Visualisierung der morphologischen Eigenschaften der neuromuskulären Verbindung im Musculus atralis guestrocnemius medialis der Ratte

Zusammenfassung

Das Protokoll zeigt eine Methode zur Untersuchung der räumlichen Korrelation zwischen den präsynaptischen Terminals, postsynaptischen Rezeptoren und perisynaptischen Schwann-Zellen im medialen Gastrocnemius-Muskel der Ratte unter Verwendung der fluoreszierenden Immunhistochemie mit verschiedenen Biomarkern, nämlich Neurofilament 200, vesikulärem Acetylcholintransporter, Alpha-Bungarotoxin und S100.

Zusammenfassung

Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) ist eine komplexe Struktur, die für die Signalkommunikation vom Motoneuron zum Skelettmuskel dient und aus drei wesentlichen histologischen Komponenten besteht: den präsynaptischen motorischen Axonterminals, den postsynaptischen nikotinischen Acetylcholinrezeptoren (AchR) und den perisynaptischen Schwann-Zellen (PSCs). Um die morphologischen Eigenschaften von NMJ zu demonstrieren, wurde der Musculus gastrocnemius medialis der Ratte als Zielgewebe ausgewählt und unter Verwendung mehrerer fluoreszierender Färbung mit verschiedenen Arten von Biomarkern, einschließlich Neurofilament 200 (NF200) und vesikulärem Acetylcholintransporter (VAChT) für die motorischen Nervenfasern und ihre präsynaptischen Terminals, alpha-Bungarotoxin (α-BTX) für die postsynaptischen nikotinischen AchRs, und S100 für die PSCs. In dieser Studie wurde die Färbung in zwei Gruppen durchgeführt: In der ersten Gruppe wurden die Proben mit NF200, VAChT und α-BTX gefärbt, und in der zweiten Gruppe wurden die Proben mit NF200, α-BTX und S100 gefärbt. Es zeigte sich, dass beide Protokolle die detaillierte Struktur von NMJ effektiv demonstrieren können. Mit dem konfokalen Mikroskop wurden morphologische Eigenschaften der präsynaptischen Terminals, postsynaptischen Rezeptoren und PSC gesehen, und ihre Z-Stacks-Bilder wurden in einem dreidimensionalen Muster rekonstruiert, um die räumliche Korrelation zwischen den verschiedenen Markierungen weiter zu analysieren. Aus methodischer Sicht bieten diese Protokolle eine wertvolle Referenz für die Untersuchung der morphologischen Eigenschaften von NMJ unter physiologischen Bedingungen, die auch geeignet sein können, die pathologische Veränderung von NMJ, wie periphere Nervenverletzung und Regeneration, zu bewerten.

Einleitung

Als drei wesentliche strukturelle Komponenten der neuromuskulären Verbindung (NMJ)1,2,3,4 wurden morphologische Aspekte der präsynaptischen motorischen Axonterminals^, der postsynaptischen Membran mit nikotinischen Acetylcholinrezeptoren (AchR) und perisynaptischen Schwann-Zellen (PSCs) umfassend untersucht. Dünne Schnitte und Ganzkörperproben der Skelettmuskulatur wurden mit verschiedenen histologischen Techniken untersucht, wie Elektronenmikroskopie ^5,6, konfokale Mikroskopie^7,8 und Lichtblattmikroskopie ^9,10. Obwohl die morphologischen Eigenschaften von NMJ durch diese Techniken unter verschiedenen Aspekten nachgewiesen wurden, ist die konfokale Mikroskopie zum Vergleich immer noch eine ideale Wahl für die Bildgebung der detaillierten Morphologie von NMJ.

In letzter Zeit wurden viele neue Technologien entwickelt, um die strukturellen Komponenten von NMJ zu zeigen. Zum Beispiel wurden thy1-YFP-transgene fluoreszierende Mäuse direkt verwendet, um motorische Axone und motorische Endplatten in vivo und in vitro^10,11 zu beobachten. Darüber hinaus wurde die intravenöse Injektion von fluoreszierendem α-BTX angewendet, um die räumliche Verteilung der motorischen Endplatten in der gesamten Skelettmuskulatur von Wildtyp- und transgenen fluoreszierenden Mäusen aufzudecken, indem eine gewebeoptische Clearing-Behandlung zur Untersuchung mit Lichtblattmikroskopie ^9,12 verwendet^wurde. Abgesehen von den prä- und postsynaptischen Elementen, die mit diesen fortgeschrittenen Methoden betrachtet werden können, können die PSCs jedoch nicht gleichzeitig demonstriert werden.

Akkumulierende Beweise deuten darauf hin, dass PSCs als periphere Gliazellen eng mit den präsynaptischen Terminals verbunden sind, die zur Entwicklung und Stabilität von NMJ, zur Modulation der synaptischen Aktivität des NMJ unter physiologischen Bedingungen und zur Regeneration des NMJ nach Nervenverletzung beitragen^13,14,15 . In Anbetracht der zellulären Architektur von NMJ ist dieses Protokoll ein geeigneter Kandidat für die gleichzeitige Kennzeichnung der PSCs, prä- und postsynaptischen Elemente, und wird möglicherweise verwendet, um die Integrität und Plastizität des NMJ unter normalen und pathologischen Bedingungen zu bewerten_. Vergleichen Sie zum Beispiel die Intensität von NMJ, die Morphologie und das Volumen der postsynaptischen motorischen Endplatten, die Innervation und Denervierung von NMJ und die Anzahl der PSCs in Muskeln mit physiologischem und pathologischem Status.

Der Musculus gastrocnemius ist der größte Muskel, der die Ausbuchtung in der Wade bildet, die leicht durch Entfernen der Haut und des Bizeps femoris aus der Extremität herausgeschnitten werden kann. Der Muskel wird oft ausgewählt, um Muskelatrophie, neuromuskuläre Degeneration, Muskelleistung und motorische Einheit Kraft ex vivo oder in vivo^16,17,18 zu beurteilen. Die Technik eignet sich aber auch, um die morphologischen Eigenschaften von NMJ aus verschiedenen Skelettmuskeln aufzudecken. Gleichzeitig können die dicken Muskelabschnitte eine vollständigere Morphologie und Menge an NMJ im Vergleich zu dünnen Abschnitten ^7,8 und gehänselten Muskelfasern¹⁹ aufweisen.

In Übereinstimmung mit diesen Studien wurde der mediale Gastrocnemius-Muskel der Ratte als Zielgewebe in dieser Studie ausgewählt und in einer Dicke von 80 μm für die mehrfache fluoreszierende Färbung mit verschiedenen Arten von Biomarkern entsprechend den Strukturkomponenten von NMJ geschnitten. Hier wurden Neurofilament 200 (NF200)^20,21, vesikulärer Acetylcholintransporter (VAChT)22, Alpha-Bungarotoxin (α-BTX)^23,24 und S100^25,26 verwendet, um Nervenfasern^, präsynaptische Terminals, postsynaptische AchRs bzw. PSCs zu markieren. Darüber hinaus wurde der Hintergrund von Muskelgewebe und Zellkernen weiter mit Phalloidin und DAPI konterkariert.

In dieser Studie erwarten wir, ein verfeinertes Protokoll für die gleichzeitige Färbung der zellulären Architektur von NMJ mit ihren entsprechenden Biomarkern auf dickeren fixierten Proben zu entwickeln, das für den Einsatz in der konfokalen Mikroskopie bequemer ist und dazu beiträgt, viel mehr Informationen über die detaillierte Struktur der PSCs, prä- und postsynaptischen Elemente sowie deren räumliche Korrelation zueinander zu erhalten. Aus methodischer Sicht kann dieses Protokoll von Vorteil sein, um die morphologischen Eigenschaften von NMJ unter normalen und pathologischen Bedingungen zu bewerten.

Protokoll

Diese Studie wurde von der Ethikkommission des Instituts für Akupunktur und Moxibustion der China Academy of Chinese Medical Sciences genehmigt (Genehmigung Nr. 2021-04-15-1). Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996) durchgeführt. Drei erwachsene männliche Ratten (Sprague-Dawley, Gewicht 230 ± 15 g) wurden verwendet. Die Ratten wurden in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit und freiem Zugang zu Nahrung und Wasser untergebracht. Die Instrumente und Materialien für diese Studie sind in Abbildung 1 dargestellt.

1. Perfusion

1. Injizieren Sie 250 mg/kg Tribromethanollösung intraperitoneal, um die Euthanasie der Ratten zu induzieren.
2. Sobald die Atmung aufhört, öffnen Sie die Brusthöhle, um mit einer Schere und einer Pinzette auf das Herz zuzugreifen. Führen Sie einen intravenösen Katheter vom linken Herzventrikel in Richtung Aorta ein und schneiden Sie dann die rechte Ohrmuschel ab.
3. Durchbluten Sie die experimentellen Ratten in der Haube. Beginnen Sie mit der Perfusion mit 100 ml 0,9% normaler Kochsalzlösung, bis das Blut, das aus der rechten Ohrmuschel austritt, klar, und setzen Sie dann die Perfusion mit 250-300 ml 4% Paraformaldehyd in 0,1 m Phosphatpuffer (PB, pH 7,4) für etwa 10 Minuten fort, bis der Schwanz schwer zu biegen ist.

2. Regionale Anatomie

1. Entfernen Sie nach der Perfusion die Haut der beidseitigen Hintergliedmaße mit einer chirurgischen Klinge (Abbildung 2A) und legen Sie den beidseitigen Ischiasnerv und den Musculus gastrocnemius medialis frei (Abbildung 2B).
2. Sezieren Sie den beidseitigen medialen Gastrocnemius-Muskel vorsichtig von der Hinterextremität mit einer Klinge aus (Abbildung 2C) und fixieren Sie den gesamten Muskel in 10 ml 4% Paraformaldehyd in 0,1 M PB für 2 h.
3. Entfernen Sie den Muskel aus der Lösung und kryoschützen Sie den Muskel in 10 ml 25% Saccharose in 0,1 M PB für 1 Tag bei 4 ° C, bis der Muskel vollständig in die Lösung eingetaucht ist.

3. Kryosektion des Muskels

1. Sobald das Muskelgewebe in die Lösung eingetaucht ist, fixieren Sie es auf einem Gefriertisch eines gleitenden Mikrotomsystems mit gefrorenem Schnittmedium. Schneiden Sie den Muskel horizontal entlang der Längsachse des Muskels mit einer Dicke von 80 μm.
2. Sieben Kryoabschnitte pro Bohrung in geordneter Weise in eine Kulturplatte mit sechs Vertiefungen mit 10 ml 0,1 M PB (pH 7,4) mit einem Pinsel legen.
   HINWEIS: Die Abschnitte sind so angeordnet, dass die Abschnitte in verschiedenen Vertiefungen benachbart sind, wodurch die Abschnitte, die für verschiedene Flecken verwendet werden, konsistenter werden.

4. Multiple fluoreszierende Färbung mit NF200, VAChT, α-BTX und Pha

HINWEIS: Multiple fluoreszierende Färbung mit NF200, VAChT, α-BTX und Pha wurde angewendet, um die Nervenfasern, präsynaptischen Terminals, postsynaptischen nikotinischen Acetylcholinrezeptoren bzw. Muskelfasern aufzudecken.

1. Inkubieren Sie vier Abschnitte pro Bohrung mit 1,5 ml 0,1 M PB, die 75 μL 10% Triton X-100 (0,5%) und 45 μL normales Eselserum (3%) auf einem Orbitalshaker bei 20 U / min für 30 min.
2. Die Abschnitte werden in 1,5 ml Mischlösung aus primären Antikörpern mit Kaninchen-Anti-NF200 (1:1.000), Ziegen-Anti-VAChT (1:500) in 0,1 M PB (pH 7,4) mit 1% normalem Eselserum und 0,5% Triton X-100 überführt und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Waschen Sie die Abschnitte am nächsten Tag 3x für jeweils 5 min in 0,1 M PB (pH 7,4) auf einem Orbitalschüttler bei 20 U / min.
3. Inkubieren Sie die Abschnitte in 1,5 ml Mischlösung von sekundären Antikörpern, die Esel-Anti-Kaninchen-AF488 (1:500) und Esel-Anti-Ziegen-AF546 (1:500) enthalten, sowie die Biomarker von α-BTX, AF647 (1:500) und Phalloidin 350 (1:500) in 0,1 M PB (pH 7,4) enthaltend 1% normales Eselserum und 0,5% Triton X-100 für 1 h bei Raumtemperatur. Vor Licht schützen.
4. Nachdem Sie 3x für jeweils 5 min in 0,1 M PB (pH 7,4) gewaschen haben, montieren Sie die Abschnitte auf Objektträgern. Tragen Sie Deckglas auf die Abschnitte auf, indem Sie 50% Glycerin in destilliertem Wasser zur Beobachtung verwenden.

5. Mehrfachfluoreszierende Färbung mit NF200, S100, α-BTX und DAPI

HINWEIS: Die Verfahren ähneln denen von Schritt 4. Der Hauptunterschied besteht zwischen den primären Antikörpern und ihren entsprechenden sekundären Antikörpern.

1. Verwenden Sie die folgenden primären Antikörper: Hähnchen-Anti-NF200 (1:6.000), Kaninchen-Anti-S100 (1:2.500) in Schritt 4.2 und die entsprechenden sekundären Antikörper: Esel-Anti-Huhn-AF488 (1:500) und Esel-Anti-Kaninchen-AF546 (1:500) sowie die Biomarker von α-BTX AF647 (1:500) und DAPI (1:50000) in Schritt 4.3.

6. Beobachtung und Analysen

1. Beobachten Sie die Probe und nehmen Sie Bilder mit einem konfokalen Bildgebungssystem auf, das mit den folgenden Objektivlinsen ausgestattet ist: 20x Objektiv mit NA von 0,75 und 40x Objektiv mit NA von 0,95.
2. Verwenden Sie Anregungs- und Emissionswellenlängen von 350 nm (Pha), 488 nm (NF200), 546 nm (VAChT und S100), 647 nm (α-BTX) oder DAPI, die der mehrfachen Fluoreszenzfärbung entsprechen. Stellen Sie die Auflösung der Bildaufnahme auf 640 x 640 Pixel ein.
   HINWEIS: Die Auflösung von 640 x 640 Pixeln wird gewählt, da die Bilder in Z-Stacks aufgenommen wurden. Eine Auflösung von 1024 x 1024 Pixeln führt zu langsamer Bildgebung und Photobleiche in Z-Stacks.
3. Stellen Sie die Startfokalebene und die Endfokalebene ein. Stellen Sie die Schrittweite auf 1 μm oder 2 μm ein. Wählen Sie Tiefenmuster, Bilderfassung und Z-Serie.
4. Für die Bilder mit geringerer Vergrößerung, die mit 20x aufgenommen wurden, nehmen Sie 40 Bilder (Z-Stacks) in 2 μm Schrittgröße aus jedem 80 μm dicken Abschnitt mit einem 105 μm Loch auf. Wählen Sie den Projektions-/Topographiemodus und die Intensitätsprojektion über die Z-Achse, um alle Bilder in einem einzigen Infokus zu integrieren.
5. Für die Bilder mit höherer Vergrößerung, die mit 40x aufgenommen wurden, nehmen Sie 80 Bilder (Z-Stacks) in 1 μm Schrittgröße von jedem 80 μm dicken Schnitt mit Zoom auf 2 und einem 105 μm Pinhole auf. Integrieren Sie alle Bilder in einem einzigen Fokus.
6. Rekonstruieren Sie die Bilder im dreidimensionalen Muster mit dem Bildverarbeitungssystem wie zuvor in²⁷ beschrieben.

Ergebnisse

Nach mehrfacher fluoreszierender Färbung wurde die entsprechende Markierung geordnet auf den 80 μm dicken Abschnitten des medialen Gastrocnemius-Muskels der Ratte mit NF200-positiven Nervenfasern, VAChT-positiven präsynaptischen Terminals, α-BTX-positiven postsynaptischen AchRs, S100-positiven PSCs, phalloidin-positiven Muskelfasern und DAPI-markierten Zellkernen gezeigt (Abbildung 3 und Abbildung 4).

Es wurde gezeigt, dass NF200-...

Diskussion

Wir haben die technischen Details beschrieben, die für die Durchführung einer erfolgreichen Mehrfachfärbung von Muskelscheiben und die Verwendung der fluoreszierenden Immunhistochemie zur Aufdeckung der morphologischen Eigenschaften von NMJ an den dicken Abschnitten des medialen Gastrocnemius-Muskels der Ratte erforderlich sind. Mit diesem Ansatz können die feinen Details und die räumliche Korrelation der PSCs und prä- und postsynaptischen Elemente unter konfokaler Mikroskopie analysiert und geschätzt und in einem...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	ThermoFisher	D3571
Confocal laser scanning microscope	Olympus	FV1200
Donkey anti-chicken AF488	Jackson	149973 (703-545-155)
Donkey anti-goat AF546	ThermoFisher	A11056
Donkey anti-rabbit AF488	ThermoFisher	A21206
Donkey anti-rabbit AF546	ThermoFisher	A10040
Frozen Section Medium	ThermoFisher	Neg-50	Colorless
Microscope cover glass	Citotest	10212450C
Microtome	Yamato	REM-710
Neurofilament 200	Sigma-Aldrich	N4142	Rabbit
Neurofilament 200	Abcam	ab4680	Chicken
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-12	10 ml
Normal saline	Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd	H37022750	250 ml
Paraformaldehyde	Macklin	P804536	500g
Phalloidin AF350	ThermoFisher	A22281
Precision peristaltic pump	Longer	BT100-2J
S100-β	Abcam	ab52642	Rabbit
Sodium phosphate dbasic dodecahydrate	Macklin	S818118	500g
Sodium phosphate monobasic dihydrate	Macklin	S817463	500g
Sucrose	Macklin	S818046	500g
Superfrost plus microscope slides	ThermoFisher	4951PLUS-001E
Triton X-100	Solarbio Life Sciences	9002-93-1	100 ml
Vesicular Acetylcholine Transporter	Milipore	ANB100	Goat
α-bungarotoxin AF647 conjugate	ThermoFisher	B35450