Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השראת האוטופגיה בגוף השומן של הזחל Drosophila melanogaster באמצעות דלדול חומרי מזון ומנתח שינויים באוטופגיה באמצעות זני זבובים טרנסגניים.

Abstract

אוטופגיה היא תהליך של עיכול עצמי תאי. הוא מעביר מטען לליזוזומים לפירוק בתגובה ללחצים שונים, כולל רעב. תקלה של אוטופגיה קשורה להזדקנות ומחלות אנושיות מרובות. מנגנון האוטופגיה שמור מאוד - משמרים ועד בני אדם. גוף שומן הזחל של Drosophila melanogaster, אנלוגי לכבד חולייתנים ולרקמת שומן, מספק מודל ייחודי לניטור אוטופגיה in vivo. אוטופגיה יכולה להיגרם בקלות על ידי רעב תזונתי בגוף שומן הזחל. רוב הגנים הקשורים לאוטופגיה נשמרים בדרוזופילה. פותחו זנים רבים של זבובים טרנסגניים המבטאים סמני אוטופגיה מתויגים, המאפשרים ניטור של שלבים שונים בתהליך האוטופגיה. ניתוח השבטים מאפשר השוואה קרובה של סמני אוטופגיה בתאים בעלי גנוטיפים שונים באותה פיסת רקמה. הפרוטוקול הנוכחי מפרט נהלים עבור (1) יצירת שיבוטים סומטיים בגוף שומן הזחל, (2) גרימת אוטופגיה באמצעות רעב חומצות אמינו, ו-(3) ניתוח גוף שומן הזחל, במטרה ליצור מודל לניתוח הבדלים באוטופגיה באמצעות סמן אוטופגוזום (GFP-Atg8a) וניתוח שבטים.

Introduction

אוטופגיה היא תהליך "אכילה עצמית" המושרה על ידי לחצים שונים, כולל רעב חומצות אמינו1. מקרואוטופגיה (להלן אוטופגיה) היא הסוג הנחקר ביותר של אוטופגיה וממלאת תפקיד שאין לו תחליף בשמירה על הומאוסטזיס תאי2. תקלה של אוטופגיה קשורה למספר מחלות אנושיות3. בנוסף, חלק מהגנים הקשורים לאוטופגיה הם מטרות פוטנציאליות לטיפול במחלות שונות4.

אוטופגיה מוסדרת בצורה מתוחכמת ביותר5. בעת הרעב, קרומי הבידוד מבודדים חומרים ציטופלזמיים ליצירת אוטופגוזומים בעלי קרום כפול6. לאחר מכן אוטופגוזומים מתמזגים עם אנדוזומים וליזוזומים ליצירת אמפיזומים ואוטוליזוזומים. בעזרת אנזימים הידרוליטיים ליזוזומליים, התוכן הציטופלזמי שנבלע מתפרק, והחומרים המזינים ממוחזרים7.

אוטופגיה היא תהליך שימור אבולוציוני8. Drosophila melanogaster הוא מודל נהדר לחקר תהליך autophagy in vivo. רעב חומצות אמינו גורם בקלות לאוטופגיה ברקמת גוף שומן הזבובים, אנלוגיה של כבד אנושי ורקמת שומן9. פגמים באוטופגיה משבשים את דפוסי הפונקטה המובהקים של מספר חלבונים הקשורים לאוטופגיה, כגון Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 ו-p62, בין היתר10. לכן, ניתוח הדפוסים של סמני אוטופגיה אלה יסייע להבחין בהתרחשות של פגמים אוטופגיים ואת שלב אוטופגיה פגום. לדוגמה, החלבון דמוי האוביקוויטין Atg8 הוא סמן האוטופגיההנפוץ ביותר 11. ב- Drosophila melanogaster, זנים טרנסגניים עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המתויג Atg8a פותחו בהצלחה12. GFP-Atg8a מפוזר בציטוזול ובגרעינים בתאים המוזנים. לאחר הרעבה, GFP-Atg8a מעובד ושונה על ידי פוספטידיל-אתנולאמין (PE) ויוצר פונקטה, אשר מסמנת את קרומי הבידוד ואת האוטופגוזומים המפותחים במלואם13,14. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ישיר, ניתן לראות בקלות את השראת האוטופגיה כעלייה בהיווצרות GFP-Atg8 puncta15. Atg8a puncta לא ייווצר בתגובה לרעב בנוכחות פגם בהתחלת אוטופגיה. מכיוון ש-GFP-Atg8a יכול להיות מרווה-מעוכל על ידי ה-pH הנמוך באוטוליזוזומים, GFP-Atg8a puncta עשוי לעלות במספרים אם אוטופגיה נחסמת בשלבים מאוחרים16.

מכיוון שאוטופגיה רגישה מאוד לזמינות תזונתית17, הבדלים קלים בתנאי התרבית מובילים לעתים קרובות לשינויים בפנוטיפים. לכן, לאנליזה של שבטים, שיטה המנתחת תאים מוטנטיים לעומת תאי ביקורת מסוג בר באותה רקמה, יש יתרון גדול בניתוח פגמים אוטופגיים18. תוך ניצול של רקומבינציה ספציפית לאתר בתיווך FLPASE/FLPASE (FLP/FRT) בין כרומוזומים הומולוגיים, זבובים הנושאים רקמות פסיפס מיוצרים בקלות19,20. התאים מסוג פרא המקיפים את התאים המוטנטיים יוצרים בקרה פנימית מושלמת כדי למנוע הבדלים אינדיבידואליים21.

המחקר הנוכחי מתאר כיצד לגרום לאוטופגיה על ידי רעב חומצות אמינו וליצור רקמות גוף של שומן פסיפס המבטא GFP-Atg8a. פרוטוקולים אלה יכולים לשמש לניתוח הבדלים באוטופגיה בין שיבוטים מוטנטיים.

Protocol

1. מעבר דרוזופילה והטלת ביצים

  1. הכניסו 3 זכרים (גנוטיפ hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a) ו-15 נקבות (גנוטיפ y' w* Mu FRT19A/ FM7, Kr GFP ) זבובים בוגרים (ראו טבלת חומרים) לבקבוקון תרבית ( עם קמח תירס /מולסה/אגר סטנדרטי ב-25°C) להזדווגות.
    הערה: יש להגדיר בקבוקוני תרבית מרובים של אותו צלב כדי להבטיח מספיק זחלים לניסויים נוספים. זן הזבוב הזכר עם גנוטיפ hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a נושא אתר FRT בכרומוזום X ליד הצנטרומר (FRT19A). זה גם מבטא FLP על הלם חום ב 37 ° C. טרנסגן עם ביטוי RFP בכל מקום מוכנס לכרומוזום X. GFP-Atg8a מתבטא תחת שליטה של cgGal4 בגוף שומן הזחל22. נקבת זן הזבוב עם גנוטיפ y' w* Mu FRT19A / FM7, Kr GFP נושאת מוטציה קטלנית (Mu) ו-FRT19A על כרומוזום X. תוכנית המעבר המפורטת מוצגת באיור 1.
  2. להטלת ביצים מעבירים את הזבובים לבקבוקון תרבית חדש. בשעה 48 לאחר ההקדמה, הקש על בקבוקון ההזדווגות עד שהזבובים יהיו המומים ויפיל על המדיה שבבסיס הבקבוקון.
    1. נתקו את בקבוקון ה"הזדווגות" וכסו את פיו בבקבוקון הפוך מנותק במדיה טרייה (בקבוקון תרבית טרי). לאחר מכן, העבירו את הזבובים לבקבוקון התרבית הטרי על ידי היפוך והקשה על הבקבוקונים.
    2. חברו את בקבוקון התרבית הטרי (עם הזבובים המועברים) והשליכו את בקבוקון התרבות הישן. הניחו את בקבוקון התרבית הטרי הזה באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס להטלת ביצים על המצע הטרי.
      הערה: חימום מקדים של בקבוקוני התרבית הטריים ל-25 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפני תהליך העברת הזבובים יסייע לזבובים להסתגל לסביבה החדשה במהירות ויזרז את הטלת הביצים.
  3. הוציאו את הזבובים לאחר 6 שעות של הטלת ביצים. אם יש צורך לחזור על הניסויים, העבירו את הזבובים הללו לבקבוקון תרבית אחר (כמתואר בשלב 1.2). אחרת, השליכו את הזבובים על ידי השלכתם לבקבוק המכיל 75% אתנול).
    1. לדגור על הבקבוקון עם עוברים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי לגרום לביטוי FLP. לאחר מכן, הניחו אותם באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס ואפשרו לעוברים להמשיך להתפתח.
      הערה: היווצרות מוצלחת של שיבוטים מוטנטיים יכולה להיות מאושרת לאחר מכן באמצעות הדמיה. היעדר אותות RFP מסמן את השיבוטים המוטנטים.

2. רעב חומצות אמינו גורם לאוטופגיה

  1. בעזרת מרית מעבדה, גרפו את המדיה המכילה את הזחלים המתפתחים לתוך צלחת פטרי 75 שעות לאחר הטלת הביצים. מוסיפים 3 מ"ל של 1x PBS לצלחת ומפרידים בעדינות את מצע התרבית ואת הזחלים באמצעות מלקחיים ארוכים. בחר 10 עד 15 זחלי כוכב שלישי מוקדם.
    הערה: יש לבחור בקפידה את זחלי הכוכב השלישי המוקדם. השלב ההתפתחותי של הזחלים הוא קריטי להצלחת פרוטוקול זה. בשל משך הטלת הביצים המוגבל, רוב הזחלים בבקבוקון התרבית צפויים להיות בשלב האינסטאר השלישי בתחילת 75 שעות הדגירה. עם זאת, מתכוני מדיה תרבותיים שונים עשויים להוביל לשינויים בתזמון ההתפתחותי של הזחלים. הקריטריונים להבחנה בין זחלי כוכב שלישי מוקדם הם אורך הגוף, נוכחות של ספירקלים קדמיים ואחוריים, כמו גם ווים mandibular של מנגנון הפה23.
  2. מלא את הבארות של צלחת ספוט שקע זכוכית 9 בארות (ראה טבלת חומרים) עם 1x PBS. מניחים את הזחלים המופרדים בבארות באמצעות מלקחיים ארוכים ושוטפים היטב את הזחלים כדי להסיר את כל שאריות המדיה.
  3. קח 5 מ"ל של תמיסת 20% סוכרוז (ב- PBS 1x) בבקבוקון ריק והנח את הזחלים הנקיים של הכוכב השלישי בתמיסה זו באמצעות מלקחיים ארוכים. לדגור בקבוקון זה באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות לפני הקציר אותם לנתיחה.
    הערה: תמיסת 20% סוכרוז (ב-1x PBS) משמשת כמדיום הרעבה חסר חומצות אמינו.

3. דיסקציה שלישית של זחלי אינסטאר ועיבוד רקמות דגימה

  1. לחדד שני זוגות של #5 מלקחיים (ראה טבלה של חומרים) באופן שווה משני הצדדים עם אבן השחזה.
  2. הוסף 400 μL של 1x PBS לכל באר של צלחת שקע זכוכית 9 בארות ולהעביר את הזחלים לתוך הבארות עם מלקחיים ארוכים. מניחים זחל אחד בבאר כאשר הצד הגבי (הצד עם קנה הנשימה) פונה כלפי מעלה.
    1. אחוז את הקוטיקולה של הזחל עם שני #5 מלקחיים באמצע גזע הזחל וקרע בעדינות את הקוטיקולות. גופי השומן החשופים, יחד עם רקמות פנימיות אחרות של הזחל, עדיין יהיו מחוברים לפגר הזחל. משוך מספיק כדי לחשוף את האיברים הפנימיים ככל האפשר. חזור על שלב זה עבור כל הזחלים.
      הערה: לכל זחל יש שתי חתיכות גדולות של גוף שומן לאורך גזע הגוף. רקמת גוף השומן היא חד-שכבה לבנה, אטומה ושטוחה שניתן להבחין בה בקלות תחת מיקרוסקופ דיסקציה24.
  3. מעבירים את פגר הזחל לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל המכיל 500 μL של 4% פרפורמלדהיד (PFA). יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 25°C מבלי לנער את הצינורות.
    אזהרה: 4% PFA רעיל. יש ללבוש כפפות ומסכות להגנה.
    הערה: מומלץ להכין 4% PFA במאגר PBS אחד. אבקת PFA אינה מתמוססת ב-PBS אחד באופן מיידי. לפיכך, התערובת חייבת להיות מודגרת ב 65 ° C באינקובטור לילה או מזועזע לסירוגין במשך 45 דקות ב 25 °C (75 °F).
  4. לאחר דגירה של 30 דקות של הפגר עם 4% PFA, פיפטה החוצה את תמיסת PFA, להוסיף 500 μL של 1x PBS לתוך הצינור, ולנער בעדינות את הצינור על מסובב שטוח במשך 10 דקות לפני השלכת תמיסת PBS 1x (חזור על 3x).
  5. בעזרת מלקחיים ארוכים, מעבירים את פגר הזחל הקבוע והשטוף לבאר בצלחת ספוט 9 שקעים מלאה ב- PBS 1x. באמצעות #5 מלקחיים, להסיר את כל רקמות הגוף ללא שומן.
  6. השתמש במלקחיים #5 כדי להרכיב את חתיכות גוף השומן על מגלשת מיקרוסקופ באמצעות 80% גליצרול כאמצעי הרכבה ולהניח כיסוי על גבי.
    הערה: לפני ההרכבה, בדוק את ה- pH של 80% גליצרול (באמצעות ניירות pH, pH = 7 הוא אופטימלי) כדי להגן על אות GFP. אמצעי הרכבה (ראה טבלת חומרים) עם DAPI בגליצרול 80% יסייעו בהדמיה של גרעיני תאי גוף שומן. שקופיות אלה יציבות במשך שבוע אחד כאשר מאוחסן בחושך ב 4 °C (75 °F).

תוצאות

בתנאים מוזנים, החלבון דמוי האוביקוויטין המתויג GFP, GFP-Atg8a, מפוזר בתוך התאים. עם רעב, הוא יוצר פונקטה ירוקה ומתייג אוטופגוזומים. ברגע שאוטופגוזומים מתמזגים עם ליזוזומים, GFP מרוה באוטוליזוזומים החומציים, והפונקטה הירוקה נעלמת. אם אוטופגיה אינה מושרית או שההבשלה האוטופגוזומית מואצת, מספר ה-GFP pu...

Discussion

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השיטות (1) ליצור זבובים הנושאים שיבוטים מוטנטיים בגופי שומן הזחל, (2) לגרום לאוטופגיה באמצעות רעב חומצות אמינו, ו-(3) לנתח את גופי השומן של הזחל. על מנת לייצר שיבוטים בהצלחה בגופי שומן הזחל, יש לבצע את השלבים הקריטיים הבאים בחריצות. (1) תזמון מדויק של שוק החום הוא קריטי מ?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

אנו אסירי תודה ל-THFC ול-BDSC על אספקת זני הזבובים. ד"ר טונג צ'או נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32030027, 91754103, 92157201) וקרנות מחקר בסיסיות עבור האוניברסיטאות המרכזיות. אנו מודים למתקן הליבה של המכון למדעי החיים (LSI) על מתן השירותים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubeAxygenMCT-150-C
#5 ForcepsDumontRS-5015
9 Dressions Spot platePYREX7220-85
Fluorescence MicroscopeNikonSMZ1500
GlycerolSangon BiotechA100854-0100
KClSangon BiotechA610440-0500Composition of 1x PBS solution
KH2PO4Sangon BiotechA600445-0500Composition of 1x PBS solution
Laboratory spatulaFisher14-375-10
Long forcepsR' DEERRST-14
Microscope cover glassCITOTEST80340-1130
Microscope slidesCITOTEST80302-2104
Na2HPO4Sangon BiotechA501727-0500Composition of 1x PBS solution
NaClSangon BiotechA610476-0005Composition of 1x PBS solution
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
Petri dishCorning430166
Standard cornmeal/molasses/agar fly foodTong Lab-made
Stereo microscopeNikonSMZ745
SucroseSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.10021418
Vectashield antifade mounting medium with DAPIVectorlabratoryH-1200-10Recommended mounting medium
Fly stocks
y'w* Iso FRT19ATong Lab's fly stocks
y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFPTong Lab's fly stocks
y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFPTong Lab's fly stocks
hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8aTong Lab's fly stocks

References

  1. Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. Autophagy: Molecular machinery for self-eating. Cell Death & Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).
  2. Jin, S., White, E. Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress. Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).
  3. Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).
  4. Mizushima, N., et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451 (7182), 1069-1075 (2008).
  5. Yang, Z., Klionsky, D. J. Eaten alive: A history of macroautophagy. Nature Cell Biology. 12 (9), 814-822 (2010).
  6. Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. The autophagosome: Origins unknown, biogenesis complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 759-774 (2013).
  7. Klionsky, D. J., Eskelinen, E. L., Deretic, V. Autophagosomes, phagosomes, autolysosomes, phagolysosomes, autophagolysosomes...Wait,I'mconfused. Autophagy. 10 (4), 549-551 (2014).
  8. Zhang, S., Hama, Y., Mizushima, N. The evolution of autophagy proteins-Diversification in eukaryotes and potential ancestors in prokaryotes. Journal of Cell Science. 134 (13), (2021).
  9. Scott, R. C., Schuldiner, O., Neufeld, T. P. Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body. Developmental Cell. 7 (2), 167-178 (2004).
  10. Liu, W., et al. Mitochondrial protein import regulates cytosolic protein homeostasis and neuronal integrity. Autophagy. 14 (8), 1293-1309 (2018).
  11. Ichimura, Y., et al. A ubiquitin-like system mediates protein lipidation. Nature. 408 (6811), 488-492 (2000).
  12. Rusten, T. E., et al. Programmed autophagy in the Drosophila fat body is induced by ecdysone through regulation of the PI3K pathway. Developmental Cell. 7 (2), 179-192 (2004).
  13. Nishida, Y., et al. Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy. Nature. 461 (7264), 654-658 (2009).
  14. Ravikumar, B., et al. Regulation of mammalian autophagy in physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 90 (4), 1383-1435 (2010).
  15. Xie, Z., Nair, U., Klionsky, D. J. Atg8 controls phagophore expansion during autophagosome formation. Molecular Biology of the Cell. 19 (8), 3290-3298 (2008).
  16. Shintani, T., Klionsky, D. J. Cargo proteins facilitate the formation of transport vesicles in the cytoplasm to vacuole targeting pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (29), 29889-29894 (2004).
  17. Russell, R. C., Yuan, H. X., Guan, K. L. Autophagy regulation by nutrient signaling. Cell Research. 24 (1), 42-57 (2014).
  18. Nagy, P., et al. How and why to study autophagy in Drosophila: It's more than just a garbage chute. Methods. 75, 151-161 (2015).
  19. Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59 (3), 499-509 (1989).
  20. Senecoff, J. F., Cox, M. M. Directionality in FLP protein-promoted site-specific recombination is mediated by DNA-DNA pairing. Journal of Biological Chemistry. 261 (16), 7380-7386 (1986).
  21. Germani, F., Bergantinos, C., Johnston, L. A. Mosaic analysis in Drosophila. Genetics. 208 (2), 473-490 (2018).
  22. Zappia, M. P., et al. E2F/Dp inactivation in fat body cells triggers systemic metabolic changes. eLife. 10, 67753 (2021).
  23. Demerec, M. . Biology of Drosophila. , (1965).
  24. Rizki, R. M., et al. Drosophila larval fat body surfaces. Wilhelm Roux's Archives of Developmental Biology. 192 (1), 1-7 (1983).
  25. Szeto, J., et al. ALIS are stress-induced protein storage compartments for substrates of the proteasome and autophagy. Autophagy. 2 (3), 189-199 (2006).
  26. Renna, M., et al. Chemical inducers of autophagy that enhance the clearance of mutant proteins in neurodegenerative diseases. Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11061-11067 (2010).
  27. Guo, S., et al. A large-scale RNA interference screen identifies genes that regulate autophagy at different stages. Scientific Reports. 8, 1-15 (2018).
  28. Tian, W., et al. An antibody for analysis of autophagy induction. Nature Methods. 17 (2), 232-239 (2020).
  29. Nezis, I. P. Selective autophagy in Drosophila. International Journal of Cell Biology. 2012, 146767 (2012).
  30. Chu, Y., et al. Fluorescent materials for monitoring mitochondrial biology. Materials. 14 (15), 4180 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE186

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved