temperaturregelung eines Pufferbehälters verwendet, und der Puffer wurde durch ein Nervenbad perfundiert und dann in den Startbehälter zurückgeführt. Ein typisches Experiment würde 6-8 Stunden dauern, bevor der Nerv seine Lebensfähigkeit verliert und nicht mehr ausreichend auf die Stimulation anspricht, um Maßnahmen zu ergreifen, die für gesundes Gewebe repräsentativ sind.

Zur Optimierung des Signal-Rausch-Verhältnisses wurden für die Aufzeichnung Silberchlorid-Elektroden verwendet, die nach zuvor beschriebenen Verfahren¹⁹ hergestellt wurden. Zur Stimulation kann eine Kombination aus handelsüblichen Platin-Manschettenelektroden und maßgeschneiderten leitfähigen Polymer-Manschettenelektroden verwendet werden. Leitfähige Polymermanschettenelektroden haben deutlich höhere Ladungskapazitäten, die bei der Stimulation des Nervs mit Wellenformen mit hoher Amplitude^{nützlich sind 20}.

Der in diesem Protokoll verwendete Stimulator wurde zuvor^{beschrieben 20}. Dokumentation, Entwurfsdateien und Softwareskripte für die Verwendung sind öffentlich verfügbar²¹. Andere Stimulatoren können verwendet werden, um dieses Protokoll auszuführen; Der kundenspezifische Stimulator ist jedoch auch in der Lage, den HFAC-Block ^2,20 (High Frequency Alternative Current) zu bilden, was ein breiteres Spektrum an neurophysiologischen Experimenten ermöglicht. Um HFAC-Block zu verwenden, werden leitfähige Elastomermanschetten empfohlen, um eine Schädigung des Nervs zu vermeiden. Leitfähige Elastomer-Nervenmanschetten sind weiche und vollständig polymere Elektrodenarrays, die aus leitfähigen Elastomeren als leitfähige Komponente und Polydimethylsiloxan als Isolierung²² hergestellt werden. Die Geräte wurden in einer bipolaren Konfiguration unter Verwendung herkömmlicher Laser-Mikrofabrikationstechniken hergestellt.

Protokoll

Alle Tierpflege und -verfahren wurden unter entsprechenden Lizenzen durchgeführt, die vom britischen Innenministerium gemäß dem Animals (Scientific Procedures) Act (1986) ausgestellt und vom Animal Welfare and Ethical Review Board des Imperial College London genehmigt wurden.

1. Vorbereitung von Puffern

HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls kann weit vor dem Rest des Protokolls durchgeführt werden, mit Ausnahme der letzten Schritte, die die Herstellung eines modifizierten Krebs-Henseleit-Puffers (mKHB) bei 1x-Konzentration beinhalten.

1. Bereiten Sie 1 M CaCl₂ Stammlösung vor
   1. 14.701 g CaCl 2-Dihydrat in ein sauberes 100-ml-Becherglas geben. Fügen Sie ~ 75 ml deionisiertes Wasser hinzu und rühren Sie bis zur vollständigen Auflösung des Salzes.
   2. Übertragen Sie die Lösung in einen 100 ml Messkolben und fügen Sie deionisiertes Wasser hinzu, bis ein Volumen von 100 ml erreicht ist. Die Lösung in eine Flasche geben und im Kühlschrank bei 4 °C lagern.
2. Bereiten Sie 10x konzentrierten mKHB-Bestand vor
   1. 66,03 g Natriumchlorid (NaCl), 3,57 g Kaliumchlorid (KCl), 1,63 g Kaliumdihydrogenphosphat (KH 2 PO₄) und 1,44 g Magnesiumsulfat in ein₂l Becherglas geben.
   2. Geben Sie ~ 750 ml deionisiertes Wasser in das Becherglas und rühren Sie, bis sich die Salze aufgelöst haben (es können kleine Salzkristalle am Boden übrig sein). 25 ml 1 M CaCl₂ Stammlösung (Schritt 1.1) zugeben und umrühren; Stellen Sie sicher, dass dies das letzte hinzugefügte Salz ist.
   3. Die Lösung wird in einen 1-L-Messkolben gegeben und mit entionisiertem Wasser ein Gesamtvolumen von 1 l erreicht. Die Lösung wird in eine 1-L-Flasche gegeben. Konzentriert 10x mKHB bei 4 °C im Kühlschrank lagern.
      HINWEIS: Konzentrierter mKHB-Bestand kann vor dem Austausch ca. 1 Monat gelagert werden.
3. Dissektions-Petrischale vorbereiten (Beschichtung)
   1. Bereiten Sie eine saubere Glas-Petrischale (120 mm Durchmesser) zum Beschichten vor, indem Sie die Schale sorgfältig waschen und trocknen.
   2. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für die Verwendung und Aushärtung der konformen Alkoxybeschichtung, beschichten Sie den Boden der Petrischale mit ~ 3-5 mm Beschichtung, indem Sie die konforme Beschichtungsmischung vorsichtig in die Schale gießen, bis die gewünschte Dicke erreicht ist.
   3. Aushärten Sie die Beschichtung in einem Ofen bei 60 °C, bis sie sich fest anfühlt. Die Sezier-Petrischale ist nun fertig.
      HINWEIS: Eine schonende Reinigung der Schale nach jedem Gebrauch stellt sicher, dass die Beschichtung jahrelang hält, bevor ein Austausch erforderlich ist. Stellen Sie beim Austausch der Beschichtung sicher, dass Sie das gesamte Beschichtungsmaterial entfernen, bevor Sie eine neue Beschichtung auftragen. Beachten Sie, dass die in diesem Protokoll verwendete konforme Alkoxybeschichtung (Materialtabelle) eine Haltbarkeit von weniger als einem Jahr hat.

2. Vorbereitungen vor der Dissektion

HINWEIS: Mit diesem Schritt wird das Experiment gestartet. Die folgenden Schritte müssen am selben Tag in dieser Reihenfolge durchgeführt werden.

1. 1x mKHB vorbereiten
   1. Bereiten Sie ein sauberes 2 L Becherglas für den Puffer vor. Übertragen Sie 200 mL 10x mKHB-Vorrat auf das 2-Liter-Becherglas. 2,1 g Natriumcarbonat (_{NaHCO 3}) und 0,99 g wasserfreie Dextrose (D-Glucose) in das 2-Liter-Becherglas geben.
   2. Fügen Sie dem Becherglas etwa 1 l entionisiertes Wasser hinzu. Umrühren, bis die Salze vollständig aufgelöst sind. Die Lösung wird in einen 2-L-Messkolben gegeben und mit deionisiertem Wasser ein Gesamtvolumen von 2 l erreicht.
   3. Übertragen Sie die Lösung auf eine 2-Liter-Glasflasche, die auf einem Heizrührer mit einer Temperatur von 37 ° C platziert wird.
      HINWEIS: Kleinere Heizrührer können aufgrund der thermischen Trägheit großer Behälter voller Wasser oft nicht die Zieltemperatur von 37 ° C erreichen. Stellen Sie die Temperatur nach oben ein, so dass der Inhalt der Flasche unter Rühren 37 ° C erreicht. Überwachen Sie die Temperatur während des Experiments und senken Sie die eingestellte Temperatur im Falle eines Überschwingens.
   4. Legen Sie ein Thermometer in die 2-Liter-Flasche, um die Temperatur zu überwachen, und verwenden Sie Greifer, um zu verhindern, dass das Thermometer vom rührenden Floh getroffen wird. Belüften Sie den Puffer mit Carbogen für mindestens 30 Minuten, um die Lösung mit Sauerstoff zu versorgen. Dies sollte den pH-Wert auf 7,4 einstellen. Messen Sie den pH-Wert mit einem pH-Messgerät, um sicherzustellen, dass er innerhalb von 0,1 pH-Einheiten von 7,4 (bei 37 °C) liegt.
      HINWEIS: Um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen, verwenden Sie bei Bedarf Salzsäure oder Natriumhydroxid.
   5. Füllen Sie zwei 15 mL Zentrifugenröhrchen und eine 100 mL Flasche mit mKHB und legen Sie sie zum Abkühlen auf Eis.
      HINWEIS: Die Zentrifugenröhrchen und die Flasche können nach jedem Experiment ohne Autoklavieren gereinigt und wiederverwendet werden.
   6. Für spätere Teile des Experiments den Puffer in der 2-L-Flasche mit Carbogen bei 37 °C unter kontinuierlichem Rühren weiter belüften.
      HINWEIS: Die unbeaufsichtigte Verwendung von carbogen kann gefährlich sein, wenn keine automatischen Systeme vorhanden sind, um den Gasfluss im Falle eines Lecks abzuschalten. Ein automatisierter Sensor und ein elektronisches Absperrventil können dies abschwächen; Andernfalls muss eine Person die Ausrüstung beaufsichtigen, wenn die Sezierung in einem anderen Raum stattfindet. In allen Fällen sollte ein Sauerstoffsensor in der Nähe des Setups verwendet werden, um den Bediener zu warnen, wenn die Umgebungssauerstoffkonzentration über 25% steigt. Verwenden Sie nach Möglichkeit einen Raum mit aktiver Belüftung.
2. Schalten Sie das Signalerfassungsgerät, den rauscharmen Vorverstärker, den Leitungsrauschfilter und das Oszilloskop für die Aufnahme und Stimulation ein, um genügend Zeit für die Temperaturstabilisierung zu haben.
3. Stellen Sie sicher, dass alle elektrischen Aufzeichnungsgeräte korrekt konfiguriert sind
   1. Stellen Sie den rauscharmen Vorverstärker auf einen AC-gekoppelten Eingang ein, wobei der Eingangsbandpassfilter auf 6 dB Roll-Off pro Jahrzehnt eingestellt ist und die Grenzfrequenzen für die Hochpass- bzw. Tiefpassfilter auf 30 Hz bzw. 3 kHz eingestellt sind.
   2. Stellen Sie die Verstärkung des rauscharmen Vorverstärkers auf 100 ein.

3. Tieranästhesie und Euthanasie

HINWEIS: Für die Studien wurden weibliche Ratten zwischen 250 und 330 g (Tabelle der Materialien) verwendet.

1. Vorbereiten von chirurgischen Werkzeugen und Verbrauchsmaterialien: 12 cm gerade Schere (stumpf); 2 mm Schneidkante abgewinkelte Federschere; 4 cm feine Schere, scharf oder halbscharf; #7 Dumont Pinzette; 45° abgewinkelte feine Pinzette und 6-0 Nähseide oder Faden.
2. Legen Sie die Ratte in einen Anästhesiebehälter oder eine Narkosekammer. Verbinden Sie Sauerstoff und den Anästhesiediffusor mit dem Behälter. Stellen Sie die Anästhesiekonzentration (Isofluran) auf 3,5% ein und warten Sie etwa 10 Minuten oder bis das Tier Anzeichen einer Anästhesie wie den Verlust des Aufrichtenden Reflexes zeigt.
3. Nachdem die Ratte Anzeichen einer Anästhesie zeigt, bestätigen Sie den Bewusstseinsverlust mit einem Zehenklemmreflex-Reflextest. Fahren Sie nur fort, wenn es keine Zehenentnahme gibt; Überprüfen Sie andernfalls alle Anschlüsse und Anästhesiestufen im Diffusor und wiederholen Sie Schritt 3.2.
4. Nehmen Sie das Tier aus dem Behälter und fahren Sie mit der Zervixluxation fort, gefolgt von einem Schnitt einer Oberschenkelarterie zur Bestätigung des Todes.

4. Sezierprotokoll

HINWEIS: Legen Sie das Tier mit seinem Bauch nach unten auf den Seziertisch. Wiederholen Sie die folgenden Schritte für beide Beine. Typischerweise wird das rechte Bein zuerst seziert.

1. Halten Sie den Knöchel fest zwischen Daumen, Zeigefinger und Mittelfinger, durchtrennen Sie die Fersensehne mit einer 12 cm langen geraden stumpfen Schere.
2. Machen Sie mit einer feinen scharfen Schere einen Hautschnitt von der Fersenspinne entlang der Rückseite des Beines bis zur Basis der Wirbelsäule und achten Sie darauf, das darunter liegende Muskelgewebe nicht zu sezieren.
3. Machen Sie mit einer feinen Pinzette und einer feinen Schere vorsichtige Schnitte durch die Muskelschichten in der Nähe der Mitte der Rückseite des Beins, bis der Ischiasnerv freigelegt ist. Sobald der Ischiasnerv sichtbar ist, befeuchten Sie die Höhle mit eiskaltem mKHB, um ein Austrocknen des Nervs zu verhindern.
4. Ziehen Sie mit Hämostaten die Hautlappen auf jeder Seite auseinander und halten Sie den Einschnitt für feinere Sezierarbeiten offen. Ausgehend von der Stelle des Fersensehnenschnitts unterbrechen Sie mit einer feinen Schere den Muskel auf der medialen Seite des Beins, um den Nerv zu befreien. Halten Sie den Feuchtigkeitsgehalt in der Region mit eiskaltem mKHB aufrecht.
5. Wenn der Nerv freigelegt wird, während Sie sich das Bein hinaufbewegen, sezieren Sie das darüber liegende Muskelgewebe. Befreien Sie den Nerv näher an der Wirbelsäule vom Bindegewebe, bis Sie die Wirbelsäulenspalte erreichen, an der sich ein Knick im Nerv befindet. Versuchen Sie noch nicht, den Nerv zu reinigen, da Geschwindigkeit in diesem Stadium unerlässlich ist.
6. Durchtrennen Sie den Nerv so nah wie möglich an der Wirbelsäule mit einer feinen Schere. Um die Dissektion zu erleichtern, ziehen Sie das Ende des Nervs in der Nähe des Knöchels mit einer Pinzette sehr vorsichtig an. Kneifen Sie niemals den Nerv in der Mitte, sondern nur die Enden. Ziehen Sie niemals einen Nerv straff.
   OPTIONAL: An diesem Punkt, wenn es die Zeit erlaubt, kann die Naht beider Enden des Nervs durchgeführt werden, um die Lebensfähigkeit zu erhalten. Halten Sie die Handhabung auf ein Minimum, um Schäden zu vermeiden. Wenn die Zeit nicht ausreicht (siehe Schritt 4.5), überspringen Sie diesen Schritt, und führen Sie später Schritt 5.2 aus.
7. Legen Sie den sezierten Nerv in das mit mKHB gefüllte 15-ml-Zentrifugenröhrchen (Schritt 2.1.5), schließen Sie das Röhrchen und legen Sie das Röhrchen bis zum Beginn des Reinigungsvorgangs wieder auf Eis.
8. Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.7 für das andere Bein. Idealerweise sollte jeder Nerv 5-10 Minuten brauchen, um zu extrahieren, um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu maximieren.

5. Nervenreinigungsverfahren

1. Füllen Sie die beschichtete Petrischale etwa zur Hälfte mit gekühltem sauerstoffhaltigem mKHB. Legen Sie einen der sezierten Ischiasnerven in die Schale und befestigen Sie beide Enden des Nervs an der Schale, so dass der Nerv gerade ohne Knicke, Torsion oder Verdrehungen ist. Heften Sie den Nerv so nah wie möglich an den Enden fest.
2. Binden Sie mit 6-0-Seidennähten oder feinem Faden einen Doppelknoten um jedes Ende des Nervs, um ein Austreten von Zytosol in den Puffer zu verhindern. Platzieren Sie die Knoten direkt neben den Insektenstiften auf der Seite, die näher an der Mitte des Nervs liegt, da dies das Austreten von Nervengewebe in den Puffer verhindert. Führen Sie diesen Schritt nicht durch, wenn der Nerv zuvor ligiert wurde.
3. Mit dem Mikroskop für Präzision und der 2 mm abgewinkelten Federschere entfernen Sie Fett, Blutgefäße und Muskelgewebe aus dem Nerv. Beschneiden Sie alle Nervenäste, die nicht im Stimulations- und Aufzeichnungsprotokoll verwendet werden.
   1. Ersetzen Sie den Puffer alle 5 Minuten der Reinigung durch frisch gekühltes, sauerstoffreiches mKHB. Verwenden Sie feine Pinzetten, um an Bindegewebe, Fett und Blutgefäßen zu ziehen, um die Dissektion zu erleichtern.
4. Legen Sie die Nerven zurück in die Transportröhrchen, die mit frisch oxygeniertem gekühltem mKHB gefüllt sind, und legen Sie die Schläuche auf Eis.

6. Einrichtung der Ausrüstung

HINWEIS: Der Geräteaufbau zur Durchführung von Experimenten ist in Abbildung 1 dargestellt. Kurz gesagt, es besteht aus einem Doppelkompartiment-Nervenbad, einer 2-L-Flasche, die auf einem Heizrührer platziert wird, einer Carbogenquelle für die Pufferbelüftung und einem Schlauch, damit der Puffer von der Flasche zum Bad und mit einer Peristaltikpumpe zurück zur Flasche fließen kann. Das Bad kann aus Plexiglas gefräst oder aus wasserdichten Materialien in 3D gedruckt werden. Es hat eine Tiefe von ca. 2 cm, und die Trennwand, die die beiden Kammern des Bades trennt, verfügt über ein Loch mit einem Durchmesser von 1,5 mm, um das Einfädeln eines peripheren Nervs über beide Kammern zu ermöglichen. Eine Kammer ist groß, muss mindestens 4 oder 5 cm lang sein und wird mit Puffer gefüllt. Die andere Kammer sollte mindestens 3 cm lang sein und mit Silikon oder Mineralöl gefüllt werden. Das Bad darf nicht zu groß gemacht werden, da dies die Kontrolle über Perfusion, Temperatur und pH-Wert beeinträchtigt. Je nach Größe des untersuchten Nervengewebes können unterschiedliche Badgrößen erforderlich sein.

1. Bereiten Sie ein sauberes Zweikammer-Nervenbad vor (siehe Ergänzende Datei für Designspezifikationen). Platzieren Sie das Nervenbad unter dem Niveau der 2-L-Flasche, die auf dem Heizrührer platziert ist, mit Standard-Laborbossköpfen und Greifern. Schließen Sie den Abfluss des Bades an den peristaltischen Pumpeneinlass an.
2. Schließen Sie den Auslass der Peristaltikpumpe an ein Rohr an, das zurück zur 2-L-Pufferflasche führt. Schließen Sie den Badeinlass mit einem einstellbaren Durchflussventil an ein Rohr an und legen Sie das Rohr in die 2-L-Flasche. Verwenden Sie ein Drei-Wege-Ventil mit einer Spritze, die mit dem mittleren Auslass verbunden ist, um das Rohr als Siphon für den schwerkraftunterstützten Pufferzufluss vorzubereiten.
3. Grundieren Sie den Siphon, indem Sie die Spritze ziehen, bis Puffer in ihn hineinfließt. Konfigurieren Sie das Ventil so, dass der Durchfluss des Puffers in das Bad ~ 5-6 ml · ^min-1 beträgt. Der Durchfluss kann zunächst erhöht werden, um das Bad zu füllen. Sobald der Pufferstand des Bades den Abfluss erreicht hat, legen Sie die Nerven in das Bad.
4. Sichern Sie mit einem Insektenstift das Ende des Nervs an der Ecke der mit Puffer gefüllten Badekammer. Verwenden Sie eine um 45° abgewinkelte feine Pinzette und klemmen Sie den Nerv nur an den Enden ein, fädeln Sie den Nerv vorsichtig ein, um durch das Loch in der Trennwand zwischen den beiden Badkammern stimuliert zu werden.
5. Sichern Sie das andere Ende des Nervs in der Ölkammer des Bades mit einer Insektennadel, um sicherzustellen, dass der Nerv gerade ist, ohne gedehnt zu werden und frei von Knicken und Verdrehungen ist. Verwenden Sie Silikonfett, machen Sie eine Dichtung, um Pufferleckage von der Pufferkammer in die Ölkammer zu verhindern. Füllen Sie die Ölkammer mit Silikon oder Mineralöl.
6. Legen Sie die Ag/AgCl-Aufzeichnungselektrodenhaken in die Ölbadkammer und sichern Sie sie mit Bossköpfen und Greifern. Drapieren Sie den Teil des Nervs im Ölbad über die Haken, ohne den Nerv straff zu ziehen. Kneifen Sie den Nerv nicht zusammen; Verwenden Sie abgewinkelte Pinzetten, um den Nerv ohne Einklemmen anzuheben.
7. Stellen Sie die Silikonfettdichtung ein oder reparieren Sie sie, wenn nach dem Bewegen des Nervs eine Leckage beobachtet wird.
8. Schließen Sie die Referenz-Ag/AgCl-Elektrode an die Verstärkermasse an und platzieren Sie die Elektrode in der puffergefüllten Badkammer, indem Sie sie mit einem Laborgreifer befestigen.

7. Elektrodenimplantation auf den Nerv im Bad

1. Bereiten Sie eine saubere Nervenmanschettenelektrode zur Stimulation gemäß Referenz²¹ vor. Legen Sie die Elektrode in die puffergefüllte Badkammer. Öffnen Sie mit einer Pinzette oder einer feinen Pinzette mit stumpfen oder abgewinkelten Spitzen die Elektrode im Bad, um die Innenseite der Manschette zu benetzen.
2. Wenn Blasen verbleiben, verwenden Sie eine feine Spritze, um Puffer aus dem Bad zu ziehen und die Blasen aus der Manschette zu drücken. Öffnen Sie mit einer Pinzette unter dem Nerv vorsichtig die Manschette und schieben Sie sie unter den Nerv. Schließen Sie die Manschette um den Nerv und achten Sie darauf, dass der Nerv geknickt oder verdreht wird.
3. Verbinden Sie die Stimulationselektrode mit dem Stimulator und sichern Sie die Stimulationselektrodenleitung mit Klebeband. Verbinden Sie die Stromrücklaufelektrode mit dem Stimulator und sichern Sie das Kabel mit Klebeband. Wenn Sie eine quadratische Platinplatte als Stromrücklaufelektrode verwenden, positionieren Sie die Folie vom Nerv im Bad weg.

8. Stimulation und Aufzeichnung

1. Schließen Sie den TTL-Signalausgang des Stimulators an Kanal 4 des Oszilloskops an, der zum Auslösen des Oszilloskops verwendet wird. Drücken Sie auf dem Oszilloskopbildschirm die Registerkarte Triggerkanal und geben Sie Kanal 4 als auslösenden Kanal an. Stellen Sie den Triggerpegel mit dem Pegelregler auf 1 V ein.
2. Stellen Sie auf dem Oszilloskop die Zeitauflösung auf 1 ms/Division und die Spannungsauflösung auf 10 mV/Division ein. Zentrieren Sie die Triggerreferenz in der Zeit und stellen Sie den Triggerpegel auf 1 V ein.
   HINWEIS: Führen Sie die Schritte 8.3 bis 8.6 aus, wenn Sie den benutzerdefinierten Stimulator verwenden (siehe Materialtabelle). Es wird davon ausgegangen, dass die MATLAB-Software und die Gerätetreiber auf dem Laborcomputer installiert wurden, wobei die kostenlos online bereitgestellten Anweisungen für den benutzerdefinierten neuronalen Stimulator²¹ verwendet wurden. Ansonsten befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für die Verwendung eines handelsüblichen Stimulators als Alternative.
3. Schließen Sie den Stimulator an den Laborcomputer an. Schalten Sie den Stimulator ein, indem Sie das Batterienetzteil an den Stromeingang anschließen. Starten Sie die MATLAB-Software auf dem Laborcomputer.
4. Führen Sie das benutzerdefinierte MATLAB-Skript aus: HFAC_4ch_Stimulator_Initialization.m (Table of Materials).
   HINWEIS: Das USB-Kommunikationskabel zwischen dem Computer und dem Stimulator sollte grün blinken. Wenn dies nicht der Fall ist, liegt ein Konfigurationsfehler vor, und die Stromversorgung und die Anschlüsse müssen überprüft werden.
5. Öffnen Sie das MATLAB-Skript: HFAC_4ch_Monophasic_Stimulation.m (Table of Materials). Wenn Sie das MATLAB-Skript direkt bearbeiten, legen Sie die Parameter wie folgt fest: Stimulatorpulsamplitude = -300 μA, Stimulatorpulsbreite = 300 μs, Stimulatoranzahl der Impulse = 10 und Stimulatorzeit zwischen den Impulsen = 1 s.
6. Starten Sie das Stimulationsprotokoll, indem Sie in der MATLAB-Software auf Ausführen klicken.

Ergebnisse

Repräsentative Ergebnisse, die mit diesem Protokoll erhalten werden können, sind die konsistenten zusammengesetzten Aktionspotentiale aus A-Typ-Nervenfasern innerhalb des Ischiasnervs. Diese Aktionspotentiale haben typischerweise eine Spitze-zu-Spitze-Amplitude von etwa 1 mV an der Elektrode und damit 100 mV einmal verstärkt (Abbildung 2). Ähnliche Stimulationsamplituden und Pulsbreiten sollten ähnliche CAP-Amplituden ergeben. Leitfähige Elastomer-Manschettenelektroden erfordern im All...

Diskussion

In dieser Arbeit beschrieben wir ein Protokoll zur Vorbereitung von Rattenischiasnerven für die Ex-vivo-Neurophysiologie. Die Gewebeextraktion dauert ungefähr 30 Minuten, einschließlich Tierhandhabung, Anästhesie, Keulung und Dissektion, während die Nervenreinigung, die Platzierung im Bad und die Elektrodenimplantation zusätzliche 30 Minuten dauern sollten, bevor mit der Aufzeichnung begonnen werden kann. Die Puffervorbereitung kann in 30 min durchgeführt werden, obwohl dies vor dem Rest des Experiments e...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L Glass bottle	VWR International Ltd	215-1595	Borosilicate glass
1 L Glass graduated flask	VWR International Ltd	612-3626	Borosilicate glass
2 L Glass bottle	VWR International Ltd	215-1596	Borosilicate glass
2 L Glass graduated flask	VWR International Ltd	BRND937254	Borosilicate glass
Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT	RS UK	536-2599	push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube
Alkoxy conformal coating	Farnell	1971829	ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation
Anesthetic	Chanelle	N/A	Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle
Beaker, 2 L	VWR International Ltd	213-0469	Borosilicate glass
Bipolar nerve cuff	Cortec GMBH	N/A	800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination
Bossheads	N/A	N/A	Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods
Calcium Chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902-500g	500 g in plastic bottle
Carbogen canister	BOC	N/A	F-size canister
Centrifuge Tubes, 15 mL volume	VWR International Ltd	734-0451	Falcon tubes
Conductive elastomer nerve cuff	N/A	N/A	high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference
Connector, Termimate	Mouser UK	538-505073-1100-LP	These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11)
Crocodile clip connectors	RS UK	212-1203	These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10)
Deionized Water	N/A	N/A	Obtained from deionized water dispenser
Forceps angled 45 degrees	InterFocus Ltd	91110-10	Fine forceps, student range
Forceps standard Dumont #7	InterFocus Ltd	91197-00	Student range forceps
Gas Disperson Tube, Porosity 3	Merck	12547866	N/A
Glucose anhydrous, powder	VWR International Ltd	101174Y	500 g in plastic bottle
Grippers	N/A	N/A	Standard wet laboratory rod-mounted grippers
Heating Stirrer	RS UK	768-9672	Stuart US152
Hemostats	N/A	N/A	Any hemostat >12 cm in length is suitable
Insect Pins, stainless steel, size 2	InterFocus Ltd	26001-45	N/A
Laptop computer	N/A	N/A	Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable
Line Noise Filter	Digitimer	N/A	Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter)
Low-Noise Preamplifier, SR560	Stanford Research Systems	SR560	Low-noise voltage preamplifier
Magnesium Sulphate salt	VWR International Ltd	291184P	500g in plastic bottle
MATLAB scripts	Github	https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch	Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator
MATLAB software	Mathworks	N/A	Standard package
Microscope Light, PL-2000	Photonic	N/A	Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier
Microscope, SMZ 745	Nikon	SM745	Stereoscopic Microscope
Mineral oil, non-toxic	VWR International Ltd	31911.A1	Oil for nerve bath
Nerve Bath	N/A	N/A	Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details.
Oscilloscope	LeCroy	N/A	434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers
Oxygen Hose, 1 meter	BOC	N/A	1/4" NPT terminations
Oxygen Regulator	BOC	C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar	N/A
Peristaltic Pump P-1	Pharmacia Biotech	N/A	Product may be obtained from third party supplier
Petri Dish, Glass	VWR International Ltd	391-0580	N/A
Potassium Chloride salt	Sigma Aldrich	P5405-250g	250 g in plastic bottle
Potassium Dihydrogen Sulphate salt	Merck	1.04873.0250	250 g in plastic bottle
Rat	Charles River Laboratories	N/A	Sprague Dawley, 250-330 grams, female
Reference electrode, ET072	eDaQ (Australia)	ET072-1	Silver silver-chloride reference electrode
Rod	N/A	N/A	Standard wet laboratory rods with fittings for stands
Scale	Sartorius	N/A	M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers
Scissors straight 12 cm edge	InterFocus Ltd	91400-12	blunt-blunt termination, student range
Signal Acquisition Device	Cambridge Electronic Design	Micro3-1401	Micro3-1401 Multichannel ADC
Silicone grease, non-toxic	Farnell	3821559	for sealing of bath partition
Silicone tubing, 2 mm inner diameter	N/A	N/A	N/A
Silicone tubing, 5 mm inner diameter	N/A	N/A	N/A
Silver wire	Alfa Aesar	41390	0.5 mm, annealed
Sodium Bicarbonate salt	Sigma Aldrich	S5761-500g	500 g in plastic bottle
Sodium Chloride salt	VWR International Ltd	27810.295	1 kg in plastic bottle
Spring scissors angled 2 mm edge	InterFocus Ltd	15010-09	N/A
Stand	N/A	N/A	Standard wet laboratory stands with sockets for rods
Stimulator	Digitimer	DS3	DS3 or Custom Stimulator (see references)
Stirring flea	VWR International Ltd	442-0270	For use with the heating stirrer
Syringe tip, blunt, 1 mm diameter	N/A	N/A	N/A
Syringe tip, blunt, 2 mm diameter	N/A	N/A	N/A
Syringe, plastic, 10 mL volume	N/A	N/A	syringe should have luer lock fitting
Tape, water-resistant	N/A	N/A	For securing tubing and wiring to workbench
Thermometer	VWR International Ltd	620-0806	glass thermometer
USB Power Bank	RS UK	135-1000	Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3
Valve, Leuer Lock, 3-Way	VWR International Ltd	229-7440	For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon