הדמיה של המאפיינים המורפולוגיים של צומת נוירומוסקולרי בשריר גסטרוקנמיוס מדיאלי של חולדה

Summary

הפרוטוקול מראה שיטה לבחינת קורלציה מרחבית בין ההדקים הקדם-סינפטיים, הקולטנים הפוסט-סינפטיים ותאי שוואן הפרי-סינפטיים בשריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי של החולדה באמצעות אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית עם סמנים ביולוגיים שונים, כלומר נוירופילמנט 200, טרנספורטר אצטילכולין שלפוחיתי, אלפא-בונגארוטוקסין ו-S100.

Abstract

הצומת הנוירומוסקולרי (NMJ) הוא מבנה מורכב המשרת את תקשורת האותות מהנוירון המוטורי לשריר השלד ומורכב משלושה מרכיבים היסטולוגיים חיוניים: מסופי האקסון המוטורי הטרום-סינפטיים, קולטני אצטילכולין ניקוטיניים פוסט-סינפטיים (AchRs) ותאי שוואן פרי-סינפטיים (PSCs). על מנת להדגים את המאפיינים המורפולוגיים של NMJ, שריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי של החולדה נבחר כרקמה המטרה ונבדק על ידי שימוש בכתמים פלואורסצנטיים מרובים עם סוגים שונים של סמנים ביולוגיים, כולל נוירופילמנט 200 (NF200) וטרנספורטר אצטילכולין שלפוחיתי (VAChT) עבור סיבי העצב המוטוריים וההדקים הטרום-סינפטיים שלהם, אלפא-בונגארוטוקסין (α-BTX) עבור ה-AchRs הניקוטיניים הפוסט-סינפטיים, ו-S100 עבור ה-PSCs. במחקר זה בוצעו הכתמים בשתי קבוצות: בקבוצה הראשונה, הדגימות הוכתמו ב-NF200, VAChT ו-α-BTX, ובקבוצה השנייה הוכתמו הדגימות ב-NF200, α-BTX ו-S100. הוכח כי שני הפרוטוקולים יכולים להדגים ביעילות את המבנה המפורט של NMJ. באמצעות המיקרוסקופ הקונפוקלי, נראו מאפיינים מורפולוגיים של ההדקים הטרום-סינפטיים, הקולטנים הפוסט-סינפטיים וה-PSC, ותמונות ערימות ה-Z שלהם שוחזרו בתבנית תלת-ממדית כדי לנתח עוד יותר את המתאם המרחבי בין התוויות השונות. מנקודת המבט של המתודולוגיה, פרוטוקולים אלה מספקים התייחסות רבת ערך לחקר המאפיינים המורפולוגיים של NMJ בתנאים פיזיולוגיים, אשר עשויים להתאים גם להעריך את השינוי הפתולוגי של NMJ, כגון פגיעה בעצבים היקפיים והתחדשות.

Introduction

כשלושה מרכיבים מבניים חיוניים של הצומת הנוירומוסקולרי (NMJ)^1,2,3,4, נחקרו בהרחבה היבטים מורפולוגיים של מסופי האקסון המוטורי הקדם-סינפטי, הממברנה הפוסט-סינפטית המכילה קולטני אצטילכולין ניקוטיניים (AchRs) ותאי שוואן פרי-סינפטיים (PSCs). מקטעים דקים ודגימות שלמות של שרירי השלד נבדקו בטכניקות היסטולוגיות שונות, כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים ^5,6, מיקרוסקופיה קונפוקלית ^7,8 ומיקרוסקופיה של יריעות אור ^9,10. למרות המאפיינים המורפולוגיים של NMJ הודגמו על ידי טכניקות אלה מהיבטים שונים, כהשוואה, מיקרוסקופיה קונפוקלית היא עדיין בחירה אידיאלית להדמיה של המורפולוגיה המפורטת של NMJ.

לאחרונה פותחו טכנולוגיות חדשות רבות להצגת הרכיבים המבניים של NMJ. לדוגמה, עכברים פלואורסצנטיים מהונדסים thy1-YFP שימשו ישירות לצפייה באקסונים מוטוריים ובלוחות קצה מנועים in vivo וב- in vitro^10,11. בנוסף, הזרקה תוך ורידית של α-BTX פלואורסצנטיים יושמה כדי לחשוף את ההתפלגות המרחבית של לוחות קצה מוטוריים בשרירי שלד בהרכבה מלאה של עכברים פלואורסצנטיים מסוג פראי ומהונדס, על ידי שימוש בטיפול בפינוי אופטי של רקמות לבדיקה עם מיקרוסקופיה של יריעות אור ^9,12. עם זאת, מלבד האלמנטים הטרום-סינפטיים והפוסט-סינפטיים שניתן לצפות בהם בשיטות מתקדמות אלה, לא ניתן להדגים את ה-PSCs בו-זמנית.

עדויות מצטברות מצביעות על כך ש- PSCs, כתאי הגליה ההיקפיים, קשורים קשר הדוק עם ההדקים הטרום-סינפטיים התורמים להתפתחות וליציבות של NMJ, לאפנון הפעילות הסינפטית של ה- NMJ במצב הפיזיולוגי, ולהתחדשות של ה- NMJ לאחר פגיעה עצבית 13,14,15 . בהתחשב בארכיטקטורה התאית של NMJ, פרוטוקול זה הוא מועמד ראוי לתייג בו זמנית את PSCs, אלמנטים טרום ואחרי סינפטיים, והוא עשוי לשמש להערכת השלמות והפלסטיות של NMJ בתנאים נורמליים ופתולוגיים_. לדוגמה, השווה את עוצמת NMJ, המורפולוגיה והנפח של לוחות קצה מוטוריים פוסט-סינפטיים, עצבנות וניתוק עצבים של NMJ, ומספר PSCs בשרירים בעלי מצב פיזיולוגי ופתולוגי.

שריר הגסטרוקנמיוס הוא השריר הגדול ביותר היוצר את הבליטה בשוק, אשר מנותח בקלות על ידי הסרת העור ושריר הירך האחורי מהגפיים. השריר נבחר לעתים קרובות כדי להעריך ניוון שרירים, ניוון עצבימוסקולרי, ביצועי שרירים וכוח יחידה מוטורית ex vivo או in vivo 16,17,18. עם זאת, הטכניקה מתאימה גם לחשיפת המאפיינים המורפולוגיים של NMJ משרירי שלד שונים. יחד עם זאת, מקטעי השרירים העבים יכולים לחשוף מורפולוגיה מלאה יותר וכמות של NMJ בהשוואה למקטעים דקים ^7,8 וסיבי שריר^{מתגרים 19}.

בהתאם למחקרים אלה, שריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי של החולדה נבחר כרקמת המטרה במחקר זה ונפרס בעובי של 80 מיקרומטר לצורך צביעה פלואורסצנטית מרובה עם סוגים שונים של סמנים ביולוגיים בהתאם למרכיבים המבניים של NMJ. כאן, נוירופילמנט 200 (NF200)^20,21, טרנספורטר אצטילכולין שלפוחיתי (VAChT)²², אלפא-בונגארוטוקסין (α-BTX)^23,24, ו-S100^25,26 שימשו לסימון סיבי עצב, מסופים טרום-סינפטיים, AchRs פוסט-סינפטיים ו-PSCs בהתאמה. בנוסף, הרקע של רקמת השרירים וגרעיני התאים הוכתמו עוד יותר עם פאלואידין ו-DAPI.

במחקר זה, אנו מצפים לפתח פרוטוקול מעודן להכתמת הארכיטקטורה התאית של NMJ בו-זמנית עם הסמנים הביולוגיים המתאימים להם על דגימות קבועות עבות יותר, אשר נוח יותר לשימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית ומסייע להשיג מידע רב יותר על המבנה המפורט של PSCs, אלמנטים טרום-סינפטיים ופוסט-סינפטיים, כמו גם על המתאם המרחבי שלהם זה לזה. מנקודת המבט של המתודולוגיה, פרוטוקול זה עשוי להועיל להעריך את המאפיינים המורפולוגיים של NMJ בתנאים נורמליים ופתולוגיים.

Protocol

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של המכון לדיקור סיני ומוקסיבוסציה, האקדמיה הסינית למדעי הרפואה (אישור מס '2021-04-15-1). כל ההליכים נערכו בהתאם למדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול בחיות מעבדה ולשימוש בהן (הוצאת האקדמיה הלאומית, וושינגטון הבירה, 1996). נעשה שימוש בשלוש חולדות זכרים בוגרים (ספראג-דאולי, משקל 230 ± 15 גרם). החולדות שוכנו במחזור אור/חושך של 12 שעות עם טמפרטורה ולחות מבוקרות ועם גישה חופשית למזון ולמים. המכשירים והחומרים של מחקר זה מוצגים באיור 1.

1. פרפוזיה

1. הזריקו 250 מ"ג/ק"ג תמיסת טריברומואתנול תוך-צפקית כדי לגרום להמתת חסד של החולדות.
2. לאחר הפסקת הנשימה, פתחו את חלל בית החזה כדי לגשת ללב באמצעות מספריים ומלקחיים. החדירו קטטר תוך ורידי מחדר הלב השמאלי לכיוון אבי העורקים, ולאחר מכן חתכו את האוריקל הימני.
3. מכניסים את החולדות הניסיוניות למכסה המנוע. התחילו ב-100 מ"ל של 0.9% מי מלח רגילים עד שהדם היוצא מהאוריקל הימני יהיה צלול, ואז המשיכו לחדור עם 250-300 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד ב-0.1 מ' חיץ פוספט (PB, pH 7.4) במשך כ-10 דקות עד שיהיה קשה לכופף את הזנב.

2. אנטומיה אזורית

1. לאחר הזלוף, הסירו את העור של הגפה האחורית הדו-צדדית באמצעות להב כירורגי (איור 2A) וחשפו את העצב הסיאטי הדו-צדדי ואת שריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי (איור 2B).
2. נתחו בזהירות את שריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי הדו-צדדי מהגפה האחורית באמצעות להב (איור 2C) ולאחר מכן תיקנו את השריר כולו ב-10 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד ב-0.1 M PB למשך שעתיים.
3. הסר את השריר מהתמיסה והגן על השריר ב-10 מ"ל של 25% סוכרוז ב-0.1 M PB במשך יום אחד ב-4 מעלות צלזיוס עד שהשריר שקוע לחלוטין בתמיסה.

3. קריו-וסט של השריר

1. לאחר שהרקמה השרירית שקועה בתמיסה, לתקן אותה בשלב הקפאה של מערכת מיקרוטום הזזה באמצעות מדיום חתך קפוא. פורסים את השריר אופקית לאורך הציר הארוך של השריר בעובי של 80 מיקרומטר.
2. הניחו שבעה מקטעי קריו לבאר בצורה מסודרת בצלחת תרבית בת שש בארות עם 10 מ"ל של 0.1 M PB (pH 7.4) באמצעות מברשת.
   הערה: המקטעים ממוקמים לפי הסדר כך שהקטעים בבארות שונות יהיו סמוכים, מה שהופך את החלקים המשמשים לכתמים שונים לעקביים יותר.

4. כתמים פלואורסצנטיים מרובים עם NF200, VAChT, α-BTX ו-Pha

הערה: כתמים פלואורסצנטיים מרובים עם NF200, VAChT, α-BTX ו- Pha יושמו כדי לחשוף את סיבי העצב, ההדקים הטרום-סינפטיים, קולטני אצטילכולין ניקוטיניים פוסט-סינפטיים וסיבי שרירים, בהתאמה.

1. דגירה של ארבעה חלקים לכל באר עם 1.5 מ"ל של 0.1 M PB המכילים 75 μL של 10% Triton X-100 (0.5%) ו-45 μL של סרום חמור רגיל (3%) על שייקר מסלולי ב-20 סל"ד למשך 30 דקות.
2. מעבירים את החלקים ל-1.5 מ"ל של תמיסה מעורבת של נוגדנים ראשוניים המכילים אנטי-NF200 ארנב (1:1,000), אנטי-VAChT עזים (1:500) ב-0.1 M PB (pH 7.4) עם 1% סרום חמורים רגיל, ו-0.5% טריטון X-100, ודגירה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את הקטעים 3x למשך 5 דקות כל אחד ב-0.1 M PB (pH 7.4) על שייקר מסלולי ב-20 סל"ד.
3. דגירו את החלקים ב-1.5 מ"ל של תמיסה מעורבת של נוגדנים משניים המכילים חמור נגד ארנב AF488 (1:500) ונגד חמורים AF546 (1:500), כמו גם את הסמנים הביולוגיים של α-BTX, AF647 (1:500) ופאלואידין 350 (1:500) ב-0.1 M PB (pH 7.4) המכיל 1% סרום חמורים רגיל ו-0.5% טריטון X-100 למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. הגן מפני אור.
4. לאחר שטיפה של 3x במשך 5 דקות כל אחד ב-0.1 M PB (pH 7.4), הרכיבו את החלקים על שקופיות מיקרוסקופ. יש למרוח זכוכית כיסוי על החלקים באמצעות 50% גליצרין במים מזוקקים לתצפית.

5. צביעה פלואורסצנטית מרובה עם NF200, S100, α-BTX ו-DAPI

הערה: ההליכים דומים לאלה של שלב 4; ההבדל העיקרי הוא בין הנוגדנים הראשוניים לבין הנוגדנים המשניים המתאימים להם.

1. השתמש בנוגדנים העיקריים הבאים: נגד עוף נגד NF200 (1:6,000), אנטי-S100 ארנב (1:2,500) בשלב 4.2 והנוגדנים המשניים המתאימים להם: חמור נגד עוף AF488 (1:500) וחמור נגד ארנב AF546 (1:500), כמו גם הסמנים הביולוגיים של α-BTX AF647 (1:500) ו- DAPI (1:50000) בשלב 4.3.

6. תצפית וניתוח

1. צפו בדגימה וצלמו תמונות באמצעות מערכת הדמיה קונפוקלית המצוידת בעדשות האובייקטיביות הבאות: עדשת 20x עם עדשת NA של 0.75 ו-40x עם NA של 0.95.
2. השתמש באורכי גל של עירור ופליטה של 350 ננומטר (Pha), 488 ננומטר (NF200), 546 ננומטר (VAChT ו- S100), 647 ננומטר (α-BTX), או DAPI המתאים לצביעה הפלואורסצנטית המרובה. הגדר את הרזולוציה של לכידת תמונה ל- 640 x 640 פיקסלים.
   הערה: הרזולוציה של 640 x 640 פיקסלים נבחרה מכיוון שהתמונות צולמו בערימות Z. רזולוציה של 1024 x 1024 פיקסלים גורמת להדמיה איטית ולהלבנת תמונות בערימות Z.
3. הגדר את מישור המוקד ההתחלתי ואת מישור המוקד הסופי. הגדר את גודל הצעד ל- 1 μm או 2 μm. בחר תבנית עומק, לכידת תמונה וסדרת Z.
4. עבור תמונות ההגדלה התחתונה שצולמו ב-20x, צלם 40 תמונות (Z-stacks) בגודל צעד של 2 מיקרומטר מכל מקטע בעובי 80 מיקרומטר באמצעות חור סיכה של 105 מיקרומטר. בחר את מצב ההקרנה/טופוגרפיה ואת הקרנת העוצמה מעל ציר Z כדי לשלב את כל התמונות במוקד יחיד.
5. עבור תמונות ההגדלה הגבוהה יותר שצולמו ב-40x, צלם 80 תמונות (Z-stacks) בגודל צעד של 1 מיקרומטר מכל מקטע בעובי 80 מיקרומטר עם זום המוגדר ל-2 וחור סיכה של 105 מיקרומטר. שלב את כל התמונות במוקד אחד.
6. שחזר את התמונות בתבנית התלת-ממדית באמצעות מערכת עיבוד התמונה כפי שתואר קודם לכן^ב-27.

תוצאות

לאחר צביעה פלואורסצנטית מרובה, התווית המתאימה הודגמה בצורה מסודרת על החלקים בעובי של 80 מיקרומטר של שריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי של החולדה עם סיבי עצב חיוביים ל-NF200, מסופים קדם-סינפטיים חיוביים ל-VAChT, AchRs פוסט-סינפטיים חיוביים α-BTX, PSCs חיוביים ל-S100, סיבי שרירים חיוביים לפאלואידין וגרעיני תאים המ...

Discussion

תיארנו את הפרטים הטכניים הנדרשים לביצוע צביעה מרובה מוצלחת של פרוסות שרירים ושימוש באימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית לחשיפת המאפיינים המורפולוגיים של NMJ על החלקים העבים של שריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי של החולדה. על ידי שימוש בגישה זו, ניתן לנתח ולהעריך את הפרטים הקטנים והמתאם המרחבי של ה-PSCs ו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	ThermoFisher	D3571
Confocal laser scanning microscope	Olympus	FV1200
Donkey anti-chicken AF488	Jackson	149973 (703-545-155)
Donkey anti-goat AF546	ThermoFisher	A11056
Donkey anti-rabbit AF488	ThermoFisher	A21206
Donkey anti-rabbit AF546	ThermoFisher	A10040
Frozen Section Medium	ThermoFisher	Neg-50	Colorless
Microscope cover glass	Citotest	10212450C
Microtome	Yamato	REM-710
Neurofilament 200	Sigma-Aldrich	N4142	Rabbit
Neurofilament 200	Abcam	ab4680	Chicken
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-12	10 ml
Normal saline	Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd	H37022750	250 ml
Paraformaldehyde	Macklin	P804536	500g
Phalloidin AF350	ThermoFisher	A22281
Precision peristaltic pump	Longer	BT100-2J
S100-β	Abcam	ab52642	Rabbit
Sodium phosphate dbasic dodecahydrate	Macklin	S818118	500g
Sodium phosphate monobasic dihydrate	Macklin	S817463	500g
Sucrose	Macklin	S818046	500g
Superfrost plus microscope slides	ThermoFisher	4951PLUS-001E
Triton X-100	Solarbio Life Sciences	9002-93-1	100 ml
Vesicular Acetylcholine Transporter	Milipore	ANB100	Goat
α-bungarotoxin AF647 conjugate	ThermoFisher	B35450