JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Протокол показывает метод изучения пространственной корреляции между пресинаптическими терминалами, постсинаптическими рецепторами и перисинаптическими шванновскими клетками в медиальной икроножной мышце крыс с использованием флуоресцентной иммуногистохимии с различными биомаркерами, а именно нейрофиламентом 200, везикулярным транспортером ацетилхолина, альфа-бунгаротоксином и S100.

Аннотация

Нервно-мышечное соединение (NMJ) представляет собой сложную структуру, служащую для передачи сигнала от двигательного нейрона к скелетной мышце, и состоит из трех основных гистологических компонентов: пресинаптических моторных аксонных терминалов, постсинаптических никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (AchRs) и перисинаптических шванновских клеток (PSC). Чтобы продемонстрировать морфологические характеристики NMJ, медиальную икроножную мышцу крысы выбирали в качестве ткани-мишени и исследовали с использованием множественного флуоресцентного окрашивания различными видами биомаркеров, включая нейрофиламент 200 (NF200) и везикулярный транспортер ацетилхолина (VAChT) для двигательных нервных волокон и их пресинаптических терминалей, альфа-бунгаротоксин (α-BTX) для постсинаптических никотиновых AchRs, и S100 для ЦОНов. В этом исследовании окрашивание проводилось в двух группах: в первой группе образцы окрашивали NF200, VAChT и α-BTX, а во второй группе образцы окрашивали NF200, α-BTX и S100. Было показано, что оба протокола могут эффективно продемонстрировать детальную структуру NMJ. С помощью конфокального микроскопа были просмотрены морфологические характеристики пресинаптических терминалей, постсинаптических рецепторов и PSC, а их изображения Z-стеков были реконструированы в трехмерном виде для дальнейшего анализа пространственной корреляции между различными маркировками. С точки зрения методологии, эти протоколы обеспечивают ценный справочник для исследования морфологических характеристик NMJ в физиологических условиях, которые также могут быть подходящими для оценки патологического изменения NMJ, такого как повреждение периферических нервов и регенерация.

Введение

В качестве трех основных структурных компонентов нервно-мышечного соединения (NMJ)1,2,3,4 широко исследованы морфологические аспекты пресинаптических моторных терминалей аксонов, постсинаптическая мембрана, содержащая никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (AchRs), и перисинаптические шванновские клетки (PSC). Тонкие срезы и цельные образцы скелетных мышц были исследованы с помощью различных гистологических методов, таких как электронная микроскопия 5,6, конфокальная микроскопия 7,8 и микроскопия светового листа 9,10. Хотя морфологические характеристики NMJ были продемонстрированы этими методами с разных сторон, для сравнения, конфокальная микроскопия по-прежнему является идеальным выбором для визуализации подробной морфологии NMJ.

В последнее время было разработано много новых технологий для демонстрации структурных компонентов NMJ. Например, трансгенные флуоресцентные мыши thy1-YFP были непосредственно использованы для наблюдения моторных аксонов и концевых пластин двигателя in vivo и in vitro10,11. Кроме того, внутривенная инъекция флуоресцентных α-BTX была применена для выявления пространственного распределения моторных концевых пластин в цельномонтных скелетных мышцах диких и трансгенных флуоресцентных мышей с использованием оптического очистителя тканей для обследования с помощью микроскопии светового листа 9,12. Однако, помимо пре- и постсинаптических элементов, которые могут быть просмотрены этими передовыми методами, PSC не могут быть продемонстрированы одновременно.

Накопленные данные свидетельствуют о том, что PSC, как периферические глиальные клетки, тесно связаны с пресинаптическими терминалями, способствующими развитию и стабильности NMJ, модуляции синаптической активности NMJ в физиологическом состоянии и регенерации NMJ после повреждения нерва 13,14,15 . Учитывая клеточную архитектуру NMJ, этот протокол является подходящим кандидатом для одновременной маркировки PSC, пре- и постсинаптических элементов и потенциально используется для оценки целостности и пластичности NMJ в нормальных и патологических условиях. Например, сравните интенсивность НМЮ, морфологию и объем постсинаптических двигательных концевых пластин, иннервацию и денервацию НМЮ, а также количество ПСК в мышцах физиологического и патологического статуса.

Икроножная мышца является самой большой мышцей, образующей выпуклость в икре, которая легко рассекается путем удаления кожи и мышцы бицепса бедра из конечности. Мышца часто выбирается для оценки мышечной атрофии, нервно-мышечной дегенерации, мышечной производительности и силы двигательной единицы ex vivo или in vivo 16,17,18. Тем не менее, методика также подходит для выявления морфологических характеристик NMJ из различных скелетных мышц. В то же время толстые мышечные участки могут выявить более полную морфологию и количество NMJ по сравнению с тонкими срезами 7,8 и дразнящими мышечными волокнами19.

В соответствии с этими исследованиями медиальная икроножная мышца крысы была выбрана в качестве ткани-мишени в этом исследовании и была разрезана на толщину 80 мкм для многократного флуоресцентного окрашивания различными видами биомаркеров в соответствии со структурными компонентами NMJ. Здесь нейрофиламент 200 (NF200)20,21, везикулярный транспортер ацетилхолина (VAChT)22, альфа-бунгаротоксин (α-BTX)23,24 и S10025,26 использовались для маркировки нервных волокон, пресинаптических окончаний, постсинаптических АхР и PSC соответственно. Кроме того, фон мышечной ткани и клеточных ядер был дополнительно уравновешен фаллоидином и DAPI.

В этом исследовании мы ожидаем разработать усовершенствованный протокол одновременного окрашивания клеточной архитектуры NMJ соответствующими биомаркерами на более толстых фиксированных образцах, что более удобно для использования в конфокальной микроскопии и помогает получить гораздо больше информации о детальной структуре PSC, пре- и постсинаптических элементах, а также их пространственной корреляции друг с другом. С точки зрения методологии, этот протокол может быть полезен для оценки морфологических характеристик NMJ при нормальных и патологических состояниях.

протокол

Данное исследование было одобрено Комитетом по этике Института иглоукалывания и прижигания Китайской академии китайских медицинских наук (одобрение No 2021-04-15-1). Все процедуры проводились в соответствии с Руководством национальных институтов здравоохранения по уходу за лабораторными животными и их использованию (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Использовались три взрослых самца крыс (Sprague-Dawley, вес 230 ± 15 г). Крысы были размещены в 12-часовом цикле света / темноты с контролируемой температурой и влажностью и со свободным доступом к пище и воде. Инструменты и материалы для этого исследования показаны на рисунке 1.

1. Перфузия

  1. Вводят 250 мг/кг раствора трибромэтанола внутрибрюшинно, чтобы вызвать эвтаназию крыс.
  2. Как только дыхание остановится, откройте грудную полость для доступа к сердцу с помощью ножниц и щипцов. Вставьте внутривенный катетер из левого сердечного желудочка в сторону аорты, а затем разрезайте правую ушную раковину.
  3. Перфьюируйте подопытных крыс в капюшоне. Начните с перфузии 100 мл 0,9% нормального физиологического раствора до тех пор, пока кровь, выходящая из правой ушной раковины, не станет чистой, затем продолжайте перфузию 250-300 мл 4% параформальдегида в 0,1 М фосфатного буфера (ПБ, рН 7,4) в течение примерно 10 мин, пока хвост не будет трудно согнуть.

2. Региональная анатомия

  1. После перфузии удаляют кожу двусторонней задней конечности с помощью хирургического лезвия (рисунок 2А) и обнажают двусторонний седалищный нерв и медиальную икроножную мышцу (рисунок 2В).
  2. Тщательно рассекните двустороннюю медиальную икроножную мышцу от задней конечности с помощью лопасти (рисунок 2С) и постфиксируйте всю мышцу в 10 мл 4% параформальдегида в 0,1 М ПБ в течение 2 ч.
  3. Извлекают мышцу из раствора и криопротегируют мышцу в 10 мл 25% сахарозы в 0,1 М ПБ в течение 1 дня при 4 °С до полного погружения мышцы в раствор.

3. Криосечение мышц

  1. Как только мышечная ткань погружена в раствор, зафиксируйте ее на стадии замораживания скользящей микротомовой системы с использованием замороженной среды сечения. Разрезайте мышцу горизонтально вдоль длинной оси мышцы толщиной 80 мкм.
  2. Поместите семь криосекреций на скважину упорядоченным образом в шестилуночную культуральную пластину с 10 мл 0,1 М ПБ (рН 7,4) с помощью щетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Секции расположены таким образом, чтобы секции в разных скважинах были смежными, что делает секции, используемые для разных пятен, более последовательными.

4. Множественное флуоресцентное окрашивание с NF200, VAChT, α-BTX и Pha

ПРИМЕЧАНИЕ: Множественное флуоресцентное окрашивание с помощью NF200, VAChT, α-BTX и Pha было применено для выявления нервных волокон, пресинаптических окончаний, постсинаптических никотиновых ацетилхолиновых рецепторов и мышечных волокон соответственно.

  1. Инкубировать четыре секции на лунку с 1,5 мл 0,1 М ПБ, содержащей 75 мкл 10% тритона X-100 (0,5%) и 45 мкл нормальной ослиной сыворотки (3%), на орбитальном шейкере при 20 об/мин в течение 30 мин.
  2. Переложить срезы в 1,5 мл смешанного раствора первичных антител, содержащих кролика анти-NF200 (1:1000), козий анти-ВАХТ (1:500) в 0,1 М ПБ (рН 7,4) с 1% нормальной ослиной сывороткой и 0,5% Тритоном Х-100, и инкубировать в течение ночи при 4 °С. На следующий день промывайте секции 3x в течение 5 мин каждая в 0,1 М ПБ (рН 7,4) на орбитальном шейкере при 20 об/мин.
  3. Инкубируют срезы в 1,5 мл смешанного раствора вторичных антител, содержащих ослиный антизаябличий AF488 (1:500) и ослиный антикозеляный AF546 (1:500), а также биомаркеры α-BTX, AF647 (1:500) и фаллоидин 350 (1:500) в 0,1 М ПБ (рН 7,4), содержащие 1% нормальной ослиной сыворотки и 0,5% тритона Х-100 в течение 1 ч при комнатной температуре. Защита от света.
  4. После промывки 3x в течение 5 мин каждая в 0,1 М ПБ (рН 7,4) установите секции на предметные стекла микроскопа. Нанесите покровное стекло на секции, используя 50% глицерина в дистиллированной воде для наблюдения.

5. Многократное флуоресцентное окрашивание с NF200, S100, α-BTX и DAPI

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры аналогичны процедурам, описанным на этапе 4; основное различие заключается в том, что первичные антитела и соответствующие им вторичные антитела.

  1. Используйте следующие первичные антитела: куриный анти-NF200 (1:6,000), кролик анти-S100 (1:2,500) на шаге 4.2 и соответствующие им вторичные антитела: ослиный анти-курица AF488 (1:500) и ослик против кролика AF546 (1:500), а также биомаркеры α-BTX AF647 (1:500) и DAPI (1:50000) на шаге 4.3.

6. Наблюдение и анализ

  1. Наблюдайте за образцом и делайте снимки с помощью конфокальной системы визуализации, оснащенной следующими объективами: 20-кратный объектив с NA 0,75 и 40-кратный объектив с NA 0,95.
  2. Используйте длины волн возбуждения и излучения 350 нм (Pha), 488 нм (NF200), 546 нм (VAChT и S100), 647 нм (α-BTX) или DAPI, соответствующие множественному флуоресцентному окрашиванию. Установите разрешение захвата изображения равным 640 x 640 пикселей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разрешение 640 x 640 пикселей выбрано потому, что изображения были сняты в Z-стеках. Разрешение 1024 x 1024 пикселей приводит к медленному изображению и фотоотбеливанию в Z-стеках.
  3. Установите начальную фокальную плоскость и конечную фокальную плоскость. Установите размер шага равным 1 мкм или 2 мкм. Выберите шаблон глубины, захват изображения и серию Z.
  4. Для изображений с меньшим увеличением, сделанных в 20 раз, захватите 40 изображений (Z-стеков) с шагом 2 мкм с каждого участка толщиной 80 мкм с помощью точечного отверстия 105 мкм. Выберите режим проекции/топографии и интенсивность проекции по оси Z, чтобы интегрировать все изображения в один фокус.
  5. Для изображений с более высоким увеличением, сделанных в 40 раз, захватывайте 80 изображений (Z-стеки) с шагом 1 мкм с каждого участка толщиной 80 мкм с зумом, установленным на 2, и точечным отверстием 105 мкм. Интегрируйте все изображения в один фокус.
  6. Реконструируйте изображения в трехмерном шаблоне с помощью системы обработки изображений, как описано ранее в27.

Результаты

После многократного флуоресцентного окрашивания соответствующая маркировка была упорядоченно продемонстрирована на участках медиальной икроножной мышцы крыс толщиной 80 мкм с NF200-положительными нервными волокнами, VAChT-положительными пресинаптическими терминалями, α-BTX-положительны...

Обсуждение

Описаны технические детали, необходимые для успешного многократного окрашивания мышечных срезов и использования флуоресцентной иммуногистохимии для выявления морфологических характеристик NMJ на толстых участках медиальной икроножной мышцы крысы. Используя этот подход, мелкие дета...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Это исследование финансировалось Инновационным фондом CACMS (No. CI2021A03407), Национальный фонд естественных наук Китая (No 82004299) и Фонды фундаментальных исследований для Центральных научно-исследовательских институтов общественного благосостояния (No. ZZ13-YQ-068; ZZ14-YQ-032; ZZ14-YQ-034; ZZ201914001; ZZ202017006; ZZ202017015).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochlorideThermoFisherD3571
Confocal laser scanning microscopeOlympusFV1200
Donkey anti-chicken AF488Jackson149973 (703-545-155)
Donkey anti-goat AF546ThermoFisherA11056
Donkey anti-rabbit AF488ThermoFisherA21206
Donkey anti-rabbit AF546ThermoFisherA10040
Frozen Section MediumThermoFisherNeg-50Colorless
Microscope cover glassCitotest10212450C
MicrotomeYamatoREM-710
Neurofilament 200Sigma-AldrichN4142Rabbit
Neurofilament 200Abcamab4680Chicken
Normal donkey serumJackson ImmunoResearch Laboratories017-000-1210 ml
Normal salineShandong Hualu Pharmaceutical Co.LtdH37022750250 ml
ParaformaldehydeMacklinP804536500g
Phalloidin AF350ThermoFisherA22281
Precision peristaltic pumpLongerBT100-2J
S100-βAbcamab52642Rabbit
Sodium phosphate dbasic dodecahydrateMacklinS818118500g
Sodium phosphate monobasic dihydrateMacklinS817463500g
SucroseMacklinS818046500g
Superfrost plus microscope slidesThermoFisher4951PLUS-001E
Triton X-100Solarbio Life Sciences9002-93-1100 ml
Vesicular Acetylcholine TransporterMiliporeANB100Goat
α-bungarotoxin AF647 conjugateThermoFisherB35450

Ссылки

  1. Kawabuchi, M., et al. The spatiotemporal relationship among Schwann cells, axons and postsynaptic acetylcholine receptor regions during muscle reinnervation in aged rats. TheAnatomical Record. 264 (2), 183-202 (2001).
  2. Nishimune, H., Shigemoto, K. Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease. Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).
  3. Guarino, S. R., Canciani, A., Forneris, F. Dissecting the extracellular complexity of neuromuscular junction organizers. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 156 (2020).
  4. Cruz, P. M. R., Cossins, J., Beeson, D., Vincent, A. The neuromuscular junction in health and disease: molecular mechanisms governing synaptic formation and homeostasis. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 610964 (2020).
  5. Matthews-Bellinger, J., Salpeter, M. Fine structural distribution of acetylcholine receptors at developing mouse neuromuscular junctions. The Journal of Neuroscienc : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 3 (3), 644-657 (1983).
  6. Desaki, J., Uehara, Y. Formation and maturation of subneural apparatuses at neuromuscular junctions in postnatal rats: a scanning and transmission electron microscopical study. Developmental Biology. 119 (2), 390-401 (1987).
  7. Marques, M., Santo Neto, H. Imaging neuromuscular junctions by confocal fluorescence microscopy: individual endplates seen in whole muscles with vital intracellular staining of the nerve terminals. Journal of Anatomy. 192, 425-430 (1998).
  8. Magill, C. K., et al. Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: a confocal microscopic study in transgenic mice. Experimental Neurology. 207 (1), 64-74 (2007).
  9. Yin, X., et al. Spatial distribution of motor endplates and its adaptive change in skeletal muscle. Theranostics. 9 (3), 734-746 (2019).
  10. Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
  11. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  12. Chen, W. T., et al. In vivo injection of -bungarotoxin to improve the efficiency of motor endplate labeling. Brain and Behavior. 6 (6), 00468 (2016).
  13. Sugiura, Y., Lin, W. Neuron-glia interactions: the roles of Schwann cells in neuromuscular synapse formation and function. Bioscience Reports. 31 (5), 295-302 (2011).
  14. Alvarez-Suarez, P., Gawor, M., Proszynski, T. J. Perisynaptic schwann cells - The multitasking cells at the developing neuromuscular junctions. Seminars in Cell & Developmental Biology. 104, 31-38 (2020).
  15. Walker, C. L. Progress in perisynaptic Schwann cell and neuromuscular junction research. Neural Regeneration Research. 17 (6), 1273-1274 (2022).
  16. Michaud, M., et al. Neuromuscular defects and breathing disorders in a new mouse model of spinal muscular atrophy. Neurobiology of Disease. 38 (1), 125-135 (2010).
  17. Sharma, S., et al. Heat-induced endoplasmic reticulum stress in soleus and gastrocnemius muscles and differential response to UPR pathway in rats. Cell Stress Chaperones. 26 (2), 323-339 (2021).
  18. Raikova, R., Celichowski, J., Angelova, S., Krutki, P. A model of the rat medial gastrocnemius muscle based on inputs to motoneurons and on an algorithm for prediction of the motor unit force. Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1973-1987 (2018).
  19. Marinello, M., et al. Characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (178), e63032 (2021).
  20. Perrot, R., Berges, R., Bocquet, A., Eyer, J. Review of the multiple aspects of neurofilament functions, and their possible contribution to neurodegeneration. Molecular Neurobiology. 38 (1), 27-65 (2008).
  21. Yuan, A., Rao, M. V., Nixon, R. A. Neurofilaments and neurofilament proteins in health and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), 018309 (2017).
  22. Petrov, K. A., Proskurina, S. E., Krejci, E. Cholinesterases in tripartite neuromuscular synapse. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 811220 (2021).
  23. Karlin, A. Emerging structure of the nicotinic acetylcholine receptors. Nature Reviews. Neuroscience. 3 (2), 102-114 (2002).
  24. Rudolf, R., Straka, T. Nicotinic acetylcholine receptor at vertebrate motor endplates: Endocytosis, recycling, and degradation. Neuroscience Letters. 711, 134434 (2019).
  25. Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. C., Mei, L. Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).
  26. Kang, H., Tian, L., Thompson, W. J. Schwann cell guidance of nerve growth between synaptic sites explains changes in the pattern of muscle innervation and remodeling of synaptic sites following peripheral nerve injuries. Journal of Comparative Neurology. 527 (8), 1388-1400 (2019).
  27. Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
  28. Hughes, B. W., Kusner, L. L., Kaminski, H. J. Molecular architecture of the neuromuscular junction. Muscle Nerve. 33 (4), 445-461 (2006).
  29. Boehm, I., et al. Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction. Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

183

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены