大鼠坐骨神经用于 离体 神经生理学的制备

摘要

该协议描述了制备大鼠整个坐骨神经组织以进行 离体 电生理刺激并在环境调节的双隔室灌注盐水浴中记录。

摘要

离体 制剂能够独立于身体其他部位研究许多神经生理过程，同时保留局部组织结构。这项工作描述了大鼠坐骨神经用于 离体 神经生理学的制备，包括缓冲液制备，动物程序，设备设置和神经生理学记录。这项工作概述了使用这种方法可能进行的不同类型的实验。概述的方法旨在在严格控制的条件下对提取的周围神经组织提供6小时的刺激和记录，以获得最佳的结果一致性。使用这种方法得到的结果是A纤维化合物动作电位（CAP），在整个实验过程中峰峰值幅度在毫伏范围内。CAP振幅和形状是一致和可靠的，使它们可用于测试和比较新电极与现有模型，或干预措施对组织的影响，例如使用化学品，手术改变或神经调节刺激技术。对传统的市售铂铱接触头袖带电极和定制导电弹性体电极进行了测试，并在神经刺激强度-持续时间响应方面给出了类似的结果。

引言

目前对 计算机 模拟的基本神经功能的理解在几个方面缺乏，特别是在躯体，轴突和树突之外的神经组织区室化的影响方面。Axon-髓鞘相互作用仍然知之甚少，因为即使是详细的计算神经模型（如MRG¹ （用于哺乳动物神经））充分捕获常规电刺激反应，也无法捕获其他实验观察到的行为，例如高频阻滞携带² 或继发反应³。

该协议提供了一种在急性小型实验室动物模型中有效地研究神经水平神经生理学过程的方法，使用标准化的制备方案来分离神经，控制其环境，并将其从 体内 环境中移除到 离体 环境。这将防止 体内 神经刺激方案使用的其他身体过程或麻醉剂来改变神经行为并混淆测量结果或其解释^4，5。这使得能够开发更现实的模型，仅关注对神经组织特有的影响，而这些效应知之甚少。该协议也可用于新的神经刺激和记录电极材料和几何形状的测试平台，以及新的刺激范式，如高频块^2，3。该技术的变体以前已用于研究严格控制条件下的神经生理学⁶，例如，测量离子通道动力学和性质或局部麻醉剂⁷的影响。

与诸如急性 体内 小动物实验⁸的替代方案相比，该技术提供了几个优点。该技术消除了从体内提取组织时保持麻醉深度的需要，从而减少了所需设备的数量，例如麻醉扩散器，氧气浓缩器和加热垫。这简化了实验方案，降低了出错的风险。由于麻醉剂可以潜在地改变神经功能⁴，该技术可确保措施不会因这些麻醉化合物的副作用而混淆。最后，在研究神经毒性化合物（如河豚毒素）的作用时，这种技术比急性 体内 实验更合适，这些化合物会通过瘫痪杀死麻醉动物。

周围神经切片是一种独特的 离体 系统，因为负责记录的神经信号的纤维很有可能不包含任何体细胞。由于这些通常位于运动神经元，脊柱中以及脊柱旁边的背根神经节中的感觉神经元，因此哺乳动物神经的一部分的制备可以粗略地建模为具有离子通道的管状膜的集合，在两端打开⁹。代谢由组织解剖时位于轴突中的线粒体^维持10。在提取后鼓励缝合轴突的开放端以关闭它们，从而有助于维持膜上现有的离子梯度，这对于正常的神经功能至关重要。

为了维持组织在体外的稳态，必须严格控制几个环境变量。这些是温度¹¹，氧合¹²，渗透压，pH^值13，14和获得葡萄糖以维持新陈代谢。对于该协议，方法是使用改良的克雷布斯 - 亨塞莱特缓冲液^15，16（mKHB），连续曝气氧气和二氧化碳的混合物。mKHB属于心脏停搏缓冲液家族^6，17，用于保存体外的解剖组织，例如，在离体实验中。这些缓冲液不含任何血红蛋白、抗生素或抗真菌药，因此仅适用于在有限时间内涉及少量组织的制剂。使用碳酸盐和二氧化碳氧化还原对实现pH控制，需要用二氧化碳对缓冲液进行恒定曝气以维持pH平衡。这是为了避免使用其它常见的缓冲剂，例如HEPES，它可以改变神经细胞¹⁸的功能。为了对缓冲液进行充氧并提供pH控制，使用称为碳化物（95%O 2，5_{%CO 2}）的氧气中5%二氧化碳的混合物。使用加热搅拌器对缓冲容器进行温度控制，并将缓冲液通过神经浴灌注，然后再循环到起始容器中。典型的实验将持续6-8小时，直到神经失去其活力，并且不再对刺激有足够的反应，以代表健康组织的措施。

为了优化信噪比，使用氯化银电极进行记录，按照前面描述的方法¹⁹制备。对于刺激，可以使用商用现成的铂袖带电极和定制的导电聚合物袖带电极的组合。导电聚合物袖带电极具有显著更高的电荷容量，这在使用高振幅波形²⁰刺激神经时是有用的。

该协议中使用的刺激器已在前面^描述过20。文档，设计文件和软件脚本是公开的²¹.其他刺激器可用于执行该协议;然而，定制刺激器也能够进行高频替代电流（HFAC）阻断^2，20，这使得更广泛的神经生理学实验成为可能。要使用HFAC阻滞，建议使用导电弹性体袖口，以避免对神经的损害。导电弹性体神经袖带是由导电弹性体作为导电组分和聚二甲基硅氧烷作为绝缘^体22而制成的柔软和全聚合的电极阵列。设备采用传统的激光微加工技术以双极性配置制造。

研究方案

所有动物护理和程序均根据英国内政部根据"动物（科学程序）法"（1986年）颁发的适当许可证进行，并得到伦敦帝国理工学院动物福利和伦理审查委员会的批准。

1. 缓冲液的制备

注意:协议的这一部分可以在协议的其余部分之前进行，除了涉及制备1倍浓度的改性克雷布斯 - 亨塞莱特缓冲液（mKHB）的最后步骤。

1. 准备1 M氯化钙₂ 储备溶液
   1. 将14.701克CaCl₂ 二水合物加入干净的100 mL烧杯中。加入约75毫升去离子水，搅拌直至盐完全溶解。
   2. 将溶液转移到100 mL刻度瓶中，并加入去离子水，直到达到100 mL体积。将溶液转移到瓶子中，并将其储存在4°C的冰箱中。
2. 准备10倍浓缩的mKHB高汤
   1. 在2 L烧杯中加入66.03克氯化钠（NaCl），3.57克氯化钾（KCl），1.63克磷酸二氢钾（KH₂PO₄）和1.44克硫酸镁。
   2. 向烧杯中加入约750 mL去离子水并搅拌直至盐溶解（底部可能留下小盐晶体）。加入25毫升1M CaCl₂ 储备溶液（步骤1.1）并搅拌;确保这是最后添加的盐。
   3. 将溶液转移到1L刻度瓶中，加入去离子水以达到1 L的总体积，将溶液转移到1 L瓶中。将浓缩的10x mKHB储存在4°C的冰箱中。
      注意:浓缩的mKHB库存在更换前可以储存约1个月。
3. 准备解剖培养皿（涂层）
   1. 准备一个干净的玻璃培养皿（直径120毫米）进行涂层，仔细清洗和干燥培养皿。
   2. 按照制造商关于保形烷氧基涂层的使用和固化说明，通过将保形涂层混合物小心地倒入培养皿中，直到达到所需的厚度，在培养皿的底部涂覆约3-5毫米的涂层。
   3. 在60°C的烘箱中固化涂层，直到其触感牢固为止。解剖培养皿现已准备就绪。
      注意:每次使用后对培养皿进行温和清洁，将确保涂层在需要更换之前持续数年。更换涂层时，请确保在涂覆新涂层之前除去所有涂层材料。请注意，本方案中使用的保形烷氧基涂层（材料表）的保质期短于一年。

2. 解剖前准备

注意:此步骤将开始实验。以下步骤必须按此顺序在同一天执行。

1. 准备 1x 毫微克伯
   1. 准备一个干净的2 L烧杯用于缓冲液。将 200 mL 10x mKHB 储备液转移到 2 L 烧杯中。向2L烧杯中加入2.1克碳酸钠（NaHCO₃）和0.99克无水葡萄糖（D-葡萄糖）。
   2. 向烧杯中加入约1升去离子水。搅拌直至盐完全溶解。将溶液转移到2L刻度瓶中，并加入去离子水以达到2L的总体积。
   3. 将溶液转移到放置在加热搅拌器上的2L玻璃瓶中，温度设置为37°C。
      注意:由于装满水的大型容器的热惯性，较小的加热搅拌器通常无法达到目标37°C的温度。向上调节温度，使瓶子的内容物在搅拌下达到37°C。在实验过程中监测温度，并在发生过冲时降低设定温度。
   4. 将温度计放在2 L瓶中以监测温度，使用夹具防止温度计受到搅拌跳蚤的影响。用碳化物使缓冲液充气至少30分钟以使溶液氧化。这应该将pH值设置为7.4。使用 pH 计测量 pH 值，以确保其在 7.4（37 °C 时）的 0.1 pH 单位范围内。
      注意:要将pH值调节至7.4，请在需要时使用盐酸或氢氧化钠。
   5. 将两个 15 mL 离心管和一个 100 mL 瓶装满 mKHB，并将它们放在冰上冷却。
      注意:离心管和瓶子可以在每次实验后清洁和重复使用，而无需高压灭菌。
   6. 对于实验的后期部分，继续在37°C下用碳原在2L瓶中连续搅拌曝气缓冲液。
      注意:如果没有自动系统在发生泄漏时关闭气流，则无监督使用碳化物可能是危险的。自动传感器和电子截止阀可以缓解这种情况;否则，如果解剖发生在另一个房间，则必须让一个人监督设备。在所有情况下，应在设置附近使用氧气传感器，以便在环境氧气浓度上升到25%以上时警告操作员。如果可能，请使用主动通风的房间。
2. 打开信号采集设备、低噪声前置放大器、线路噪声滤波器和示波器进行记录和刺激，以留出足够的时间进行温度稳定。
3. 确保所有电气记录设备均已正确配置
   1. 将低噪声前置放大器设置为交流耦合输入，输入带通滤波器设置为每十倍6 dB滚降，高通和低通滤波器的截止频率分别设置为30 Hz和3 kHz。
   2. 将低噪声前置放大器的增益设置为100。

3. 动物麻醉和安乐死

注意:使用250至330克（材料表）的雌性大鼠进行研究。

1. 准备手术工具和消耗品:12厘米直剪刀（钝）;2毫米切削刃角弹簧剪刀;4厘米细剪刀，锋利或半锋利;#7 杜蒙镊子;45°角细镊子和6-0缝合丝或线。
2. 将大鼠置于麻醉容器或腔室中。将氧气和麻醉扩散器连接到容器。将麻醉剂（异氟醚）浓度设置为3.5%，等待约10分钟或直到动物出现麻醉迹象，例如右转反射丧失。
3. 大鼠出现麻醉迹象后，用脚趾捏断反射试验确认意识丧失。仅当没有脚趾退出时才继续;否则，请检查扩散器中的所有连接和麻醉水平，然后重复步骤3.2。
4. 将动物从容器中取出并进行颈椎脱位，然后切开股动脉以确认死亡。

4. 解剖方案

注意:将腹部向下的动物放在解剖台上。对双腿重复以下步骤。通常，首先解剖右腿。

1. 将脚踝牢牢地夹在拇指、食指和中指之间，用12厘米直的钝剪刀切断跟骨肌腱。
2. 用细尖的剪刀，从跟骨肌腱沿着腿的后部一直到脊柱的底部做一个皮肤切口，注意不要解剖下面的肌肉组织。
3. 使用精细的镊子和精细的剪刀，仔细切开靠近腿部后部中间的肌肉层，直到坐骨神经暴露出来。一旦坐骨神经可见，使用冰冷的mKHB滋润腔，以防止神经干燥。
4. 使用止血剂，将两侧的皮肤瓣拉开，并保持切口打开以进行更精细的解剖工作。从跟骨肌腱切口的位置开始，用细剪刀打断腿内侧的肌肉以释放神经。继续用冰冷的mKHB保持该地区的湿度水平。
5. 当神经在沿着腿向上移动时暴露时，解剖上覆的肌肉组织。将靠近脊柱的神经从结缔组织中释放出来，直到到达脊柱裂，此时神经有扭结。不要试图清洁神经，因为在这个阶段，速度是必不可少的。
6. 用细剪刀切断尽可能靠近脊柱的神经。为了使解剖更容易，使用镊子非常轻轻地拉动脚踝附近的神经末端。切勿捏住中间的神经，而只捏住末端。切勿绷紧神经。
   可选:此时，如果时间允许，可以进行神经两端的缝合以帮助维持生存能力。将处理保持在最低限度，以防止损坏。如果时间不足（请参阅步骤 4.5），请跳过此步骤，稍后再执行步骤 5.2。
7. 将解剖的神经放入充满mKHB的15mL离心管中（步骤2.1.5），关闭管，然后将管放回冰上，直到清洁程序开始。
8. 对另一条腿重复步骤 4.1-4.7。理想情况下，每根神经应需要5-10分钟才能提取，以最大限度地提高组织活力。

5. 神经清洁程序

1. 将涂有的培养皿约中途用冷冻的含氧mKHB填充。将其中一条解剖的坐骨神经放入培养皿中，并将神经的两端固定在培养皿上，使神经笔直，没有扭结，扭转或扭曲。将神经固定在尽可能靠近末端的位置。
2. 使用6-0丝缝合线或细线，在神经两端打一个双结，以防止细胞质基质泄漏到缓冲液中。将结放在靠近神经中心的一侧的昆虫针旁边，因为这将防止从神经组织泄漏到缓冲区中。如果神经先前已结扎，请勿执行此步骤。
3. 使用显微镜进行精确度测量，并使用2毫米角弹簧剪刀，从神经中去除脂肪，血管和肌肉组织。修剪任何不会在刺激和记录方案中使用的神经分支。
   1. 每5分钟清洁一次，用新鲜冷冻的含氧mKHB代替缓冲液。使用细镊子拉扯结缔组织，脂肪和血管，以减轻解剖。
4. 将神经放回装有新鲜含氧冷却mKHB的运输管中，然后将管放在冰上。

6. 设备设置

注:用于进行实验的设备设置如图 1所示。简而言之，它由一个双隔室神经浴，一个放置在加热搅拌器上的2 L瓶，一个用于缓冲曝气的碳化物源，以及允许缓冲液从瓶子流向浴槽并使用蠕动泵返回瓶子的管子。浴槽可以用有机玻璃加工而成，也可以用防水材料3D打印而成。它的深度约为2厘米，分隔浴槽两个腔室的隔板具有直径为1.5 mm的孔，允许周围神经穿过两个腔室。一个腔室很大，必须至少4或5厘米长，并且将充满缓冲液。另一个腔室应至少长3厘米，并充满硅油或矿物油。浴槽不能太大，因为这会降低灌注，温度和pH值的控制。根据所研究的神经组织的大小，可能需要不同的浴槽尺寸。

1. 准备一个干净的双室神经浴（参见设计规范 的补充文件 ）。使用标准的实验室凸台头和夹具，将神经浴置于放置在加热搅拌器上的2 L瓶的水平下方。将浴槽的排水口连接到蠕动泵入口。
2. 将蠕动泵的出口连接到通回2 L缓冲瓶的管子上。将浴缸入口连接到带有可调流量阀的管子上，然后将管子放入2 L瓶内。使用三通阀，注射器连接到中间出口，以帮助将管子作为重力辅助缓冲器流入的虹吸管。
3. 通过拉动注射器来启动虹吸管，直到缓冲区流入其中。配置阀门，使进入浴槽的缓冲液的流量为~5-6 mL·^min-1。最初可以增加流量以填充浴槽。一旦浴液缓冲液水平达到排水管，将神经放入浴槽中。
4. 使用昆虫针，将神经末端固定在充满缓冲液的浴室的角落。使用45°角的细镊子并仅在末端捏住神经，小心地通过两个浴室之间隔板上的孔来穿刺要刺激的神经。
5. 用昆虫针将神经的另一端固定在浴池的油室中，确保神经笔直而不被拉伸，并且没有扭结和扭曲。使用硅脂，做一个密封，以防止缓冲液从缓冲室泄漏到油室。用硅油或矿物油填充油室。
6. 将 Ag/AgCl 记录电极钩放在油浴室中，并使用凸台头和夹具固定它们。将油浴中的神经部分悬垂在钩子上，而不会拉紧神经。不要捏神经;使用倾斜的镊子抬起神经而不挤压。
7. 调整或修复硅脂密封，如果在移动神经后观察到任何泄漏。
8. 将参比 Ag/AgCl 电极连接到放大器接地，并使用实验室夹具固定电极，将其置于充满缓冲液的浴槽室中。

7.电极植入浴中的神经上

1. 根据参考文献²¹准备一个干净的神经袖带电极用于刺激。将电极置于充满缓冲液的浴槽室中。使用带有钝头或倾斜尖端的镊子或细镊子，在浴缸中打开电极以弄湿袖口内部。
2. 如果仍有气泡，请使用精细的注射器从浴中抽出缓冲液，并将气泡从袖口中取出。用镊子在神经下，轻轻打开袖口并将其滑到神经下方。关闭神经周围的袖带，注意避免神经的任何扭结或扭曲。
3. 将刺激电极连接到刺激器上，并用胶带固定刺激电极引线。将电流回流电极连接到刺激器，并用胶带固定引线。如果使用方形铂片作为电流回流电极，请将片材放置在远离浴槽中神经的位置。

8. 刺激和记录

1. 将激励器TTL信号输出连接到示波器的通道4，该通道将用于触发示波器。在示波器屏幕上，按 触发 通道选项卡，并将通道 4 指定为触发通道。使用电平旋钮将触发 电平 设置为1 V。
2. 在示波器上，将时间分辨率设置为 1 ms/分度，将电压分辨率设置为 10 mV/分度。及时将触发基准电压源居中，并将触发电平设置为1 V。
   注:如果使用自定义刺激器，请按照步骤 8.3 至 8.6 进行操作（请参见 材料表）。假设 MATLAB 软件和设备驱动程序已使用在线免费提供给自定义神经刺激器²¹ 的说明安装在实验室计算机上。否则，请按照制造商的说明使用市售刺激器作为替代方案。
3. 将刺激器连接到实验室计算机。通过将电池电源连接到电源输入来打开刺激器。在实验室计算机上启动 MATLAB 软件。
4. 执行自定义 MATLAB 脚本:HFAC_4ch_Stimulator_Initialization（材料表）。
   注:计算机和刺激器之间的 USB 通信电缆应呈绿色闪烁。如果没有，则存在配置错误，并且必须验证电源和连接。
5. 打开 MATLAB 脚本: HFAC_4ch_Monophasic_Stimulation （材料表）。通过直接编辑 MATLAB 脚本，按如下方式设置参数:刺激器脉冲幅度 = -300 μA，刺激器脉冲宽度 = 300 μs，刺激器脉冲数 = 10，激励器脉冲间时间 = 1 s。
6. 通过在 MATLAB 软件中单击 "运行"来 启动刺激方案。

结果

该协议可以获得的代表性结果是坐骨神经内A型神经纤维的一致化合物动作电位。这些动作电位通常在电极处具有约1 mV的峰峰值幅度，因此一旦放大，则为100 mV（图2）。相似的刺激振幅和脉冲宽度应产生相似的CAP振幅。与市售的铂袖带电极相比，导电弹性体袖带电极通常需要略高的刺激振幅，以获得相同的CAP振幅。与刺激来自不同动物的神经所需的刺激幅度的变化相比，这?...

讨论

在这项工作中，我们描述了一种为 离体 神经生理学准备大鼠坐骨神经的方案。组织提取大约需要30分钟，包括动物处理，麻醉，扑杀和解剖，而神经清洁，在浴缸中放置和电极植入应额外30分钟才能开始记录。缓冲液制备可以在30分钟内进行，但这可以在实验的其余部分之前完成。这种类型的制备和实验已经在过去的^7，12中使用和描述，使用类似...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L Glass bottle	VWR International Ltd	215-1595	Borosilicate glass
1 L Glass graduated flask	VWR International Ltd	612-3626	Borosilicate glass
2 L Glass bottle	VWR International Ltd	215-1596	Borosilicate glass
2 L Glass graduated flask	VWR International Ltd	BRND937254	Borosilicate glass
Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT	RS UK	536-2599	push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube
Alkoxy conformal coating	Farnell	1971829	ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation
Anesthetic	Chanelle	N/A	Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle
Beaker, 2 L	VWR International Ltd	213-0469	Borosilicate glass
Bipolar nerve cuff	Cortec GMBH	N/A	800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination
Bossheads	N/A	N/A	Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods
Calcium Chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902-500g	500 g in plastic bottle
Carbogen canister	BOC	N/A	F-size canister
Centrifuge Tubes, 15 mL volume	VWR International Ltd	734-0451	Falcon tubes
Conductive elastomer nerve cuff	N/A	N/A	high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference
Connector, Termimate	Mouser UK	538-505073-1100-LP	These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11)
Crocodile clip connectors	RS UK	212-1203	These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10)
Deionized Water	N/A	N/A	Obtained from deionized water dispenser
Forceps angled 45 degrees	InterFocus Ltd	91110-10	Fine forceps, student range
Forceps standard Dumont #7	InterFocus Ltd	91197-00	Student range forceps
Gas Disperson Tube, Porosity 3	Merck	12547866	N/A
Glucose anhydrous, powder	VWR International Ltd	101174Y	500 g in plastic bottle
Grippers	N/A	N/A	Standard wet laboratory rod-mounted grippers
Heating Stirrer	RS UK	768-9672	Stuart US152
Hemostats	N/A	N/A	Any hemostat >12 cm in length is suitable
Insect Pins, stainless steel, size 2	InterFocus Ltd	26001-45	N/A
Laptop computer	N/A	N/A	Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable
Line Noise Filter	Digitimer	N/A	Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter)
Low-Noise Preamplifier, SR560	Stanford Research Systems	SR560	Low-noise voltage preamplifier
Magnesium Sulphate salt	VWR International Ltd	291184P	500g in plastic bottle
MATLAB scripts	Github	https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch	Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator
MATLAB software	Mathworks	N/A	Standard package
Microscope Light, PL-2000	Photonic	N/A	Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier
Microscope, SMZ 745	Nikon	SM745	Stereoscopic Microscope
Mineral oil, non-toxic	VWR International Ltd	31911.A1	Oil for nerve bath
Nerve Bath	N/A	N/A	Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details.
Oscilloscope	LeCroy	N/A	434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers
Oxygen Hose, 1 meter	BOC	N/A	1/4" NPT terminations
Oxygen Regulator	BOC	C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar	N/A
Peristaltic Pump P-1	Pharmacia Biotech	N/A	Product may be obtained from third party supplier
Petri Dish, Glass	VWR International Ltd	391-0580	N/A
Potassium Chloride salt	Sigma Aldrich	P5405-250g	250 g in plastic bottle
Potassium Dihydrogen Sulphate salt	Merck	1.04873.0250	250 g in plastic bottle
Rat	Charles River Laboratories	N/A	Sprague Dawley, 250-330 grams, female
Reference electrode, ET072	eDaQ (Australia)	ET072-1	Silver silver-chloride reference electrode
Rod	N/A	N/A	Standard wet laboratory rods with fittings for stands
Scale	Sartorius	N/A	M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers
Scissors straight 12 cm edge	InterFocus Ltd	91400-12	blunt-blunt termination, student range
Signal Acquisition Device	Cambridge Electronic Design	Micro3-1401	Micro3-1401 Multichannel ADC
Silicone grease, non-toxic	Farnell	3821559	for sealing of bath partition
Silicone tubing, 2 mm inner diameter	N/A	N/A	N/A
Silicone tubing, 5 mm inner diameter	N/A	N/A	N/A
Silver wire	Alfa Aesar	41390	0.5 mm, annealed
Sodium Bicarbonate salt	Sigma Aldrich	S5761-500g	500 g in plastic bottle
Sodium Chloride salt	VWR International Ltd	27810.295	1 kg in plastic bottle
Spring scissors angled 2 mm edge	InterFocus Ltd	15010-09	N/A
Stand	N/A	N/A	Standard wet laboratory stands with sockets for rods
Stimulator	Digitimer	DS3	DS3 or Custom Stimulator (see references)
Stirring flea	VWR International Ltd	442-0270	For use with the heating stirrer
Syringe tip, blunt, 1 mm diameter	N/A	N/A	N/A
Syringe tip, blunt, 2 mm diameter	N/A	N/A	N/A
Syringe, plastic, 10 mL volume	N/A	N/A	syringe should have luer lock fitting
Tape, water-resistant	N/A	N/A	For securing tubing and wiring to workbench
Thermometer	VWR International Ltd	620-0806	glass thermometer
USB Power Bank	RS UK	135-1000	Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3
Valve, Leuer Lock, 3-Way	VWR International Ltd	229-7440	For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon