Ex Vivo Nörofizyoloji için Sıçan Siyatik Sinirinin Hazırlanması

Özet

Bu protokol, sıçan tüm siyatik sinir dokusunun ex vivo elektrofizyolojik stimülasyon için hazırlanmasını ve çevresel olarak düzenlenmiş, iki bölmeli, perfüze edilmiş bir salin banyosunda kaydedilmesini açıklar.

Özet

Ex vivo preparatlar, lokal doku yapısını korurken vücudun geri kalanından izole olarak birçok nörofizyolojik sürecin incelenmesini sağlar. Bu çalışma, tampon preparatı, hayvan prosedürleri, ekipman kurulumu ve nörofizyolojik kayıt dahil olmak üzere ex vivo nörofizyoloji için sıçan siyatik sinirlerinin hazırlanmasını açıklamaktadır. Bu çalışma, bu yöntemle mümkün olan farklı deney türlerine genel bir bakış sunmaktadır. Özetlenen yöntem, sonuçlarda optimal tutarlılık için sıkı bir şekilde kontrol edilen koşullarda ekstrakte edilen periferik sinir dokusu üzerinde 6 saatlik stimülasyon ve kayıt sağlamayı amaçlamaktadır. Bu yöntem kullanılarak elde edilen sonuçlar, deneyin tüm süresi boyunca milivolt aralığında tepeden tepeye genliklere sahip A-fiber bileşik aksiyon potansiyelleridir (CAP). CAP genlikleri ve şekilleri tutarlı ve güvenilirdir, bu da onları yeni elektrotları mevcut modellerle veya kimyasalların kullanımı, cerrahi değişiklikler veya nöromodülatör stimülasyon teknikleri gibi müdahalelerin doku üzerindeki etkilerini test etmek ve karşılaştırmak için yararlı kılar. Hem platin-iridyum kontaktlı geleneksel manşet elektrotları hem de ısmarlama iletken elastomer elektrotlar test edilmiş ve sinir uyaranı kuvvet-süre yanıtı açısından benzer sonuçlar vermiştir.

Giriş

Siliko modellenmiş olarak temel sinir fonksiyonunun mevcut anlayışı, özellikle soma, akson ve dendritlerin dışındaki sinir dokusu bölümlenmesinin etkileri ile ilgili olarak, birçok açıdan eksiktir. Akson-miyelin etkileşimleri, geleneksel elektriksel stimülasyon yanıtını yeterince yakalayan MRG¹ (memeli sinirleri için) gibi ayrıntılı hesaplamalı sinir modellerinin bile, yüksek frekanslı blok taşıma² veya ikincil başlangıçlı yanıt³ gibi deneysel olarak gözlemlenen diğer davranışları yakalamadığı gerçeğiyle kanıtlandığı gibi hala tam olarak anlaşılamamıştır.

Bu protokol, siniri izole etmek, çevresini kontrol etmek ve in vivo bağlamdan ex vivo bir bağlama çıkarmak için standartlaştırılmış bir hazırlık protokolü kullanarak, akut küçük bir laboratuvar hayvanı modelinde sinir düzeyinde nörofizyolojik süreçleri verimli bir şekilde araştırmak için bir yöntem sağlar. Bu, in vivo sinir stimülasyon protokolleri tarafından kullanılan diğer vücut süreçlerini veya anesteziklerin sinir davranışını değiştirmesini ve ölçülen sonuçları veya bunların yorumlanmasını karıştırmasını önleyecektir ^4,5. Bu, yalnızca az anlaşılmış sinir dokularına özgü etkilere odaklanan daha gerçekçi modellerin geliştirilmesini sağlar. Bu protokol aynı zamanda yeni sinir stimülasyonu ve elektrot materyallerinin ve geometrilerinin yanı sıra yüksek frekanslı blok ^2,3 gibi yeni stimülasyon paradigmaları için bir test yatağı olarak da yararlıdır. Bu tekniğin varyasyonları daha önce sıkı kontrol edilen koşullarda sinir fizyolojisini incelemek için kullanılmıştır⁶, örneğin, iyon kanalı dinamiklerini ve özelliklerini veya lokal anesteziklerin etkilerini ölçmek^{için 7}.

Bu teknik, akut in vivo küçük hayvan deneyleri⁸ gibi alternatiflere kıyasla çeşitli avantajlar sağlar. Teknik, doku vücuttan çıkarıldığı için anestezi derinliğini koruma ihtiyacını ortadan kaldırır ve anestezik difüzör, oksijen konsantratör ve ısıtma yastığı gibi gerekli ekipman miktarını azaltır. Bu, deneysel protokolü basitleştirerek hata riskini azaltır. Anestezikler potansiyel olarak sinir fonksiyonunu^{değiştirebildiğinden 4}, bu teknik, önlemlerin bu anestezik bileşiklerin yan etkileriyle karıştırılmamasını sağlar. Son olarak, bu teknik, anestezi uygulanmış bir hayvanı felç yoluyla öldürecek olan tetrodotoksin gibi nörotoksik bileşiklerin etkilerini incelerken akut in vivo deneylerden daha uygundur.

Periferik sinir kesitleri benzersiz bir ex vivo sistemdir, çünkü kaydedilen nöral sinyallerden sorumlu liflerin herhangi bir soma içermeme olasılığı yüksektir. Bunlar normalde motor nöronlar için, omurgada ve omurganın yanındaki dorsal kök gangliyonlarındaki duyusal nöronlar için yerleştirileceği için, memeli sinirinin bir bölümünün hazırlanması, kabaca, her iki ucunda da açık olan iyon kanallarına sahip boru şeklindeki zarların bir koleksiyonu olarak modellenebilir⁹. Metabolizma, doku diseksiyonu¹⁰ sırasında aksonda bulunan mitokondri tarafından korunur. Aksolemmanın açık uçlarının dikilmesi, ekstraksiyondan sonra onları kapatmak için teşvik edilir ve böylece normal sinir fonksiyonu için gerekli olan membran boyunca mevcut iyonik gradyanların korunmasına yardımcı olur.

Doku homeostazını vücudun dışında tutmak için, çeşitli çevresel değişkenler sıkı bir şekilde kontrol edilmelidir. Bunlar sıcaklık¹¹, oksijenasyon 12, ozmolarite, pH^13,14 ve metabolizmayı korumak için glikoza erişimdir. Bu protokol için yaklaşım, oksijen ve karbondioksit karışımı ile sürekli olarak havalandırılan modifiye edilmiş bir Krebs-Henseleit ^{tamponu 15,16} (mKHB) kullanmaktır. mKHB, örneğin ex vivo deneylerde, vücut dışındaki disseke dokuları korumak için kullanılan kardiyoplejik tamponlar ^6,17 ailesindedir. Bu tamponlar herhangi bir hemoglobin, antibiyotik veya antifungal içermez ve bu nedenle yalnızca sınırlı bir süre için az miktarda doku içeren preparatlar için uygundur. pH kontrolü, pH dengesini korumak için tamponun karbondioksit ile sürekli havalandırılmasını gerektiren karbonat ve karbondioksit redoks çifti ile sağlanmıştır. Bu, sinir hücresi fonksiyonunu değiştirebilen HEPES gibi diğer yaygın tamponlama ajanlarını kullanmaktan kaçınmaktır¹⁸. Tamponu oksijenlendirmek ve pH kontrolünü sağlamak için, karbojen adı verilen oksijende% 5 karbondioksit karışımı (% 95 O 2,% 5 CO₂) kullanılmıştır. Bir tampon kabının sıcaklık kontrolü için bir ısıtma karıştırıcısı kullanıldı ve tampon bir sinir banyosundan geçirildi ve daha sonra başlangıç kabına yeniden dolaştırıldı. Tipik bir deney, sinir canlılığını kaybetmeden ve artık sağlıklı dokuyu temsil edecek önlemler için stimülasyona yeterince yanıt vermeden önce 6-8 saat sürecektir.

Sinyal-gürültü oranını optimize etmek için, daha önce açıklanan yöntemlere göre hazırlanan kayıt için gümüş-klorür elektrotları kullanılmıştır¹⁹. Stimülasyon için, ticari kullanıma hazır platin manşet elektrotları ve özel yapım iletken polimer manşet elektrotlarının bir kombinasyonu kullanılabilir. İletken polimer manşet elektrotları, yüksek genlikli dalga formları²⁰ kullanarak siniri uyarırken yararlı olan özellikle daha yüksek şarj kapasitelerine sahiptir.

Bu protokolde kullanılan uyarıcı daha önce²⁰ olarak tanımlanmıştır. Kullanılacak belgeler, tasarım dosyaları ve yazılım komut dosyaları herkese açıktır²¹. Bu protokolü yürütmek için diğer uyarıcılar kullanılabilir; Bununla birlikte, özel stimülatör aynı zamanda daha geniş bir nörofizyoloji deneyi yelpazesine olanak tanıyan yüksek frekanslı alternatif akım (HFAC) blok ^2,20 yeteneğine de sahiptir. HFAC bloğunu kullanmak için, sinirin zarar görmesini önlemek için iletken elastomer manşetler önerilir. İletken elastomer sinir manşetleri, iletken bileşen olarak iletken elastomerlerden ve yalıtım olarak polidimetilsiloksandan üretilen yumuşak ve tamamen polimerik elektrot dizileridir²². Cihazlar, geleneksel lazer mikrofabrikasyon teknikleri kullanılarak bipolar konfigürasyonda üretildi.

Protokol

Tüm hayvan bakımı ve prosedürleri, İngiltere İçişleri Bakanlığı tarafından Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) Yasası (1986) uyarınca verilen uygun lisanslar altında gerçekleştirildi ve Imperial College London'ın Hayvan Refahı ve Etik İnceleme Kurulu tarafından onaylandı.

1. Tamponların hazırlanması

NOT: Protokolün bu kısmı, 1x konsantrasyonda modifiye Krebs-Henseleit Tamponunun (mKHB) hazırlanmasını içeren son adımlar hariç, protokolün geri kalanından çok önce gerçekleştirilebilir.

1. 1 M CaCl₂ stok çözümü hazırlayın
   1. Temiz bir 100 mL beherine 14.701 g CaCl₂ dihidrat ekleyin. ~ 75 mL deiyonize su ekleyin ve tuzun tamamen çözünmesine kadar karıştırın.
   2. Çözeltiyi 100 mL dereceli bir şişeye aktarın ve 100 mL hacme ulaşana kadar deiyonize su ekleyin. Çözeltiyi bir şişeye aktarın ve 4 ° C'de bir buzdolabında saklayın.
2. 10x konsantre mKHB stoğu hazırlayın
   1. 2 L'lik bir beherin içine 66.03 g sodyum klorür (NaCl), 3.57 g potasyum klorür (KCl), 1.63 g potasyum dihidrojen fosfat (KH₂PO₄) ve 1.44 g magnezyum sülfat ekleyin.
   2. Behere ~ 750 mL deiyonize su ekleyin ve tuzlar çözünene kadar karıştırın (altta küçük tuz kristalleri kalabilir). 25 mL'lik 1 M CaCl₂ stok çözeltisi ekleyin (adım 1.1) ve karıştırın; bunun eklenen son tuz olduğundan emin olun.
   3. Çözeltiyi 1 L'lik dereceli bir şişeye aktarın ve toplam 1 L'lik bir hacme ulaşmak için deiyonize su ekleyin. Konsantre 10x mKHB'yi 4 ° C'de buzdolabında saklayın.
      NOT: Konsantre mKHB stoğu, değiştirilmeden önce yaklaşık 1 ay saklanabilir.
3. Diseksiyon hazırlama Petri kabı (kaplama)
   1. Bulaşığı dikkatlice yıkayarak ve kurutarak kaplama için temiz bir cam Petri kabı (120 mm çapında) hazırlayın.
   2. Konformal alkoksi kaplamanın kullanımı ve kürlenmesi için üreticinin talimatlarını takiben, konformal kaplama karışımını istenen kalınlığa ulaşana kadar dikkatlice kabın içine dökerek Petri Tabağının tabanını ~ 3-5 mm kaplama ile kaplayın.
   3. Kaplamayı 60 °C'de bir fırında, dokunuşa sıkı sıkıya dayanana kadar kürleyin. Diseksiyon Petri kabı şimdi hazır.
      NOT: Her kullanımdan sonra kabın nazikçe temizlenmesi, kaplamanın değiştirilmesi gerekmeden önce yıllarca dayanmasını sağlayacaktır. Kaplamayı değiştirirken, yeni bir kaplama uygulamadan önce tüm kaplama malzemesini çıkardığınızdan emin olun. Bu protokolde kullanılan konformal alkoksi kaplamanın (Malzeme Tablosu) bir yıldan daha kısa bir raf ömrüne sahip olduğunu unutmayın.

2. Diseksiyon öncesi hazırlıklar

NOT: Bu adım denemeyi başlatır. Aşağıdaki adımlar aynı gün, bu sırayla gerçekleştirilmelidir.

1. 1x mKHB hazırlayın
   1. Tampon için temiz bir 2 L beher hazırlayın. 200 mL 10x mKHB stoğunu 2 L beherine aktarın. 2 L beherine 2.1 g sodyum karbonat (NaHCO₃) ve 0.99 g susuz Dekstroz (D-glikoz) ekleyin.
   2. Behere yaklaşık 1 L deiyonize su ekleyin. Tuzlar tamamen çözülene kadar karıştırın. Çözeltiyi 2 L dereceli bir şişeye aktarın ve toplam 2 L'lik bir hacme ulaşmak için deiyonize su ekleyin.
   3. Çözeltiyi, sıcaklığı 37 ° C'ye ayarlanmış bir ısıtma karıştırıcısına yerleştirilmiş 2 L'lik bir cam şişeye aktarın.
      NOT: Daha küçük ısıtma karıştırıcısı, su dolu büyük kapların termal ataleti nedeniyle genellikle hedef 37 °C sıcaklığa ulaşamaz. Sıcaklığı yukarı doğru ayarlayın, böylece şişenin içeriği karıştırma ile 37 ° C'ye ulaşır. Deney sırasında sıcaklığı izleyin ve aşım durumunda ayarlanan sıcaklığı düşürün.
   4. Sıcaklığı izlemek için 2 L'lik şişeye bir termometre yerleştirin, termometrenin karıştıran pireden etkilenmesini önlemek için tutucular kullanın. Çözeltiyi oksijenlendirmek için tamponu karbojenle en az 30 dakika havalandırın. Bu, pH'ı 7.4'e ayarlamalıdır. pH değerini bir pH metre ile ölçün, pH değeri 7,4'ün 0,1 pH birimi (37 °C'de) içinde olduğundan emin olun.
      NOT: PH'ı 7,4'e ayarlamak için, gerektiğinde hidroklorik asit veya sodyum hidroksit kullanın.
   5. İki adet 15 mL santrifüj tüpü ve bir adet 100 mL şişeyi mKHB ile doldurun ve soğuması için buzun üzerine yerleştirin.
      NOT: Santrifüj tüpleri ve şişe, otoklavlama yapılmadan her deneyden sonra temizlenebilir ve tekrar kullanılabilir.
   6. Deneyin sonraki bölümleri için, 2 L şişedeki tamponu 37 ° C'de karbojenle sürekli karıştırma ile havalandırmaya devam edin.
      NOT: Denetimsiz karbojen kullanımı, sızıntı durumunda gaz akışını kapatmak için otomatik sistemler mevcut değilse tehlikeli olabilir. Otomatik bir sensör ve elektronik kapatma valfi bunu hafifletebilir; Aksi takdirde, diseksiyon farklı bir odada gerçekleşirse, ekipmanı denetlemek için bir kişi bırakılmalıdır. Her durumda, ortam oksijen konsantrasyonu %25'in üzerine çıktığında operatörleri uyarmak için kurulumun yakınında bir oksijen sensörü kullanılmalıdır. Mümkünse aktif havalandırmalı bir oda kullanın.
2. Sıcaklık stabilizasyonu için yeterli zaman tanımak üzere sinyal alma cihazını, düşük gürültülü ön amplifikatörü, hat gürültü filtresini ve kayıt ve stimülasyon için osiloskobu açın.
3. Tüm elektrikli kayıt ekipmanlarının doğru yapılandırıldığından emin olun
   1. Giriş bandı geçiş filtresi on yılda 6 dB yuvarlanmaya ayarlanmış ve kesme frekansları yüksek geçişli ve alçak geçirgen filtreler için sırasıyla 30 Hz ve 3 kHz'e ayarlanmış olarak düşük gürültülü ön amplifikatörü AC bağlantılı girişe ayarlayın.
   2. Düşük gürültülü ön amplifikatörün kazancını 100 olarak ayarlayın.

3. Hayvan anestezisi ve ötenazi

NOT: Çalışmalarda 250 ila 330 g (Malzeme Tablosu) arasındaki dişi sıçanlar kullanılmıştır.

1. Cerrahi aletler ve sarf malzemeleri hazırlayın: 12 cm düz makas (künt); 2 mm kesme kenarı açılı yaylı makas; 4 cm ince makas, keskin veya yarı keskin; #7 Dumont forseps; 45° açılı ince forseps ve 6-0 dikiş ipeği veya iplik.
2. Sıçanı bir anestezi kabına veya odasına yerleştirin. Oksijen ve anestezik difüzörü kaba bağlayın. Anestezik (izofluran) konsantrasyonunu% 3.5'e ayarlayın ve yaklaşık 10 dakika veya hayvan sağ refleks kaybı gibi anestezi belirtileri gösterene kadar bekleyin.
3. Sıçan anestezi belirtileri gösterdikten sonra, bir ayak parmağı sıkışma yoksunluk refleks testi ile bilinç kaybını onaylayın. Sadece ayak parmağı çekilmesi olmadığında devam edin; aksi takdirde, difüzördeki tüm bağlantıları ve anestezik seviyeleri kontrol edin ve adım 3.2'yi tekrarlayın.
4. Hayvanı kaptan çıkarın ve servikal çıkık ile devam edin, ardından ölümün doğrulanması için femoral arterin kesilmesi ile devam edin.

4. Diseksiyon protokolü

NOT: Hayvanı göbeği aşağı bakacak şekilde diseksiyon masasına yerleştirin. Her iki bacak için de aşağıdaki adımları tekrarlayın. Tipik olarak, önce sağ bacak diseke edilir.

1. Ayak bileğini başparmak, işaret parmağı ve orta parmak arasında sıkıca tutarak, kalkaneal tendonu 12 cm düz künt makas kullanarak kesin.
2. İnce keskin makaslarla, bacağın arkasındaki kalkaneal tendondan omurganın tabanına kadar bir cilt kesisi yapın, aşağıdaki kas dokusunu diseke etmemeye dikkat edin.
3. İnce forseps ve ince makas kullanarak, siyatik sinir açığa çıkana kadar bacağın arkasının ortasına yakın kas katmanlarından dikkatli kesikler yapın. Siyatik sinir görünür olur olmaz, sinirin kurumasını önlemek için buz gibi soğuk mKHB kullanarak boşluğu nemlendirin.
4. Hemostatları kullanarak, her iki taraftaki cilt kapaklarını birbirinden ayırın ve daha ince diseksiyon çalışmaları için insizyonu açık tutun. Kalkaneal tendon insizyonunun bulunduğu yerden başlayarak, ince makasla, siniri serbest bırakmak için bacağın medial tarafındaki kası kesin. Buz gibi soğuk mKHB ile bölgedeki nem seviyelerini korumaya devam edin.
5. Bacak yukarı doğru hareket ederken sinir açığa çıktığından, üstteki kas dokusunu disseke edin. Omurgaya yakın olan siniri, omurga yarığına ulaşana kadar bağ dokularından serbest bırakın, bu noktada sinirde bir bükülme vardır. Bu aşamada hız çok önemli olduğu için siniri henüz temizlemeye çalışmayın.
6. Siniri omurgaya mümkün olduğunca yakın bir yerde ince makasla kesin. Diseksiyonu kolaylaştırmak için, forseps kullanarak sinirin ucunu ayak bileğinin yanına çok nazikçe çekin. Siniri asla ortada tutmayın, sadece uçları sıkıştırın. Asla siniri gergin çekmeyin.
   İSTEĞE BAĞLI: Bu noktada, zaman izin verirse, canlılığın korunmasına yardımcı olmak için sinirin her iki ucunun dikilmesi gerçekleştirilebilir. Hasarı önlemek için elleçlemeyi minimumda tutun. Yeterli zaman yoksa (bkz. adım 4.5), bu adımı atlayın ve sonraki adım 5.2'yi izleyin.
7. Disseke edilmiş siniri mKHB ile doldurulmuş 15 mL santrifüj tüpüne yerleştirin (adım 2.1.5), tüpü kapatın ve temizleme prosedürünün başlamasına kadar tüpü tekrar buzun üzerine yerleştirin.
8. Diğer bacak için 4.1-4.7 arasındaki adımları yineleyin. İdeal olarak, doku canlılığını en üst düzeye çıkarmak için her sinirin çıkarılması 5-10 dakika sürmelidir.

5. Sinir temizleme prosedürü

1. Kaplanmış Petri kabını yaklaşık olarak yarı yarıya soğutulmuş oksijenli mKHB ile doldurun. Disseke edilmiş siyatik sinirlerden birini tabağa yerleştirin ve sinirin her iki ucunu da çanağa sabitleyin, böylece sinir bükülme, burulma veya bükülme olmadan düz olur. Siniri uçlarına mümkün olduğunca yakın tutun.
2. 6-0 ipek dikiş veya ince iplik kullanarak, tampona sitosol sızıntısını önlemek için sinirin her iki ucuna çift düğüm bağlayın. Düğümleri, sinir merkezine daha yakın olan taraftaki böcek pimlerinin hemen yanına yerleştirin, çünkü bu, sinir dokusundan tampona sızmayı önleyecektir. Sinir daha önce bağlanmışsa bu adımı uygulamayın.
3. Hassasiyet için mikroskop ve 2 mm açılı yay makası kullanarak, sinirden yağ, kan damarları ve kas dokusunu çıkarın. Stimülasyon ve kayıt protokolünde kullanılmayacak sinir dallarını budayın.
   1. Her 5 dakikalık temizlikte, tamponu taze soğutulmuş oksijenli mKHB ile değiştirin. Diseksiyonu kolaylaştırmak için bağ dokularını, yağ ve kan damarlarını çekmek için ince forseps kullanın.
4. Sinirleri taze oksijenli soğutulmuş mKHB ile doldurulmuş taşıma tüplerine geri yerleştirin ve tüpleri buzun üzerine yerleştirin.

6. Ekipman kurulumu

NOT: Deneyleri gerçekleştirmek için kullanılan ekipman kurulumu Şekil 1'de gösterilmiştir. Kısaca, çift bölmeli bir sinir banyosu, bir ısıtma karıştırıcısına yerleştirilmiş 2 L'lik bir şişe, tampon havalandırması için bir karbojen kaynağı ve tamponun şişeden banyoya ve peristaltik bir pompa kullanarak şişeye geri akmasına izin veren borulardan oluşur. Banyo, pleksiglastan veya su geçirmez malzemelerden 3D baskıdan işlenebilir. Yaklaşık 2 cm derinliğe sahiptir ve banyonun iki odacığını ayıran bölme, periferik bir sinirin her iki odacıkta da dişlenmesine izin vermek için 1,5 mm çapında bir deliğe sahiptir. Bir oda büyüktür, en az 4 veya 5 cm uzunluğunda olmalı ve tamponla doldurulacaktır. Diğer hazne en az 3 cm uzunluğunda olmalı ve silikon veya mineral yağ ile doldurulmalıdır. Banyo çok büyük yapılmamalıdır, çünkü bu perfüzyon, sıcaklık ve pH kontrolünü bozacaktır. İncelenen sinir dokusunun boyutuna bağlı olarak farklı banyo boyutları gerekebilir.

1. Temiz bir çift odacıklı sinir banyosu hazırlayın (tasarım özellikleri için Ek Dosya'ya bakınız). Sinir banyosunu, standart laboratuvar patron kafalarını ve tutucuları kullanarak ısıtma karıştırıcısına yerleştirilen 2 L'lik şişenin seviyesinin altına yerleştirin. Banyonun tahliyesini peristaltik pompa girişine bağlayın.
2. Peristaltik pompanın çıkışını 2 L tampon şişesine geri giden bir tüpe bağlayın. Banyo girişini ayarlanabilir bir akış valfi ile bir tüpe bağlayın ve tüpü 2 L şişenin içine yerleştirin. Yerçekimi destekli tampon girişi için tüpün sifon olarak astarlanmasına yardımcı olması için orta çıkışa bağlı bir şırıngaya sahip üç bir valf kullanın.
3. Şırıngayı tampon içine akana kadar çekerek sifonu astarlayın. Vanayı, tamponun banyoya akış hızı ~ 5-6 mL · ^min-1 olacak şekilde yapılandırın. Banyoyu doldurmak için akış başlangıçta arttırılabilir. Banyo tamponu seviyesi drenaja ulaştığında, sinirleri banyoya yerleştirin.
4. Bir böcek pimi kullanarak, sinirin ucunu tampon dolu banyo odasının köşesine sabitleyin. 45° açılı ince forseps kullanarak ve siniri sadece uçlarından sıkıştırarak, iki banyo odası arasındaki bölmedeki delikten uyarılmak üzere siniri dikkatlice geçirin.
5. Sinirin diğer ucunu banyonun yağ odasına bir böcek pimi ile sabitleyin, sinirin gerilmeden düz olmasını ve bükülme ve bükülmelerden arındırılmış olmasını sağlayın. Silikon gres kullanarak, tampon odasından yağ odasına tampon sızıntısını önlemek için bir sızdırmazlık yapın. Yağ haznesini silikon veya mineral yağ ile doldurun.
6. Ag/AgCl kayıt elektrot kancalarını yağ banyosu odasına yerleştirin ve patron kafaları ve tutucular kullanarak sabitleyin. Yağ banyosundaki sinirin bir kısmını, siniri gerginleştirmeden kancaların üzerine örtün. Siniri sıkıştırmayın; siniri sıkıştırmadan kaldırmak için açılı forseps kullanın.
7. Siniri hareket ettirdikten sonra herhangi bir sızıntı gözlenirse silikon gres contasını ayarlayın veya onarın.
8. Referans Ag/AgCl elektrodunu amplifikatör toprağına bağlayın ve elektrodu bir laboratuvar tutucusu kullanarak sabitleyerek tampon dolu banyo odasına yerleştirin.

7. Banyoda sinire elektrot implantasyonu

1. Referans^21'e göre stimülasyon için temiz bir sinir manşet elektrodu hazırlayın. Elektrodu tampon dolu banyo odasına yerleştirin. Forseps veya künt veya açılı uçlu ince cımbız kullanarak, manşetin içini ıslatmak için banyodaki elektrodu açın.
2. Kabarcıklar kalırsa, banyodan tampon çekmek için ince bir şırınga kullanın ve kabarcıkları manşetten dışarı çıkmaya zorlayın. Sinirin altında bir cımbızla, manşeti yavaşça açın ve sinirin altına kaydırın. Sinirin etrafındaki manşeti kapatın, sinirin bükülmesini veya bükülmesini önlemeye özen gösterin.
3. Stimülasyon elektrodunu stimülatöre bağlayın ve stimülasyon elektrodu kablosunu bantla sabitleyin. Mevcut dönüş elektrodunu stimülatöre bağlayın ve kabloyu bantla sabitleyin. Akım dönüş elektrodu olarak kare platin bir tabaka kullanıyorsanız, tabakayı banyodaki sinirden uzağa yerleştirin.

8. Stimülasyon ve kayıt

1. Stimülatör TTL sinyal çıkışını, osiloskobu tetiklemek için kullanılacak olan osiloskobun kanal 4'üne bağlayın. Osiloskop ekranında, Tetikleyici kanal sekmesine basın ve tetikleyici kanal olarak Kanal 4'ü belirtin. Seviye düğmesini kullanarak tetikleme düzeyini 1 V olarak ayarlayın.
2. Osiloskopta, zaman çözünürlüğünü 1 ms / bölmeye ve voltaj çözünürlüğünü 10 mV / bölmeye ayarlayın. Tetikleyici referansını zamanında ortalayın ve tetikleyici düzeyini 1 V olarak ayarlayın.
   NOT: Özel uyarıcı kullanıyorsanız 8.3 ile 8.6 arasındaki adımları izleyin (bkz. MATLAB yazılımının ve aygıt sürücülerinin, özel nöral uyarıcı²¹ için çevrimiçi olarak serbestçe sağlanan talimatlar kullanılarak laboratuvar bilgisayarına yüklendiği varsayılmaktadır. Aksi takdirde, alternatif olarak ticari olarak temin edilebilen bir uyarıcının kullanımı için üreticinin talimatlarını izleyin.
3. Stimülatörün laboratuvar bilgisayarına bağlanmasını sağlayın. Pil güç kaynağını güç girişine bağlayarak uyarıcıyı açın. Laboratuvar bilgisayarında MATLAB yazılımını başlatın.
4. Özel MATLAB komut dosyasını yürütün: HFAC_4ch_Stimulator_Initialization.m (Malzeme Tablosu).
   NOT: Bilgisayar ve uyarıcı arasındaki USB iletişim kablosu yeşil renkte yanıp sönmelidir. Olmazsa, bir yapılandırma hatası vardır ve güç kaynağı ve bağlantılar doğrulanmalıdır.
5. MATLAB komut dosyasını açın: HFAC_4ch_Monophasic_Stimulation.m (Malzeme Tablosu). MATLAB betiğini doğrudan düzenleyerek, parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: uyarıcı darbe genliği = -300 μA, uyarıcı darbe genişliği = 300 μs, uyarıcı darbe sayısı = 10 ve darbeler arasındaki uyarıcı süresi = 1 s.
6. MATLAB yazılımında Çalıştır'a tıklayarak stimülasyon protokolünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokol ile elde edilebilecek temsili sonuçlar, siyatik sinir içindeki A-tipi sinir liflerinden tutarlı bileşik aksiyon potansiyelleridir. Bu aksiyon potansiyelleri tipik olarak elektrotta yaklaşık 1 mV'luk bir tepeden tepeye genliğe sahiptir ve bu nedenle bir kez yükseltildiğinde 100 mV'dur (Şekil 2). Benzer stimülasyon genlikleri ve darbe genişlikleri benzer CAP genlikleri vermelidir. İletken elastomer manşet elektrotları, ticari olarak temin edilebilen platin manşet el...

Tartışmalar

Bu çalışmada, sıçan siyatik sinirlerini ex vivo nörofizyolojiye hazırlamak için bir protokol tanımladık. Doku ekstraksiyonu, hayvan taşıma, anestezi, itlaf ve diseksiyon dahil olmak üzere yaklaşık 30 dakika sürerken, sinir temizliği, banyoya yerleştirme ve elektrot implantasyonu, kayda başlamadan önce 30 dakika daha gerektirmelidir. Tampon hazırlığı 30 dakika içinde gerçekleştirilebilir, ancak bu deneyin geri kalanından önce yapılabilir. Bu tür bir hazırlık ve deney, benzer tampo...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L Glass bottle	VWR International Ltd	215-1595	Borosilicate glass
1 L Glass graduated flask	VWR International Ltd	612-3626	Borosilicate glass
2 L Glass bottle	VWR International Ltd	215-1596	Borosilicate glass
2 L Glass graduated flask	VWR International Ltd	BRND937254	Borosilicate glass
Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT	RS UK	536-2599	push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube
Alkoxy conformal coating	Farnell	1971829	ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation
Anesthetic	Chanelle	N/A	Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle
Beaker, 2 L	VWR International Ltd	213-0469	Borosilicate glass
Bipolar nerve cuff	Cortec GMBH	N/A	800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination
Bossheads	N/A	N/A	Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods
Calcium Chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902-500g	500 g in plastic bottle
Carbogen canister	BOC	N/A	F-size canister
Centrifuge Tubes, 15 mL volume	VWR International Ltd	734-0451	Falcon tubes
Conductive elastomer nerve cuff	N/A	N/A	high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference
Connector, Termimate	Mouser UK	538-505073-1100-LP	These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11)
Crocodile clip connectors	RS UK	212-1203	These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10)
Deionized Water	N/A	N/A	Obtained from deionized water dispenser
Forceps angled 45 degrees	InterFocus Ltd	91110-10	Fine forceps, student range
Forceps standard Dumont #7	InterFocus Ltd	91197-00	Student range forceps
Gas Disperson Tube, Porosity 3	Merck	12547866	N/A
Glucose anhydrous, powder	VWR International Ltd	101174Y	500 g in plastic bottle
Grippers	N/A	N/A	Standard wet laboratory rod-mounted grippers
Heating Stirrer	RS UK	768-9672	Stuart US152
Hemostats	N/A	N/A	Any hemostat >12 cm in length is suitable
Insect Pins, stainless steel, size 2	InterFocus Ltd	26001-45	N/A
Laptop computer	N/A	N/A	Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable
Line Noise Filter	Digitimer	N/A	Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter)
Low-Noise Preamplifier, SR560	Stanford Research Systems	SR560	Low-noise voltage preamplifier
Magnesium Sulphate salt	VWR International Ltd	291184P	500g in plastic bottle
MATLAB scripts	Github	https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch	Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator
MATLAB software	Mathworks	N/A	Standard package
Microscope Light, PL-2000	Photonic	N/A	Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier
Microscope, SMZ 745	Nikon	SM745	Stereoscopic Microscope
Mineral oil, non-toxic	VWR International Ltd	31911.A1	Oil for nerve bath
Nerve Bath	N/A	N/A	Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details.
Oscilloscope	LeCroy	N/A	434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers
Oxygen Hose, 1 meter	BOC	N/A	1/4" NPT terminations
Oxygen Regulator	BOC	C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar	N/A
Peristaltic Pump P-1	Pharmacia Biotech	N/A	Product may be obtained from third party supplier
Petri Dish, Glass	VWR International Ltd	391-0580	N/A
Potassium Chloride salt	Sigma Aldrich	P5405-250g	250 g in plastic bottle
Potassium Dihydrogen Sulphate salt	Merck	1.04873.0250	250 g in plastic bottle
Rat	Charles River Laboratories	N/A	Sprague Dawley, 250-330 grams, female
Reference electrode, ET072	eDaQ (Australia)	ET072-1	Silver silver-chloride reference electrode
Rod	N/A	N/A	Standard wet laboratory rods with fittings for stands
Scale	Sartorius	N/A	M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers
Scissors straight 12 cm edge	InterFocus Ltd	91400-12	blunt-blunt termination, student range
Signal Acquisition Device	Cambridge Electronic Design	Micro3-1401	Micro3-1401 Multichannel ADC
Silicone grease, non-toxic	Farnell	3821559	for sealing of bath partition
Silicone tubing, 2 mm inner diameter	N/A	N/A	N/A
Silicone tubing, 5 mm inner diameter	N/A	N/A	N/A
Silver wire	Alfa Aesar	41390	0.5 mm, annealed
Sodium Bicarbonate salt	Sigma Aldrich	S5761-500g	500 g in plastic bottle
Sodium Chloride salt	VWR International Ltd	27810.295	1 kg in plastic bottle
Spring scissors angled 2 mm edge	InterFocus Ltd	15010-09	N/A
Stand	N/A	N/A	Standard wet laboratory stands with sockets for rods
Stimulator	Digitimer	DS3	DS3 or Custom Stimulator (see references)
Stirring flea	VWR International Ltd	442-0270	For use with the heating stirrer
Syringe tip, blunt, 1 mm diameter	N/A	N/A	N/A
Syringe tip, blunt, 2 mm diameter	N/A	N/A	N/A
Syringe, plastic, 10 mL volume	N/A	N/A	syringe should have luer lock fitting
Tape, water-resistant	N/A	N/A	For securing tubing and wiring to workbench
Thermometer	VWR International Ltd	620-0806	glass thermometer
USB Power Bank	RS UK	135-1000	Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3
Valve, Leuer Lock, 3-Way	VWR International Ltd	229-7440	For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon