Visualiser les caractéristiques morphologiques de la jonction neuromusculaire dans le muscle gastrocnémien médian du rat

Résumé

Le protocole montre une méthode pour examiner la corrélation spatiale entre les terminaux pré-synaptiques, les récepteurs post-synaptiques et les cellules de Schwann péri-synaptiques dans le muscle gastrocnémien médian du rat en utilisant l’immunohistochimie fluorescente avec différents biomarqueurs, à savoir le neurofilament 200, le transporteur vésiculeux d’acétylcholine, l’alpha-bungarotoxine et S100.

Résumé

La jonction neuromusculaire (NMJ) est une structure complexe servant à la communication du signal du motoneurone au muscle squelettique et se compose de trois composants histologiques essentiels: les terminaux axonals moteurs pré-synaptiques, les récepteurs nicotiniques post-synaptiques de l’acétylcholine (AchR) et les cellules de Schwann péri-synaptiques (PSC). Afin de démontrer les caractéristiques morphologiques de la NMJ, le muscle gastrocnémien médian du rat a été sélectionné comme tissu cible et examiné en utilisant de multiples colorations fluorescentes avec divers types de biomarqueurs, y compris le neurofilament 200 (NF200) et le transporteur vésiculaire de l’acétylcholine (VAChT) pour les fibres nerveuses motrices et leurs terminaux pré-synaptiques, l’alpha-bungarotoxine (α-BTX) pour les AchR nicotiniques post-synaptiques, et S100 pour les PSC. Dans cette étude, la coloration a été effectuée en deux groupes: dans le premier groupe, les échantillons ont été colorés avec NF200, VAChT et α-BTX, et dans le deuxième groupe, les échantillons ont été colorés avec NF200, α-BTX et S100. Il a été démontré que les deux protocoles peuvent démontrer efficacement la structure détaillée du NMJ. À l’aide du microscope confocal, les caractéristiques morphologiques des terminaux pré-synaptiques, des récepteurs post-synaptiques et de la CSP ont été observées, et leurs images Z-stacks ont été reconstruites selon un modèle tridimensionnel pour analyser davantage la corrélation spatiale entre les différents marquages. Du point de vue de la méthodologie, ces protocoles fournissent une référence précieuse pour étudier les caractéristiques morphologiques de la NMJ dans des conditions physiologiques, ce qui peut également convenir pour évaluer l’altération pathologique de la NMJ, telle que les lésions nerveuses périphériques et la régénération.

Introduction

En tant que trois composants structurels essentiels de la jonction neuromusculaire (NMJ)^1,2,3,4, les aspects morphologiques des terminaisons axonales motrices pré-synaptiques, la membrane post-synaptique contenant des récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine (AchR) et les cellules de Schwann péri-synaptiques (PSC) ont été largement étudiés. Des coupes minces et des échantillons entiers des muscles squelettiques ont été examinés avec différentes techniques histologiques, telles que la microscopie électronique ^5,6, la microscopie confocale ^7,8 et la microscopie à feuille de lumière ^9,10. Bien que les caractéristiques morphologiques de nmJ aient été démontrées par ces techniques sous différents aspects, à titre de comparaison, la microscopie confocale reste un choix idéal pour l’imagerie de la morphologie détaillée de NMJ.

Récemment, de nombreuses nouvelles technologies ont été développées pour montrer les composants structurels de NMJ. Par exemple, des souris fluorescentes transgéniques thy1-YFP ont été directement utilisées pour observer les axones moteurs et les plaques d’extrémité motrices in vivo et in vitro^10,11. De plus, l’injection intraveineuse de α-BTX fluorescent a été appliquée pour révéler la distribution spatiale des plaques d’extrémité du moteur dans les muscles squelettiques à monture entière de souris fluorescentes de type sauvage et transgéniques, en utilisant un traitement de nettoyage optique tissulaire pour l’examen par microscopie à feuille de lumière ^9,12. Cependant, outre les éléments pré- et post-synaptiques qui peuvent être vus par ces méthodes avancées, les PSC ne peuvent pas être démontrés en même temps.

L’accumulation de preuves indique que les CSP, en tant que cellules gliales périphériques, sont étroitement associées aux terminaux pré-synaptiques contribuant au développement et à la stabilité de la NMJ, à la modulation de l’activité synaptique de la NMJ dans l’état physiologique et à la régénération de la NMJ après une lésion nerveuse 13,14,15 . Compte tenu de l’architecture cellulaire de NMJ, ce protocole est un candidat approprié pour étiqueter simultanément les PSC, les éléments pré- et post-synaptiques, et est potentiellement utilisé pour évaluer l’intégrité et la plasticité du NMJ dans des conditions normales et pathologiques_. Par exemple, comparez l’intensité de la NMJ, la morphologie et le volume des plaques d’extrémité motrices post-synaptiques, l’innervation et la dénervation de la NMJ, et le nombre de PSC dans les muscles d’état physiologique et pathologique.

Le muscle gastrocnémien est le plus grand muscle formant le renflement dans le mollet, qui est facilement disséqué en enlevant la peau et le muscle biceps fémoris du membre. Le muscle est souvent choisi pour évaluer l’atrophie musculaire, la dégénérescence neuromusculaire, la performance musculaire et la force unitaire motrice ex vivo ou in vivo 16,17,18. Cependant, la technique est également appropriée pour révéler les caractéristiques morphologiques de NMJ de divers muscles squelettiques. Dans le même temps, les sections musculaires épaisses peuvent révéler une morphologie et une quantité plus complètes de NMJ par rapport aux sections minces ^7,8 et aux fibres musculaires taquinées¹⁹.

Conformément à ces études, le muscle gastrocnémien médian du rat a été sélectionné comme tissu cible dans cette étude et a été tranché à une épaisseur de 80 μm pour une coloration fluorescente multiple avec divers types de biomarqueurs en fonction des composants structurels de NMJ. Ici, le neurofilament 200 (NF200)^20,21, le transporteur vésiculeux de l’acétylcholine (VAChT)²², l’alpha-bungarotoxine (α-BTX)^23,24 et le S100 ^25,26 ont été utilisés pour marquer les fibres nerveuses, les terminaux pré-synaptiques, les AchR post-synaptiques et les PSC respectivement. En outre, le fond du tissu musculaire et des noyaux cellulaires a été contre-coloré avec de la phalloïdine et du DAPI.

Dans cette étude, nous prévoyons de développer un protocole affiné pour colorer simultanément l’architecture cellulaire de NMJ avec leurs biomarqueurs correspondants sur des échantillons fixes plus épais, ce qui est plus pratique pour une utilisation en microscopie confocale et aide à obtenir beaucoup plus d’informations sur la structure détaillée des PSC, les éléments pré- et post-synaptiques, ainsi que leur corrélation spatiale les uns avec les autres. Du point de vue de la méthodologie, ce protocole peut bénéficier d’évaluer les caractéristiques morphologiques de nmJ dans des conditions normales et pathologiques.

Protocole

Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’Institut d’acupuncture et de moxibustion de l’Académie chinoise des sciences médicales chinoises (approbation n ° 2021-04-15-1). Toutes les procédures ont été menées conformément au National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Trois rats mâles adultes (Sprague-Dawley, poids 230 ± 15 g) ont été utilisés. Les rats ont été logés dans un cycle lumière/obscurité de 12 h avec une température et une humidité contrôlées et un accès libre à la nourriture et à l’eau. Les instruments et le matériel pour cette étude sont présentés à la figure 1.

1. Perfusion

1. Injecter 250 mg/kg de solution de tribromoéthanol par voie intrapéritonéale pour induire l’euthanasie des rats.
2. Une fois la respiration arrêtée, ouvrez la cavité thoracique pour accéder au cœur à l’aide de ciseaux et de pinces. Insérez un cathéter intraveineux du ventricule cardiaque gauche vers l’aorte, puis coupez l’oreillette droite.
3. Perfuser les rats expérimentaux dans le capot. Commencez par perfuser avec 100 mL de solution saline normale à 0,9 % jusqu’à ce que le sang sortant de l’oreillette droite soit clair, puis continuez à perfuser avec 250-300 mL de paraformaldéhyde à 4 % dans un tampon phosphate de 0,1 M (PB, pH 7,4) pendant environ 10 min jusqu’à ce que la queue soit difficile à plier.

2. Anatomie régionale

1. Après perfusion, retirer la peau du membre postérieur bilatéral à l’aide d’une lame chirurgicale (figure 2A) et exposer le nerf sciatique bilatéral et le muscle gastrocnémien médian (figure 2B).
2. Disséquer soigneusement le muscle gastrocnémien médian bilatéral du membre postérieur à l’aide d’une lame (Figure 2C) et post-fixer l’ensemble du muscle dans 10 mL de paraformaldéhyde à 4% dans 0,1 M PB pendant 2 h.
3. Retirer le muscle de la solution et cryoprotéger le muscle dans 10 mL de saccharose à 25 % dans 0,1 M PB pendant 1 jour à 4 °C jusqu’à ce que le muscle soit complètement immergé dans la solution.

3. Cryosection du muscle

1. Une fois que le tissu musculaire est immergé dans la solution, fixez-le sur une étape de congélation d’un système de microtome coulissant en utilisant un milieu de section congelé. Trancher le muscle horizontalement le long du long axe du muscle à l’épaisseur de 80 μm.
2. Placez sept cryo-sections par puits de manière ordonnée dans une plaque de culture de six puits avec 10 mL de 0,1 M PB (pH 7,4) à l’aide d’une brosse.
   REMARQUE: Les sections sont placées dans l’ordre de sorte que les sections dans différents puits sont adjacentes, ce qui rend les sections utilisées pour différentes taches plus cohérentes.

4. Coloration fluorescente multiple avec NF200, VAChT, α-BTX et Pha

REMARQUE: Une coloration fluorescente multiple avec NF200, VAChT, α-BTX et Pha a été appliquée pour révéler les fibres nerveuses, les terminaux pré-synaptiques, les récepteurs nicotiniques post-synaptiques de l’acétylcholine et les fibres musculaires, respectivement.

1. Incuber quatre sections par puits avec 1,5 mL de 0,1 M PB contenant 75 μL de Triton X-100 à 10 % (0,5 %) et 45 μL de sérum d’âne normal (3 %) sur un agitateur orbital à 20 tr/min pendant 30 min.
2. Transférer les sections dans 1,5 mL de solution mixte d’anticorps primaires contenant de l’anti-NF200 de lapin (1:1 000), de l’anti-VAChT de chèvre (1:500) dans 0,1 M PB (pH 7,4) avec 1 % de sérum d’âne normal et 0,5 % de Triton X-100, et incuber toute la nuit à 4 °C. Le lendemain, lavez les sections 3x pendant 5 min chacune en 0,1 M PB (pH 7,4) sur un agitateur orbital à 20 tr/min.
3. Incuber les sections dans 1,5 mL de solution mélangée d’anticorps secondaires contenant de l’AF488 anti-lapin (1:500) et de l’AF546 anti-chèvre d’âne (1:500), ainsi que les biomarqueurs de l’α-BTX, de l’AF647 (1:500) et de la phalloïdine 350 (1:500) dans 0,1 M PB (pH 7,4) contenant 1 % de sérum d’âne normal et 0,5 % de Triton X-100 pendant 1 h à température ambiante. Protéger de la lumière.
4. Après avoir lavé 3x pendant 5 min chacune en 0,1 M PB (pH 7,4), montez les sections sur des lames de microscope. Appliquez du verre de couverture sur les sections en utilisant 50% de glycérine dans de l’eau distillée pour observation.

5. Coloration fluorescente multiple avec NF200, S100, α-BTX et DAPI

REMARQUE : Les procédures sont semblables à celles de l’étape 4; la principale différence est entre les anticorps primaires et leurs anticorps secondaires correspondants.

1. Utilisez les anticorps primaires suivants : anti-NF200 de poulet (1:6 000), anti-S100 de lapin (1:2 500) à l’étape 4.2 et leurs anticorps secondaires correspondants : AF488 anti-poulet d’âne (1:500) et AF546 anti-lapin d’âne (1:500), ainsi que les biomarqueurs de α-BTX AF647 (1:500) et DAPI (1:50000) à l’étape 4.3.

6. Observation et analyses

1. Observez l’échantillon et prenez des images à l’aide d’un système d’imagerie confocale équipé des objectifs suivants : objectif 20x avec NA de 0,75 et objectif 40x avec NA de 0,95.
2. Utilisez des longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 350 nm (Pha), 488 nm (NF200), 546 nm (VAChT et S100), 647 nm (α-BTX) ou DAPI correspondant à la coloration fluorescente multiple. Définissez la résolution de la capture d’image sur 640 x 640 pixels.
   REMARQUE: La résolution de 640 x 640 pixels est choisie car les images ont été capturées dans des piles Z. Une résolution de 1024 x 1024 pixels entraîne une imagerie lente et un photoblanchiment dans les piles Z.
3. Définissez le plan focal de début et le plan focal de fin. Définissez la taille des pas sur 1 μm ou 2 μm. Choisissez le motif de profondeur, la capture d’image et la série Z.
4. Pour les images à faible grossissement prises à 20x, capturez 40 images (piles Z) en taille de pas de 2 μm à partir de chaque section de 80 μm d’épaisseur à l’aide d’un sténopé de 105 μm. Choisissez le mode de projection/topographie et la projection d’intensité sur l’axe Z pour intégrer toutes les images dans une seule mise au point.
5. Pour les images à grossissement plus élevé prises à 40x, capturez 80 images (piles Z) en taille de pas de 1 μm à partir de chaque section de 80 μm d’épaisseur avec un zoom réglé sur 2 et un sténopé de 105 μm. Intégrez toutes les images dans un seul focus.
6. Reconstruisez les images dans le motif tridimensionnel avec le système de traitement d’image comme décrit précédemment dans²⁷.

Résultats

Après plusieurs colorations fluorescentes, le marquage correspondant a été démontré de manière ordonnée sur les sections de 80 μm d’épaisseur du muscle gastrocnémien médian du rat avec des fibres nerveuses NF200 positives, des terminaux pré-synaptiques VAChT positifs, des AchR post-synaptiques α-BTX-positifs, des CSP S100 positifs, des fibres musculaires positives à la phalloïdine et des noyaux cellulaires marqués DAPI (Figure 3 et Figure 4).

Discussion

Nous avons décrit les détails techniques nécessaires pour effectuer avec succès une coloration multiple des tranches musculaires et l’utilisation de l’immunohistochimie fluorescente pour révéler les caractéristiques morphologiques de la NMJ sur les sections épaisses du muscle gastrocnémien médian du rat. En utilisant cette approche, les détails fins et la corrélation spatiale des PSC et des éléments pré- et post-synaptiques peuvent être analysés et appréciés sous microscopie confocale, puis reconst...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	ThermoFisher	D3571
Confocal laser scanning microscope	Olympus	FV1200
Donkey anti-chicken AF488	Jackson	149973 (703-545-155)
Donkey anti-goat AF546	ThermoFisher	A11056
Donkey anti-rabbit AF488	ThermoFisher	A21206
Donkey anti-rabbit AF546	ThermoFisher	A10040
Frozen Section Medium	ThermoFisher	Neg-50	Colorless
Microscope cover glass	Citotest	10212450C
Microtome	Yamato	REM-710
Neurofilament 200	Sigma-Aldrich	N4142	Rabbit
Neurofilament 200	Abcam	ab4680	Chicken
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-12	10 ml
Normal saline	Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd	H37022750	250 ml
Paraformaldehyde	Macklin	P804536	500g
Phalloidin AF350	ThermoFisher	A22281
Precision peristaltic pump	Longer	BT100-2J
S100-β	Abcam	ab52642	Rabbit
Sodium phosphate dbasic dodecahydrate	Macklin	S818118	500g
Sodium phosphate monobasic dihydrate	Macklin	S817463	500g
Sucrose	Macklin	S818046	500g
Superfrost plus microscope slides	ThermoFisher	4951PLUS-001E
Triton X-100	Solarbio Life Sciences	9002-93-1	100 ml
Vesicular Acetylcholine Transporter	Milipore	ANB100	Goat
α-bungarotoxin AF647 conjugate	ThermoFisher	B35450