Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, Drosophila melanogaster larva yağ gövdesinde otofajinin besin tükenmesi yoluyla indüklenmesini açıklamakta ve transgenik sinek suşlarını kullanarak otofajideki değişiklikleri analiz etmektedir.

Özet

Otofaji, hücresel bir kendi kendine sindirim sürecidir. Açlık da dahil olmak üzere çeşitli streslere yanıt olarak bozunma için lizozomlara kargo gönderir. Otofajinin arızalanması yaşlanma ve çoklu insan hastalıkları ile ilişkilidir. Otofaji makinesi, mayadan insanlara kadar yüksek oranda korunmaktadır. Omurgalı karaciğeri ve yağ dokusu için bir analog olan Drosophila melanogaster'in larva yağ gövdesi, in vivo otofajiyi izlemek için benzersiz bir model sağlar. Otofaji, larva yağ gövdesindeki besin açlığı ile kolayca indüklenebilir. Otofaji ile ilişkili genlerin çoğu Drosophila'da korunur. Etiketli otofaji belirteçlerini ifade eden birçok transgenik sinek suşu geliştirilmiştir, bu da otofaji sürecindeki farklı adımların izlenmesini kolaylaştırır. Klonal analiz, aynı doku parçasında farklı genotiplere sahip hücrelerdeki otofaji belirteçlerinin yakından karşılaştırılmasını sağlar. Mevcut protokol, (1) larva yağ gövdesinde somatik klonlar üretmek, (2) amino asit açlığı yoluyla otofajiyi indüklemek ve (3) larva yağ gövdesini diseke etmek, otofaji farklılıklarını bir otofagozom belirteci (GFP-Atg8a) ve klonal analiz kullanarak analiz etmek için bir model oluşturmayı amaçlayan prosedürleri detaylandırmaktadır.

Giriş

Otofaji, amino asit açlığı1 dahil olmak üzere çeşitli streslerin neden olduğu "kendi kendine yeme" sürecidir. Makrootofaji (bundan böyle otofaji olarak anılacaktır) en iyi çalışılmış otofaji türüdür ve hücresel homeostazın korunmasında yeri doldurulamaz bir rol oynar2. Otofajinin arızalanması çeşitli insan hastalıkları ile ilişkilidir3. Ek olarak, otofaji ile ilişkili bazı genler çeşitli hastalıkların tedavisinde potansiyel hedeflerdir4.

Otofaji son derece sofistike bir şekilde düzenlenir5. Açlıktan öldükten sonra, izolasyon membranları çift membranlı otofagozomlar oluşturmak için sitoplazmik materyalleri ayırır6. Otofagozomlar daha sonra amfizomlar ve otolizozomlar oluşturmak için endozomlar ve lizozomlarla kaynaşır. Lizozomal hidrolitik enzimlerin yardımıyla, yutulan sitoplazmik içerikler parçalanır ve besinler geri dönüştürülür7.

Otofaji evrimsel olarak korunmuş bir süreçtir8. Drosophila melanogaster, in vivo otofaji sürecini incelemek için harika bir modeldir. Amino asit açlığı, insan karaciğeri ve yağ dokusunun bir analoğu olan sinek yağ vücut dokusunda otofajiyi kolayca indükler9. Otofajideki kusurlar, diğerlerinin yanı sıra Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 ve p62 gibi otofaji ile ilişkili çeşitli proteinlerin farklı punkta paternlerini bozar10. Bu nedenle, bu otofaji belirteçlerinin paternlerini analiz etmek, otofaji defektlerinin oluşumunu ve kusurlu otofaji basamağını ayırt etmeye yardımcı olacaktır. Örneğin, ubikitin benzeri protein Atg8, en yaygın kullanılan otofaji belirteci11'dir. Drosophila melanogaster'de, yeşil floresan protein (GFP) etiketli Atg8a içeren transgenik suşlar başarıyla geliştirilmiştir12. GFP-Atg8a, beslenen hücrelerdeki sitosol ve çekirdeklerde yayılır. Açlıktan ölmek üzere, GFP-Atg8a fosfatidiletanolamin (PE) tarafından işlenir ve modifiye edilir ve izolasyon membranlarını ve tamamen gelişmiş otofagozomları13,14 etiketleyen punkta oluşturur. Doğrudan floresan mikroskopi ile otofaji indüksiyonu, GFP-Atg8 punkta oluşumu15'te bir artış olarak kolayca gözlemlenebilir. Atg8a puncta, otofaji başlatma defekti varlığında açlığa yanıt olarak oluşmaz. GFP-Atg8a, otolizozomlardaki düşük pH ile söndürülüp sindirilebildiğinden, otofaji geç evrelerde16'da bloke edilirse, GFP-Atg8a puncta sayıları artabilir.

Otofaji beslenme mevcudiyetine karşı oldukça hassas olduğu için17, kültür koşullarındaki küçük farklılıklar genellikle fenotiplerde farklılıklara yol açar. Bu nedenle, aynı dokudaki vahşi tip kontrol hücrelerine karşı mutant hücreleri analiz eden bir yöntem olan klonal analiz, otofaji defektlerinin diseksiyonunda büyük bir avantaja sahiptir18. Homolog kromozomlar arasındaki flippas / flippase tanıma hedefi (FLP / FRT) aracılı bölgeye özgü rekombinasyondan yararlanarak, mozaik dokuları taşıyan sinekler kolayca19,20 yapılır. Mutant hücreleri çevreleyen vahşi tip hücreler, bireysel farklılıkları önlemek için mükemmel bir iç kontrol oluşturur21.

Bu çalışma, amino asit açlığı ile otofajinin nasıl indükleneceğini ve GFP-Atg8a eksprese eden mozaik yağ vücut dokularının nasıl üretileceğini açıklamaktadır. Bu protokoller, mutant klonlar arasındaki otofajideki farklılıkları analiz etmek için kullanılabilir.

Protokol

1. Drosophila geçişi ve yumurtlama

  1. Çiftleşme için 3 erkek (genotip hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a) ve 15 dişi (genotip y' w* Mu FRT19A / FM7, Kr GFP ) yetişkin sinekleri (bakınız Malzeme Tablosu) çiftleşme için bir kültür şişesine (25 ° C'de standart mısır unu / pekmez / agar Drosophila ortamı ile) koyun.
    NOT: Daha sonraki deneyler için yeterli larva sağlamak için aynı haçtan oluşan çoklu kültür şişeleri kurulmalıdır. Genotip hsFLP ubiRFP FRT19A ile erkek sinek suşu; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a, sentromerin (FRT19A) yakınındaki X kromozomunda bir FRT bölgesi taşır. Ayrıca 37 ° C'de ısı şoku üzerine FLP'yi ifade eder. Her yerde bulunan RFP ekspresyonuna sahip bir transgen, X kromozomuna yerleştirilir. GFP-Atg8a, larva yağ gövdesinde cgGal4 kontrolü altında eksprese edilir22. Genotip y' w* Mu FRT19A / FM7, Kr GFP ile dişi sinek suşu, X kromozomu üzerinde ölümcül bir mutasyon (Mu) ve FRT19A taşır. Ayrıntılı geçiş şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.
  2. Yumurtlama için, sinekleri yeni bir kültür şişesine aktarın. Giriş sonrası 48 saatte, sinekler sersemletilene kadar "çiftleşme" şişesine dokunun ve şişenin tabanındaki ortama bırakın.
    1. "Çiftleşme" şişesinin fişini çekin ve ağzını taze medya (taze kültür şişesi) ile fişi çekilmiş ters çevrilmiş bir şişe ile kapatın. Ardından, şişeleri çevirip dokunarak sinekleri taze kültür şişesine aktarın.
    2. Taze kültür şişesini (aktarılan sineklerle birlikte) takın ve eski kültür şişesini atın. Bu taze kültür şişesini, taze ortama yumurtlamak için 25 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
      NOT: Sinek transfer işleminden önce taze kültür şişelerinin 15 dakika boyunca 25 ° C'ye ısıtılması, sineklerin yeni ortama hızlı bir şekilde adapte olmalarına ve yumurtlamayı hızlandırmalarına yardımcı olacaktır.
  3. 6 saatlik yumurtlamadan sonra sinekleri çıkarın. Deneylerin tekrarlanması gerekiyorsa, bu sinekleri başka bir kültür şişesine aktarın (adım 1.2'de açıklandığı gibi). Aksi takdirde, sinekleri% 75 etanol içeren bir şişeye atarak atın).
    1. FLP ekspresyonunu indüklemek için şişeyi embriyolarla 37 ° C'lik bir su banyosunda 1 saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, onları 25 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin ve embriyoların gelişmeye devam etmesine izin verin.
      NOT: Mutant klonların başarılı oluşumu daha sonra görüntüleme yoluyla doğrulanabilir. RFP sinyallerinin yokluğu mutant klonları işaretler.

2. Amino asit açlığı otofajiyi indükler

  1. Bir laboratuvar spatulası kullanarak, gelişmekte olan larvaları içeren ortamı, yumurtlamadan 75 saat sonra bir Petri kabına alın. Yemeğe 3 mL 1x PBS ekleyin ve uzun forseps kullanarak kültür ortamını ve larvaları yavaşça ayırın. 10 ila 15 erken üçüncü instar larvasını seçin.
    NOT: Erken üçüncü instar larvalarının dikkatlice seçilmesi gerekir. Larvaların gelişim aşaması bu protokolün başarısı için kritik öneme sahiptir. Kısıtlı yumurtlama süresi nedeniyle, kültür şişesindeki larvaların çoğunun 75 saatlik inkübasyonla erken üçüncü instar aşamasında olması beklenir. Bununla birlikte, farklı kültür ortamı tarifleri larvaların gelişimsel zamanlamasında değişikliklere yol açabilir. Erken üçüncü instar larvalarını ayırt etme kriterleri vücut uzunluğu, ön ve arka spiracles varlığı ve ağız aparatının mandibuler kancalarıdır23.
  2. 9 delikli cam çöküntü spot plakasının kuyucuklarını 1x PBS ile doldurun ( bkz. Ayrılmış üçüncü instar larvalarını uzun forseps kullanarak kuyucuklara yerleştirin ve tüm ortam kalıntılarını gidermek için larvaları iyice yıkayın.
  3. Boş bir şişede 5 mL% 20 sakkaroz (1x PBS'de) çözeltisi alın ve temiz üçüncü instar larvalarını uzun forseps kullanarak bu çözeltiye yerleştirin. Bu şişeyi, diseksiyon için hasat etmeden önce 6 saat boyunca 25 ° C'lik bir inkübatörde inkübe edin.
    NOT: % 20 sakkaroz (1x PBS'de) çözeltisi, amino asit eksikliği olan açlık ortamı olarak işlev görür.

3. Üçüncü instar larva diseksiyonu ve örnek doku işleme

  1. İki çift # 5 forseps ( Malzeme Tablosuna bakınız) her iki tarafta da bir bileme taşı ile eşit şekilde keskinleştirin.
  2. 9 delikli cam çöküntü spot plakasının her bir kuyucuğuna 400 μL 1x PBS ekleyin ve larvaları uzun forsepslerle kuyucuklara aktarın. Bir larvayı dorsal tarafı (trakealı taraf) yukarı bakacak şekilde bir kuyuya yerleştirin.
    1. Larva gövdesinin ortasındaki iki # 5 forseps ile larva kütikülünü tutun ve tırnak etlerini yavaşça yırtın. Maruz kalan yağ gövdeleri, diğer larva iç dokuları ile birlikte, larvaların karkasına hala bağlanacaktır. İç organları mümkün olduğunca açığa çıkaracak kadar çekin. Tüm larvalar için bu adımı tekrarlayın.
      NOT: Her larva vücut gövdesi boyunca iki büyük yağ gövdesine sahiptir. Yağlı vücut dokusu, diseksiyon mikroskobu24 altında kolayca ayırt edilebilen beyaz, opak ve düz bir tek katmanlıdır.
  3. Larva karkası, 500 μL% 4 paraformaldehit (PFA) içeren 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpleri sallamadan 25 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
    DİKKAT: %4 PFA toksiktir. Koruma için eldiven ve maske takın.
    NOT: 1x PBS arabelleğinde %4 PFA hazırlanması önerilir. PFA tozu anında 1x PBS'de çözünmez. Bu nedenle, karışım gece boyunca bir inkübatörde 65 ° C'de inkübe edilmeli veya 25 ° C'de 45 dakika aralıklı olarak çalkalanmalıdır.
  4. Karkasın %4 PFA ile 30 dakikalık inkübasyonundan sonra, PFA çözeltisini pipetleyin, tüpe 500 μL 1x PBS ekleyin ve 1x PBS çözeltisini atmadan önce tüpü düz bir rotatörde 10 dakika boyunca hafifçe çalkalayın (3x'i tekrarlayın).
  5. Uzun forseps kullanarak, sabit ve yıkanmış larva karkasını, 1x PBS ile doldurulmuş 9 çöküntülü nokta plakasındaki bir kuyuya aktarın. # 5 forseps kullanarak, tüm yağ olmayan vücut dokularını çıkarın.
  6. Yağ gövdesinin parçalarını, montaj ortamı olarak% 80 gliserol kullanarak bir mikroskop slaydına monte etmek için # 5 forseps kullanın ve üstüne bir kapak kayması yerleştirin.
    NOT: GFP sinyalini korumak için monte etmeden önce, %80 gliserolün pH'ını kontrol edin (pH kağıtları kullanarak, pH = 7 en uygunudur). % 80 gliserol içinde DAPI ile montaj ortamı (bakınız Malzeme Tablosu), yağ vücut hücrelerinin çekirdeklerinin görüntülenmesinde yardımcı olacaktır. Bu slaytlar karanlıkta 4 °C'de saklandığında 1 hafta boyunca stabildir.

Sonuçlar

Beslenen koşullar altında, GFP etiketli ubikitin benzeri protein, GFP-Atg8a, hücrelerin içine yayılır. Açlıktan öldüğünde, yeşil punkta oluşturur ve otofagozomları etiketler. Otofagozomlar lizozomlarla kaynaştığında, GFP asidik otolizozomlarda söndürülür ve yeşil punkta kaybolur. Otofaji indüklenmezse veya otofagozom olgunlaşması hızlanırsa, GFP punkta sayısının düşük olması beklenir. Bununla birlikte, otofagozomlar ve lizozomlar arasındaki füzyon bloke edilirse veya otolizozomun pH'...

Tartışmalar

Mevcut protokol, (1) larva yağ cisimlerinde mutant klonlar taşıyan sinekler üretmek, (2) amino asit açlığı yoluyla otofajiyi indüklemek ve (3) larva yağ cisimleri diseke etmek için yöntemleri açıklamaktadır. Larva yağ gövdelerinde klonları başarılı bir şekilde üretmek için, aşağıdaki kritik adımların özenle gerçekleştirilmesi gerekir. (1) Isı şokunun doğru bir şekilde zamanlaması çok önemlidir, çünkü mitotik rekombinasyon sadece doku mitoz geçirdiğinde gerçekleşir ve (2) hem ...

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Sinek suşlarını sağladıkları için THFC ve BDSC'ye minnettarız. Dr. Tong Chao, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32030027, 91754103, 92157201) ve merkezi üniversiteler için Temel araştırma fonları tarafından desteklenmektedir. Yaşam Bilimleri Enstitüsü'ndeki (LSI) çekirdek tesise hizmet verdiği için teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubeAxygenMCT-150-C
#5 ForcepsDumontRS-5015
9 Dressions Spot platePYREX7220-85
Fluorescence MicroscopeNikonSMZ1500
GlycerolSangon BiotechA100854-0100
KClSangon BiotechA610440-0500Composition of 1x PBS solution
KH2PO4Sangon BiotechA600445-0500Composition of 1x PBS solution
Laboratory spatulaFisher14-375-10
Long forcepsR' DEERRST-14
Microscope cover glassCITOTEST80340-1130
Microscope slidesCITOTEST80302-2104
Na2HPO4Sangon BiotechA501727-0500Composition of 1x PBS solution
NaClSangon BiotechA610476-0005Composition of 1x PBS solution
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
Petri dishCorning430166
Standard cornmeal/molasses/agar fly foodTong Lab-made
Stereo microscopeNikonSMZ745
SucroseSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.10021418
Vectashield antifade mounting medium with DAPIVectorlabratoryH-1200-10Recommended mounting medium
Fly stocks
y'w* Iso FRT19ATong Lab's fly stocks
y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFPTong Lab's fly stocks
y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFPTong Lab's fly stocks
hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8aTong Lab's fly stocks

Referanslar

  1. Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. Autophagy: Molecular machinery for self-eating. Cell Death & Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).
  2. Jin, S., White, E. Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress. Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).
  3. Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).
  4. Mizushima, N., et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451 (7182), 1069-1075 (2008).
  5. Yang, Z., Klionsky, D. J. Eaten alive: A history of macroautophagy. Nature Cell Biology. 12 (9), 814-822 (2010).
  6. Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. The autophagosome: Origins unknown, biogenesis complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 759-774 (2013).
  7. Klionsky, D. J., Eskelinen, E. L., Deretic, V. Autophagosomes, phagosomes, autolysosomes, phagolysosomes, autophagolysosomes...Wait,I'mconfused. Autophagy. 10 (4), 549-551 (2014).
  8. Zhang, S., Hama, Y., Mizushima, N. The evolution of autophagy proteins-Diversification in eukaryotes and potential ancestors in prokaryotes. Journal of Cell Science. 134 (13), (2021).
  9. Scott, R. C., Schuldiner, O., Neufeld, T. P. Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body. Developmental Cell. 7 (2), 167-178 (2004).
  10. Liu, W., et al. Mitochondrial protein import regulates cytosolic protein homeostasis and neuronal integrity. Autophagy. 14 (8), 1293-1309 (2018).
  11. Ichimura, Y., et al. A ubiquitin-like system mediates protein lipidation. Nature. 408 (6811), 488-492 (2000).
  12. Rusten, T. E., et al. Programmed autophagy in the Drosophila fat body is induced by ecdysone through regulation of the PI3K pathway. Developmental Cell. 7 (2), 179-192 (2004).
  13. Nishida, Y., et al. Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy. Nature. 461 (7264), 654-658 (2009).
  14. Ravikumar, B., et al. Regulation of mammalian autophagy in physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 90 (4), 1383-1435 (2010).
  15. Xie, Z., Nair, U., Klionsky, D. J. Atg8 controls phagophore expansion during autophagosome formation. Molecular Biology of the Cell. 19 (8), 3290-3298 (2008).
  16. Shintani, T., Klionsky, D. J. Cargo proteins facilitate the formation of transport vesicles in the cytoplasm to vacuole targeting pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (29), 29889-29894 (2004).
  17. Russell, R. C., Yuan, H. X., Guan, K. L. Autophagy regulation by nutrient signaling. Cell Research. 24 (1), 42-57 (2014).
  18. Nagy, P., et al. How and why to study autophagy in Drosophila: It's more than just a garbage chute. Methods. 75, 151-161 (2015).
  19. Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59 (3), 499-509 (1989).
  20. Senecoff, J. F., Cox, M. M. Directionality in FLP protein-promoted site-specific recombination is mediated by DNA-DNA pairing. Journal of Biological Chemistry. 261 (16), 7380-7386 (1986).
  21. Germani, F., Bergantinos, C., Johnston, L. A. Mosaic analysis in Drosophila. Genetics. 208 (2), 473-490 (2018).
  22. Zappia, M. P., et al. E2F/Dp inactivation in fat body cells triggers systemic metabolic changes. eLife. 10, 67753 (2021).
  23. Demerec, M. . Biology of Drosophila. , (1965).
  24. Rizki, R. M., et al. Drosophila larval fat body surfaces. Wilhelm Roux's Archives of Developmental Biology. 192 (1), 1-7 (1983).
  25. Szeto, J., et al. ALIS are stress-induced protein storage compartments for substrates of the proteasome and autophagy. Autophagy. 2 (3), 189-199 (2006).
  26. Renna, M., et al. Chemical inducers of autophagy that enhance the clearance of mutant proteins in neurodegenerative diseases. Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11061-11067 (2010).
  27. Guo, S., et al. A large-scale RNA interference screen identifies genes that regulate autophagy at different stages. Scientific Reports. 8, 1-15 (2018).
  28. Tian, W., et al. An antibody for analysis of autophagy induction. Nature Methods. 17 (2), 232-239 (2020).
  29. Nezis, I. P. Selective autophagy in Drosophila. International Journal of Cell Biology. 2012, 146767 (2012).
  30. Chu, Y., et al. Fluorescent materials for monitoring mitochondrial biology. Materials. 14 (15), 4180 (2021).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 186

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır