Análise da Autofagia Induzida pela Inanição no Corpo Gorduroso de Larvas de Drosophila melanogaster

Resumo

O presente protocolo descreve a indução de autofagia no corpo adiposo de larvas de Drosophila melanogaster via depleção de nutrientes e analisa as alterações na autofagia utilizando linhagens de moscas transgênicas.

Resumo

A autofagia é um processo de autodigestão celular. Ele entrega carga aos lisossomos para degradação em resposta a vários estresses, incluindo fome. O mau funcionamento da autofagia está associado ao envelhecimento e a múltiplas doenças humanas. A maquinaria de autofagia é altamente conservada - desde leveduras até humanos. O corpo adiposo larval de Drosophila melanogaster, um análogo para fígado e tecido adiposo de vertebrados, fornece um modelo único para o monitoramento da autofagia in vivo. A autofagia pode ser facilmente induzida pela falta de nutrientes no corpo adiposo das larvas. A maioria dos genes relacionados à autofagia é conservada em Drosophila. Muitas linhagens de moscas transgênicas expressando marcadores de autofagia marcados foram desenvolvidas, o que facilita o monitoramento de diferentes etapas do processo de autofagia. A análise clonal permite uma comparação próxima de marcadores de autofagia em células com genótipos diferentes no mesmo pedaço de tecido. O protocolo atual detalha procedimentos para (1) gerar clones somáticos no corpo adiposo larval, (2) induzir autofagia via inanição de aminoácidos e (3) dissecar o corpo adiposo larval, com o objetivo de criar um modelo para análise de diferenças na autofagia utilizando um marcador autofagossomal (GFP-Atg8a) e análise clonal.

Introdução

A autofagia é um processo de "autoalimentação" induzido por vários estresses, incluindo a inanição de aminoácidos¹. A macroautofagia (doravante denominada autofagia) é o tipo de autofagia mais bem estudado e desempenha um papel insubstituível na manutenção da homeostase celular². O mau funcionamento da autofagia está associado a diversas doenças^humanas3. Além disso, alguns genes relacionados à autofagia são alvos potenciais para o tratamento de várias^doenças4.

A autofagia é regulada de forma altamente sofisticada⁵. Após a inanição, as membranas de isolamento sequestram materiais citoplasmáticos para formar autofagossomos de membrana dupla⁶. Os autofagossomos então se fundem com endossomos e lisossomos para formar anfissomos e autolisossomos. Com a ajuda de enzimas hidrolíticas lisossômicas, o conteúdo citoplasmático engolido é degradado e os nutrientes são reciclados⁷.

A autofagia é um processo conservado evolutivamente⁸. Drosophila melanogaster é um ótimo modelo para o estudo do processo de autofagia in vivo. A inanição de aminoácidos induz facilmente autofagia no tecido adiposo das moscas, um análogo do fígado e do tecido adiposo humanos⁹. Defeitos na autofagia interrompem os distintos padrões puncta de várias proteínas relacionadas à autofagia, como Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1, p62, entre outras¹⁰. Portanto, a análise dos padrões desses marcadores de autofagia ajudará a discernir a ocorrência de defeitos de autofagia e a etapa de autofagia defeituosa. Por exemplo, a proteína semelhante à ubiquitina Atg8 é o marcador de autofagia mais comumente usado¹¹. Em Drosophila melanogaster, cepas transgênicas com uma proteína fluorescente verde (GFP) marcada com Atg8a foram desenvolvidas com sucesso¹². GFP-Atg8a é difundida no citosol e núcleos nas células alimentadas. Após a inanição, a GFP-Atg8a é processada e modificada pela fosfatidiletanolamina (PE) e forma puncta, que marcam as membranas de isolamento e os autofagossomos totalmente desenvolvidos^13,14. Através da microscopia direta de fluorescência, a indução da autofagia pode ser facilmente observada como um aumento na formação de puncta GFP-Atg815. Atg8a puncta não se formaria em resposta à inanição na presença de um defeito de iniciação da autofagia. Como GFP-Atg8a pode ser extinta e digerida pelo pH baixo em autolisossomos, GFP-Atg8a puncta pode aumentar em número se a autofagia for bloqueada em estágios tardios¹⁶.

Como a autofagia é altamente sensível à disponibilidade nutricional¹⁷, pequenas diferenças nas condições de cultura frequentemente levam a variações nos fenótipos. Portanto, a análise clonal, método que analisa células mutantes versus células controle selvagens de um mesmo tecido, tem grande vantagem na dissecção de defeitos autofágicos¹⁸. Aproveitando a recombinação sítio-específica mediada por flippase/flippase (FLP/FRT) entre cromossomos homólogos, moscas portadoras de tecidos em mosaico são prontamente confeccionadas^19,20. As células selvagens que circundam as células mutantes formam um controle interno perfeito para evitar diferenças individuais²¹.

O presente estudo descreve como induzir autofagia por inanição de aminoácidos e gerar tecidos corporais de gordura em mosaico que expressam GFP-Atg8a. Esses protocolos podem ser utilizados para analisar diferenças na autofagia entre clones mutantes.

Protocolo

1. Cruzamento de Drosophila e postura de ovos

1. Introduzir 3 moscas adultas machos (genótipo hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a) e 15 fêmeas (genótipo y' w* Mu FRT19A/ FM7, Kr GFP ) (ver Tabela de Materiais) num frasco para injetáveis de cultura (com meio padrão de fubá/melaço/ágar Drosophila a 25 °C) para acasalamento.
   NOTA: Devem ser criados vários frascos de cultura da mesma cruz para garantir larvas suficientes para experiências posteriores. A linhagem de mosca macho com genótipo hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a carrega um sítio de FRT no cromossomo X próximo ao centrômero (FRT19A). Também expressa FLP após choque térmico a 37 °C. Um transgene com expressão ubíqua de RFP é inserido no cromossomo X. GFP-Atg8a é expressa sob o controle de cgGal4 no corpo adiposo de larvas²². A linhagem fêmea da mosca com genótipo y' w* Mu FRT19A / FM7, Kr GFP carrega uma mutação letal (Mu) e FRT19A no cromossomo X. O esquema detalhado de cruzamento é mostrado na Figura 1.
2. Para a postura de ovos, transfira as moscas para um novo frasco de cultura. Às 48 h após a introdução, toque no frasco para injetáveis de "acasalamento" até que as moscas fiquem atordoadas e caiam na mídia na base do frasco.
   1. Desligue o frasco para injetáveis de "acasalamento" e cubra a boca com um frasco para injetáveis invertido sem plugue com meios frescos (frasco para injetáveis de cultura fresca). Em seguida, transfira as moscas para o frasco de cultura fresco virando e tocando os frascos.
   2. Ligue o frasco para injetáveis de cultura frescos (com as moscas transferidas) e elimine o frasco de cultura antigo. Coloque este frasco para injetáveis de cultura fresca numa incubadora a 25 °C para a postura de ovos no meio fresco.
      NOTA: Pré-aquecer os frascos de cultura fresca a 25 °C durante 15 minutos antes do processo de transferência de moscas ajudará as moscas a adaptarem-se rapidamente ao novo ambiente e a acelerar a postura de ovos.
3. Retire as moscas após 6 h de postura dos ovos. Se as experiências tiverem de ser repetidas, transfira essas moscas para outro frasco para injetáveis de cultura (conforme descrito no passo 1.2). Caso contrário, descarte as moscas despejando-as em um frasco contendo etanol 75%).
   1. Incubar o frasco para injetáveis com embriões em banho-maria a 37 °C durante 1 h para induzir a expressão de FLP. Posteriormente, coloque-os numa incubadora a 25 °C e permita que os embriões continuem a desenvolver-se.
      NOTA: A formação bem-sucedida de clones mutantes pode ser confirmada posteriormente através de imagens. A ausência de sinais de RFP marca os clones mutantes.

2. A inanição de aminoácidos induz autofagia

1. Usando uma espátula de laboratório, retire os meios contendo as larvas em desenvolvimento em uma placa de Petri 75 h após a postura dos ovos. Adicionar 3 mL de PBS 1x ao prato e separar suavemente o meio de cultura e as larvas usando pinça longa. Selecione 10 a 15 larvas de terceiro ínstar precoces.
   NOTA: Larvas de terceiro ínstar precoce precisam ser escolhidas com cuidado. O estágio de desenvolvimento das larvas é crítico para o sucesso deste protocolo. Devido à duração restrita da postura de ovos, espera-se que a maioria das larvas no frasco de cultura esteja no estágio inicial de terceiro ínstar por 75 h de incubação. No entanto, diferentes receitas de meios de cultura podem levar a variações no tempo de desenvolvimento das larvas. Os critérios para distinguir larvas de terceiro estádio precoce são o comprimento do corpo, a presença de espiráculos anterior e posterior, bem como os ganchos mandibulares do aparelho bucal²³.
2. Encha os poços de uma placa spot de depressão de vidro de 9 poços (consulte Tabela de Materiais) com 1x PBS. Coloque as larvas separadas do terceiro ínstar nos poços usando pinças longas e lave bem as larvas para remover todos os resíduos do meio.
3. Tome 5 ml de solução de sacarose a 20% (em 1x PBS) num frasco para injetáveis vazio e coloque as larvas limpas de terceiro ínstar nesta solução utilizando pinças longas. Incubar este frasco para injetáveis numa incubadora a 25 °C durante 6 h antes de os colher para dissecção.
   NOTA: A solução de sacarose a 20% (em 1x PBS) serve como meio de privação deficiente em aminoácidos.

3. Dissecção de larvas de terceiro ínstar e processamento de amostras de tecido

1. Afie dois pares de pinças #5 (veja Tabela de Materiais) uniformemente em ambos os lados com uma pedra afiada.
2. Adicione 400 μL de 1x PBS em cada poço da placa de ponto de depressão de vidro de 9 poços e transfira as larvas para os poços com pinças longas. Coloque uma larva em um poço com o lado dorsal (o lado com a traqueia) voltado para cima.
   1. Segure a cutícula da larva com duas pinças #5 no meio do tronco da larva e rasgue suavemente as cutículas. Os corpos gordurosos expostos, juntamente com outros tecidos internos da larva, ainda estarão aderidos à carcaça da larva. Puxe o suficiente para expor os órgãos internos tanto quanto possível. Repita este passo para todas as larvas.
      NOTA: Cada larva tem dois grandes pedaços de corpo gorduroso ao longo do tronco do corpo. O tecido adiposo é uma monocamada branca, opaca e plana que pode ser facilmente distinguida ao microscópio de^{dissecção24}.
3. Transferir a carcaça da larva para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 500 μL de paraformaldeído (PFA) a 4%. Incubar durante 30 min a 25 °C sem agitar os tubos.
   CUIDADO: 4% PFA é tóxico. Use luvas e máscaras para proteção.
   Observação : recomenda-se preparar 4% PFA em 1x buffer PBS. O pó de PFA não se dissolve em 1x PBS instantaneamente. Assim, a mistura deve ser incubada a 65 °C numa incubadora durante a noite ou agitada intermitentemente durante 45 minutos a 25 °C.
4. Após 30 min de incubação da carcaça com PFA a 4%, pipetar a solução de PFA, adicionar 500 μL de 1x PBS no tubo e agitar suavemente o tubo em um rotador plano por 10 min antes de descartar a solução de 1x PBS (repetir 3x).
5. Usando pinças longas, transfira a carcaça da larva fixa e lavada para um poço na placa spot de 9 depressões preenchida com 1x PBS. Usando pinças #5, remova todos os tecidos corporais não gordurosos.
6. Use pinças #5 para montar os pedaços do corpo gordo em uma lâmina de microscópio usando glicerol 80% como meio de montagem e coloque uma lamínula por cima.
   NOTA: Antes de montar, verifique o pH do glicerol a 80% (usando papéis de pH, pH = 7 é ideal) para proteger o sinal de GFP. O meio de montagem (ver Tabela de Materiais) com DAPI em glicerol a 80% ajudará na obtenção de imagens dos núcleos das células do corpo adiposo. Essas lâminas são estáveis por 1 semana quando armazenadas no escuro a 4 °C.

Resultados

Sob condições de alimentação, a proteína semelhante à ubiquitina marcada com GFP, GFP-Atg8a, é difundida dentro das células. Após a fome, forma puncta verde e rotula autofagossomos. Uma vez que os autofagossomos se fundem com os lisossomos, a GFP é extinta nos autolisossomos ácidos, e os puncta verdes desaparecem. Se a autofagia não for induzida ou a maturação do autofagossomo for acelerada, espera-se que o número de pontos de GFP seja baixo. No entanto, se a fusão entre autofagossomos e lisossomos for bl...

Discussão

O presente protocolo descreve os métodos para (1) gerar moscas portadoras de clones mutantes nos corpos gordurosos das larvas, (2) induzir autofagia através da inanição de aminoácidos e (3) dissecar os corpos gordurosos das larvas. A fim de gerar clones com sucesso nos corpos gordurosos das larvas, as seguintes etapas críticas precisam ser realizadas diligentemente. (1) Cronometrar o choque térmico com precisão é crucial, pois a recombinação mitótica só ocorre quando o tecido está sofrendo mitose, e (2) tan...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
#5 Forceps	Dumont	RS-5015
9 Dressions Spot plate	PYREX	7220-85
Fluorescence Microscope	Nikon	SMZ1500
Glycerol	Sangon Biotech	A100854-0100
KCl	Sangon Biotech	A610440-0500	Composition of 1x PBS solution
KH2PO4	Sangon Biotech	A600445-0500	Composition of 1x PBS solution
Laboratory spatula	Fisher	14-375-10
Long forceps	R' DEER	RST-14
Microscope cover glass	CITOTEST	80340-1130
Microscope slides	CITOTEST	80302-2104
Na2HPO4	Sangon Biotech	A501727-0500	Composition of 1x PBS solution
NaCl	Sangon Biotech	A610476-0005	Composition of 1x PBS solution
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Petri dish	Corning	430166
Standard cornmeal/molasses/agar fly food			Tong Lab-made
Stereo microscope	Nikon	SMZ745
Sucrose	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	10021418
Vectashield antifade mounting medium with DAPI	Vectorlabratory	H-1200-10	Recommended mounting medium
Fly stocks
y'w* Iso FRT19A			Tong Lab's fly stocks
y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP			Tong Lab's fly stocks
y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP			Tong Lab's fly stocks
hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a			Tong Lab's fly stocks