Visualizando as Características Morfológicas da Junção Neuromuscular no Músculo Gastrocnemius De Rato Medial

Resumo

O protocolo mostra um método para examinar a correlação espacial entre os terminais pré-sinápticos, receptores pós-sinápticos e células schwann peri-sinápticas no músculo gastrocnemius medial de ratos usando imunohistoquímica fluorescente com diferentes biomarcadores, ou seja, neurofilamento 200, transporte de acetilcholina vesicular, alfa-bungarotoxina e S100.

Resumo

A junção neuromuscular (NMJ) é uma estrutura complexa que serve para a comunicação do sinal do neurônio motor ao músculo esquelético e consiste em três componentes histológicos essenciais: os terminais de axônio motor pré-sináptico, receptores de acetrico nicotípico pós-sináptico (AchRs) e células schwann peri-sinápticas (PSCs). Para demonstrar as características morfológicas do NMJ, o músculo gastrocnemius medial de ratos foi selecionado como o tecido-alvo e examinado pelo uso de múltiplas manchas fluorescentes com vários tipos de biomarcadores, incluindo neurofilamento 200 (NF200) e transporte de acetilcolina vesicular (VAChT) para as fibras nervosas motoras e seus terminais pré-sinápticos, alfa-bungarotoxina (α-BTX) para os AchRs nicotípicos pós-sinápticos, e S100 para os PSCs. Neste estudo, a coloração foi realizada em dois grupos: no primeiro grupo, as amostras foram manchadas com NF200, VAChT e α-BTX, e no segundo grupo, as amostras foram manchadas com NF200, α-BTX e S100. Foi demonstrado que ambos os protocolos podem demonstrar efetivamente a estrutura detalhada do NMJ. Utilizando o microscópio confocal, características morfológicas dos terminais pré-sinápticos, receptores pós-sinápticos e PSC foram vistos, e suas imagens de pilhas Z foram reconstruídas em um padrão tridimensional para analisar melhor a correlação espacial entre as diferentes rotulagens. Na perspectiva da metodologia, esses protocolos fornecem uma referência valiosa para a investigação das características morfológicas do NMJ em condições fisiológicas, que também podem ser adequadas para avaliar a alteração patológica do NMJ, como lesão nervosa periférica e regeneração.

Introdução

Como três componentes estruturais essenciais da junção neuromuscular (NMJ)1,2,3,4, aspectos morfológicos dos terminais de axônio motor pré-sináptico, membrana pós-sináptica contendo receptores de acetilcolina nicotínica (AchRs) e células schwann peri-sinápticas (PSCs) têm sido amplamente investigadas. Seções finas e espécimes de montagem inteira dos músculos esqueléticos foram examinados com diferentes técnicas histológicas, como microscopia eletrônica ^5,6, microscopia confocal ^7,8 e microscopia de folha de luz ^9,10. Embora as características morfológicas do NMJ tenham sido demonstradas por essas técnicas de diferentes aspectos, como comparação, a microscopia confocal ainda é uma escolha ideal para a imagem da morfologia detalhada do NMJ.

Recentemente, muitas novas tecnologias foram desenvolvidas para mostrar os componentes estruturais do NMJ. Por exemplo, camundongos fluorescentes transgênicos thy1-YFP têm sido diretamente usados para observar axônios motores e placas finais motoras in vivo e in vitro ^10,11. Além disso, a injeção intravenosa de α-BTX fluorescente foi aplicada para revelar a distribuição espacial de placas finais motoras em músculos esqueléticos de tipo selvagem e fluorescentes transgênicos, utilizando tratamento de limpeza óptica de tecido para exame com microscopia de folha de luz ^9,12. No entanto, além dos elementos pré e pós-sinápticos que podem ser vistos por esses métodos avançados, os PSCs não podem ser demonstrados ao mesmo tempo.

O acúmulo de evidências indica que os PSCs, como as células gliais periféricas, estão intimamente associados aos terminais pré-sinápticos que contribuem para o desenvolvimento e estabilidade do NMJ, a modulação da atividade sináptica do NMJ sob a condição fisiológica e a regeneração do NMJ após lesão nervosa 13,14,15 . Considerando a arquitetura celular do NMJ, este protocolo é um candidato adequado para rotular simultaneamente os PSCs, elementos pré e pós-sinápticos, e é potencialmente usado para avaliar a integridade e plasticidade do NMJ em condições normais e patológicas_. Por exemplo, compare a intensidade do NMJ, morfologia e volume de placas finais motoras pós-sinápticas, inervação e denervação do NMJ, e número de PSCs em músculos de estado fisiológico e patológico.

O músculo gastrocnemius é o maior músculo formando a protuberância na panturrilha, que é facilmente dissecada pela remoção da pele e do músculo bíceps femoral do membro. O músculo é frequentemente escolhido para avaliar atrofia muscular, degeneração neuromuscular, desempenho muscular e força da unidade motora ex vivo ou in vivo 16,17,18. No entanto, a técnica também é adequada para revelar as características morfológicas do NMJ de vários músculos esqueléticos. Ao mesmo tempo, as seções musculares grossas podem revelar morfologia mais completa e quantidade de NMJ em comparação com as seções finas ^7,8 e as fibras musculares^{provocadas 19}.

De acordo com esses estudos, o músculo gastrocnemius medial de rato foi selecionado como o tecido-alvo neste estudo e foi fatiado com uma espessura de 80 μm para múltiplas manchas fluorescentes com vários tipos de biomarcadores de acordo com os componentes estruturais do NMJ. Aqui, neurofilamento 200 (NF200)^20,21, transporte de acetilcolina vesicular (VAChT)²², alfa-bungarotoxina (α-BTX)^23,24 e S100^25,26 foram usados para rotular fibras nervosas, terminais pré-sinápticos, AchRs pós-sinápticos e PSCs, respectivamente. Além disso, o fundo do tecido muscular e núcleos celulares foram ainda mais neutralizados com fálica e DAPI.

Neste estudo, esperamos desenvolver um protocolo refinado para coloração simultânea da arquitetura celular do NMJ com seus biomarcadores correspondentes em espécimes fixos mais espessos, o que é mais conveniente para uso em microscopia confocal e ajuda a obter muito mais informações sobre a estrutura detalhada dos PSCs, elementos pré e pós-sinápticos, bem como sua correlação espacial entre si. Na perspectiva da metodologia, esse protocolo pode beneficiar-se da avaliação das características morfológicas do NMJ em condições normais e patológicas.

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Instituto de Acupuntura e Moxibustion, Academia Chinesa de Ciências Médicas (aprovação nº 2021-04-15-1). Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Guia Nacional de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Foram utilizados três ratos machos adultos (Sprague-Dawley, peso 230 ± 15 g). Os ratos foram alojados em um ciclo claro/escuro de 12 horas com temperatura e umidade controladas e com livre acesso a alimentos e água. Os instrumentos e materiais deste estudo são mostrados na Figura 1.

1. Perfusão

1. Injete 250 mg/kg de solução de tribromoetanol intraperitoneal para induzir a eutanásia dos ratos.
2. Uma vez que a respiração pare, abra a cavidade torácica para acessar o coração usando tesouras e fórceps. Insira um cateter intravenoso do ventrículo cardíaco esquerdo em direção à aorta, e depois corte a aurícula direita.
3. Perfundam os ratos experimentais no capô. Comece perfumando com 100 mL de soro fisiológico normal de 0,9% até que o sangue que sai da aurícula direita esteja claro, depois continue perfumando com 250-300 mL de 4% de paraformaldeído em tampão fosfato de 0,1 M (PB, pH 7,4) por cerca de 10 min até que a cauda seja dura de dobrar.

2. Anatomia regional

1. Após a perfusão, remova a pele do membro traseiro bilateral usando uma lâmina cirúrgica (Figura 2A) e exponha o nervo ciático bilateral e o músculo gastrocnemius medial (Figura 2B).
2. Disseque o músculo gastrocnemius medial bilateral cuidadosamente do membro traseiro usando uma lâmina (Figura 2C) e pós-fixar todo o músculo em 10 mL de 4% de paraformaldeído em 0,1 M PB por 2 h.
3. Retire o músculo da solução e crioproteta o músculo em 10 mL de 25% de sacarose em 0,1 M PB por 1 dia a 4 °C até que o músculo esteja completamente imerso na solução.

3. Criosectioning do músculo

1. Uma vez que o tecido muscular esteja imerso na solução, fixe-o em um estágio de congelamento de um sistema de microtome deslizante usando meio de seção congelada. Corte o músculo horizontalmente ao longo do longo eixo do músculo na espessura de 80 μm.
2. Coloque sete crio-seções por poço de forma ordenada em uma placa de cultura de seis poços com 10 mL de 0,1 M PB (pH 7.4) usando um pincel.
   NOTA: As seções são colocadas em ordem para que as seções em diferentes poços sejam adjacentes, o que torna as seções usadas para diferentes manchas mais consistentes.

4. Coloração fluorescente múltipla com NF200, VAChT, α-BTX e Pha

NOTA: Foram aplicadas múltiplas manchas fluorescentes com NF200, VAChT, α-BTX e Pha para revelar as fibras nervosas, terminais pré-sinápticos, receptores de acetilcolina nicotípica pós-sináptica e fibras musculares, respectivamente.

1. Incubar quatro seções por poço com 1,5 mL de 0,1 M PB contendo 75 μL de 10% Triton X-100 (0,5%) e 45 μL de soro normal de burro (3%) em um agitador orbital a 20 rpm por 30 min.
2. Transfira as seções para 1,5 mL de solução mista de anticorpos primários contendo coelhinho anti-NF200 (1:1.000), anti-VAChT de cabra (1.500) em 0,1 M PB (pH 7.4) com soro de burro 1% normal, e 0,5% Triton X-100, e incubar durante a noite a 4 °C. No dia seguinte, lave as seções 3x por 5 min cada em 0,1 M PB (pH 7.4) em um agitador orbital a 20 rpm.
3. Incubar as seções em 1,5 mL de solução mista de anticorpos secundários contendo anti-coelho burro AF488 (1:500) e anti-cabra de burro AF546 (1:500), bem como os biomarcadores de α-BTX, AF647 (1:500) e faloidein 350 (1:500) em 0,1 M PB (pH 7.4) contendo 1% de soro de burro normal e 0,5% Triton X-100 para 1h em temperatura ambiente. Proteja-se contra a luz.
4. Depois de lavar 3x por 5 min cada em 0,1 M PB (pH 7.4), monte as seções em slides de microscópio. Aplique vidro de cobertura nas seções usando 50% de glicerina em água destilada para observação.

5. Coloração fluorescente múltipla com NF200, S100, α-BTX e DAPI

NOTA: Os procedimentos são semelhantes aos da etapa 4; a principal diferença é entre os anticorpos primários e seus anticorpos secundários correspondentes.

1. Use os seguintes anticorpos primários: frango anti-NF200 (1:6.000), coelhinho anti-S100 (1:2.500) na etapa 4.2 e seus anticorpos secundários correspondentes: anti-frango burro AF488 (1:2.500) na etapa 4.2 e seus anticorpos secundários correspondentes: anti-frango burro AF488 (1:1:2500) e anti-coelho burro AF546 (1:500), bem como os biomarcadores de α-BTX AF647 (1:500) e DAPI (1:50000) na etapa 4.3.

6. Observação e análises

1. Observe a amostra e tire imagens utilizando um sistema de imagem confocal equipado com as seguintes lentes objetivas: lente 20x com na de lente de 0,75 e 40x com NA de 0,95.
2. Use comprimentos de onda de excitação e emissão de 350 nm (Pha), 488 nm (NF200), 546 nm (VAChT e S100), 647 nm (α-BTX) ou DAPI correspondente à coloração fluorescente múltipla. Defina a resolução da captura de imagem para 640 x 640 pixels.
   NOTA: A resolução de 640 x 640 pixels é escolhida porque as imagens foram capturadas em pilhas Z. Uma resolução de 1024 x 1024 pixels resulta em imagens lentas e fotobleaching em pilhas Z.
3. Defina o plano focal de partida e o plano focal final. Defina o tamanho do passo para 1 μm ou 2 μm. Escolha padrão de profundidade, captura de imagem e série Z.
4. Para as imagens de ampliação inferior tiradas em 20x, capture 40 imagens (Z-stacks) em tamanho de passo de 2 μm de cada seção de 80 μm de espessura usando um pinhole de 105 μm. Escolha o modo de projeção/topografia e a projeção de intensidade sobre o eixo Z para integrar todas as imagens em um único foco.
5. Para as imagens de ampliação mais altas tiradas em 40x, capture 80 imagens (Z-stacks) em tamanho de passo de 1 μm de cada seção de 80 μm de espessura com zoom definido para 2 e um pinhole de 105 μm. Integre todas as imagens em um único foco.
6. Reconstrua as imagens no padrão tridimensional com o sistema de processamento de imagens como descrito anteriormente em²⁷.

Resultados

Após múltiplas manchas fluorescentes, a rotulagem correspondente foi demonstrada ordenadamente nas seções de 80 μm de espessura do músculo gastrocnemius medial do rato com fibras nervosas NF200-positivas, Terminais pré-sinápticos positivos do VAChT, α-BTX-positivos AchRs pós-sinápticos, PSCs S100 positivos, fibras musculares phalloidina-positivas e núcleos celulares rotulados por DAPI (Figura 3 e Figura 4).

Mostrou-se que ...

Discussão

Descrevemos os detalhes técnicos necessários para a realização de uma coloração múltipla bem sucedida de fatias musculares e o uso de imunohistoquímica fluorescente para revelar as características morfológicas do NMJ nas seções grossas do músculo gastrocnemius medial de ratos. Usando esta abordagem, os detalhes finos e correlação espacial dos PSCs e elementos pré e pós-sinápticos podem ser analisados e apreciados sob microscopia confocal, e reconstruídos em um padrão tridimensional. Aqui, vários tipo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	ThermoFisher	D3571
Confocal laser scanning microscope	Olympus	FV1200
Donkey anti-chicken AF488	Jackson	149973 (703-545-155)
Donkey anti-goat AF546	ThermoFisher	A11056
Donkey anti-rabbit AF488	ThermoFisher	A21206
Donkey anti-rabbit AF546	ThermoFisher	A10040
Frozen Section Medium	ThermoFisher	Neg-50	Colorless
Microscope cover glass	Citotest	10212450C
Microtome	Yamato	REM-710
Neurofilament 200	Sigma-Aldrich	N4142	Rabbit
Neurofilament 200	Abcam	ab4680	Chicken
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-12	10 ml
Normal saline	Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd	H37022750	250 ml
Paraformaldehyde	Macklin	P804536	500g
Phalloidin AF350	ThermoFisher	A22281
Precision peristaltic pump	Longer	BT100-2J
S100-β	Abcam	ab52642	Rabbit
Sodium phosphate dbasic dodecahydrate	Macklin	S818118	500g
Sodium phosphate monobasic dihydrate	Macklin	S817463	500g
Sucrose	Macklin	S818046	500g
Superfrost plus microscope slides	ThermoFisher	4951PLUS-001E
Triton X-100	Solarbio Life Sciences	9002-93-1	100 ml
Vesicular Acetylcholine Transporter	Milipore	ANB100	Goat
α-bungarotoxin AF647 conjugate	ThermoFisher	B35450