Analyse der Hunger-induzierten Autophagie in der Drosophila melanogaster-Larve des Fettkörpers

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Induktion von Autophagie im Fettkörper der Drosophila melanogaster-Larve durch Nährstoffmangel und analysiert Veränderungen in der Autophagie anhand transgener Fliegenstämme.

Zusammenfassung

Autophagie ist ein zellulärer Selbstverdauungsprozess. Es liefert Fracht an die Lysosomen, die als Reaktion auf verschiedene Belastungen, einschließlich Hunger, abgebaut werden. Die Fehlfunktion der Autophagie wird mit dem Altern und mehreren menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht. Die Autophagie-Maschinerie ist hochkonserviert - von der Hefe bis zum Menschen. Der Larvenfettkörper von Drosophila melanogaster, einem Analogon für Leber und Fettgewebe von Wirbeltieren, stellt ein einzigartiges Modell für die Überwachung der Autophagie in vivo dar. Autophagie kann leicht durch Nährstoffmangel im Fettkörper der Larve induziert werden. Die meisten Autophagie-assoziierten Gene sind in Drosophila konserviert. Es wurden viele transgene Fliegenstämme entwickelt, die markierte Autophagiemarker exprimieren, was die Überwachung verschiedener Schritte im Autophagieprozess erleichtert. Die klonale Analyse ermöglicht einen genauen Vergleich von Autophagie-Markern in Zellen mit unterschiedlichen Genotypen im selben Gewebestück. Das aktuelle Protokoll beschreibt Verfahren für (1) die Erzeugung somatischer Klone im Larvenfettkörper, (2) die Induktion von Autophagie durch Aminosäuremangel und (3) die Präparation des Larvenfettkörpers, mit dem Ziel, ein Modell für die Analyse von Unterschieden in der Autophagie unter Verwendung eines Autophagosomenmarkers (GFP-Atg8a) und einer klonalen Analyse zu erstellen.

Einleitung

Autophagie ist ein "selbstfressender" Prozess, der durch verschiedene Stressfaktoren induziert wird, einschließlich Aminosäuremangel¹. Die Makroautophagie (im Folgenden als Autophagie bezeichnet) ist die am besten untersuchte Form der Autophagie und spielt eine unersetzliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase². Die Fehlfunktion der Autophagie wird mit mehreren menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht³. Darüber hinaus sind einige Gene, die mit der Autophagie in Verbindung stehen, potenzielle Ziele für die Behandlung verschiedener Krankheiten⁴.

Die Autophagie wird auf hochentwickelte Weise reguliert⁵. Bei Hunger sequestrieren die Isolationsmembranen zytoplasmatisches Material, um doppelmembranige Autophagosomen zu bilden⁶. Autophagosomen verschmelzen dann mit Endosomen und Lysosomen zu Amphisomen und Autolysosomen. Mit Hilfe lysosomaler hydrolytischer Enzyme wird der eingeschlossene zytoplasmatische Inhalt abgebaut und die Nährstoffe recycelt⁷.

Autophagie ist ein evolutionär konservierter Prozess⁸. Drosophila melanogaster ist ein großartiges Modell, um den Autophagieprozess in vivo zu untersuchen. Aminosäuremangel induziert leicht Autophagie im Körpergewebe von Fliegenfett, einem Analogon der menschlichen Leber und des Fettgewebes⁹. Defekte in der Autophagie stören die unterschiedlichen Puncta-Muster mehrerer Autophagie-verwandter Proteine, wie z.B. Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 und p62, um nur einige zu nennen¹⁰. Daher wird die Analyse der Muster dieser Autophagiemarker helfen, das Auftreten von Autophagiedefekten und den defekten Autophagieschritt zu erkennen. So ist beispielsweise das Ubiquitin-ähnliche Protein Atg8 der am häufigsten verwendete Autophagiemarker¹¹. In Drosophila melanogaster wurden erfolgreich transgene Stämme mit einem grün fluoreszierenden Protein (GFP)-markiertem Atg8a entwickelt¹². GFP-Atg8a diffundiert im Zytosol und in den Zellkernen der gefütterten Zellen. Nach dem Aushungern wird GFP-Atg8a durch Phosphatidylethanolamin (PE) prozessiert und modifiziert und bildet Puncta, die die Isolationsmembranen und voll entwickelten Autophagosomen markieren^13,14. Durch direkte Fluoreszenzmikroskopie kann die Autophagie-Induktion leicht als Erhöhung der GFP-Atg8-Puncta-Bildung beobachtet werden¹⁵. Atg8a puncta würde sich nicht als Reaktion auf Hunger in Gegenwart eines Autophagie-Initiationsdefekts bilden. Da GFP-Atg8a durch den niedrigen pH-Wert in Autolysosomen abgeschreckt und verdaut werden kann, kann die Anzahl von GFP-Atg8a puncta zunehmen, wenn die Autophagie in späten Stadien blockiert wird¹⁶.

Da die Autophagie sehr empfindlich auf die Verfügbarkeit von Nährstoffen reagiert¹⁷, führen geringfügige Unterschiede in den Kulturbedingungen oft zu Variationen der Phänotypen. Daher hat die klonale Analyse, eine Methode, die mutierte Zellen im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollzellen im selben Gewebe analysiert, einen großen Vorteil bei der Analyse von Autophagie-Defekten¹⁸. Unter Ausnutzung der Flippase/Flippase Recognition Target (FLP/FRT)-vermittelten ortsspezifischen Rekombination zwischen homologen Chromosomen werden Fliegen, die Mosaikgewebe tragen, leicht hergestellt^19,20. Die Wildtyp-Zellen, die die mutierten Zellen umgeben, bilden eine perfekte interne Kontrolle, um individuelle Unterschiede zu vermeiden²¹.

Die vorliegende Arbeit beschreibt, wie Autophagie durch Aminosäuremangel induziert und GFP-Atg8a-exprimierendes Mosaikfettgewebe erzeugt werden kann. Diese Protokolle können zur Analyse von Unterschieden in der Autophagie zwischen mutierten Klonen verwendet werden.

Protokoll

1. Drosophila-Kreuzung und Eiablage

1. 3 männliche (Genotyp hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a) und 15 weibliche (Genotyp y' w* Mu FRT19A/ FM7, Kr GFP) adulte Fliegen (siehe Materialtabelle) werden zur Paarung in ein Kulturfläschchen (mit Standard-Maismehl/Melasse/Agar-Drosophila-Medium bei 25 °C) gegeben.
   HINWEIS: Es müssen mehrere Kulturfläschchen derselben Kreuzung aufgestellt werden, um sicherzustellen, dass genügend Larven für weitere Experimente vorhanden sind. Der männliche Fliegenstamm mit dem Genotyp hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a trägt eine FRT-Stelle am X-Chromosom in der Nähe des Zentromers (FRT19A). Es exprimiert auch FLP bei einem Hitzeschock bei 37 °C. Ein Transgen mit ubiquitärer RFP-Expression wird auf dem X-Chromosom eingefügt. GFP-Atg8a wird unter der Kontrolle von cgGal4 im Fettkörper der Larve^{exprimiert 22}. Der weibliche Fliegenstamm mit dem Genotyp y' w* Mu FRT19A / FM7, Kr GFP trägt eine letale Mutation (Mu) und FRT19A auf dem X-Chromosom. Das detaillierte Kreuzungsschema ist in Abbildung 1 dargestellt.
2. Für die Eiablage werden die Fliegen in ein neues Kulturfläschchen umgefüllt. Klopfen Sie 48 Stunden nach dem Einführen auf das "Paarungs"-Fläschchen, bis die Fliegen betäubt sind und auf das Medium am Boden des Fläschchens fallen.
   1. Ziehen Sie den Stecker aus der Steckdose und bedecken Sie den Mund mit einer nicht ausgesteckten, umgedrehten Durchstechflasche mit frischem Medium (Durchstechflasche mit frischen Kulturen). Übertragen Sie dann die Fliegen in das Fläschchen mit frischer Kultur, indem Sie die Fläschchen umdrehen und anklopfen.
   2. Verschließen Sie die Durchstechflasche mit der frischen Kultur (mit den übertragenen Fliegen) und entsorgen Sie die Durchstechflasche mit der alten Kultur. Stellen Sie diese Durchstechflasche mit Frischkultur in einen Inkubator bei 25 °C, um die Eier auf dem frischen Medium abzulegen.
      Anmerkungen: Das Vorwärmen der frischen Kulturfläschchen auf 25 °C für 15 Minuten vor dem Fliegentransferprozess hilft den Fliegen, sich schnell an die neue Umgebung anzupassen und die Eiablage zu beschleunigen.
3. Entfernen Sie die Fliegen nach 6 h Eiablage. Wenn die Experimente wiederholt werden müssen, überführen Sie diese Fliegen in ein anderes Kulturfläschchen (wie in Schritt 1.2 beschrieben). Andernfalls entsorgen Sie die Fliegen, indem Sie sie in eine Flasche mit 75%igem Ethanol werfen).
   1. Die Durchstechflasche mit den Embryonen wird 1 h lang in einem 37 °C warmen Wasserbad inkubiert, um die FLP-Expression zu induzieren. Anschließend werden sie in einen 25 °C heißen Inkubator gegeben und die Embryonen können sich weiter entwickeln.
      HINWEIS: Die erfolgreiche Bildung von Mutantenklonen kann nachträglich durch Bildgebung bestätigt werden. Das Fehlen von RFP-Signalen kennzeichnet die mutierten Klone.

2. Aminosäuremangel induziert Autophagie

1. Schöpfen Sie das Medium mit den sich entwickelnden Larven 75 Stunden nach der Eiablage mit einem Laborspatel in eine Petrischale aus. Geben Sie 3 ml 1x PBS in die Schale und trennen Sie das Nährmedium und die Larven vorsichtig mit einer langen Pinzette. Wählen Sie 10 bis 15 Larven im frühen dritten Stadium aus.
   HINWEIS: Larven im frühen dritten Stadium müssen sorgfältig ausgewählt werden. Das Entwicklungsstadium der Larven ist entscheidend für den Erfolg dieses Protokolls. Aufgrund der begrenzten Eiablagedauer wird erwartet, dass sich die meisten Larven im Kulturfläschchen nach 75 Stunden Inkubationszeit im frühen dritten Stadium befinden. Unterschiedliche Rezepturen der Nährmedien können jedoch zu Variationen im Entwicklungszeitpunkt der Larven führen. Die Kriterien zur Unterscheidung von Larven im frühen dritten Stadium sind die Körperlänge, das Vorhandensein von vorderen und hinteren Spirakeln sowie die Unterkieferhaken des Mundapparates²³.
2. Füllen Sie die Vertiefungen einer 9-Well-Glasvertiefungs-Spotplatte (siehe Materialtabelle) mit 1x PBS. Legen Sie die abgetrennten Larven des dritten Stadiums mit einer langen Pinzette in die Vertiefungen und waschen Sie die Larven gründlich, um alle Medienreste zu entfernen.
3. Nehmen Sie 5 ml 20%ige Saccharoselösung (in 1x PBS) in eine leere Durchstechflasche und legen Sie die sauberen Larven des dritten Stadiums mit einer langen Pinzette in diese Lösung. Inkubieren Sie diese Durchstechflasche 6 Stunden lang in einem Inkubator bei 25 °C, bevor Sie sie zur Sektion ernten.
   HINWEIS: Die 20%ige Saccharoselösung (in 1x PBS) dient als aminosäurearmes Hungermedium.

3. Präparation der Larven im dritten Stadium und Verarbeitung von Probengewebe

1. Schärfen Sie zwei Paar Pinzetten #5 (siehe Materialtabelle) gleichmäßig auf beiden Seiten mit einem Schleifstein.
2. Geben Sie 400 μL 1x PBS in jede Vertiefung der 9-Well-Glasvertiefungs-Spotplatte und übertragen Sie die Larven mit einer langen Pinzette in die Wells. Legen Sie eine Larve mit der Rückenseite (der Seite mit der Luftröhre) nach oben in eine Vertiefung.
   1. Fassen Sie die Nagelhaut der Larve mit zwei #5 Pinzetten in der Mitte des Larvenstamms und reißen Sie die Nagelhaut vorsichtig auf. Die freigelegten Fettkörper sind zusammen mit anderen inneren Geweben der Larve immer noch am Kadaver der Larve haften. Ziehen Sie genug, um die inneren Organe so weit wie möglich freizulegen. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle Larven.
      Anmerkungen: Jede Larve hat zwei große Fettkörperstücke entlang des Körperrumpfes. Fettkörpergewebe ist eine weiße, undurchsichtige und flache Monoschicht, die unter dem Präpariermikroskop²⁴ leicht unterschieden werden kann.
3. Der Larvenkadaver wird in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 μl 4%igem Paraformaldehyd (PFA) überführt. 30 min bei 25 °C inkubieren, ohne die Röhrchen zu schütteln.
   ACHTUNG: 4% PFA ist giftig. Tragen Sie zum Schutz Handschuhe und Masken.
   HINWEIS: Die Herstellung von 4% PFA in 1x PBS-Puffer wird empfohlen. PFA-Pulver löst sich nicht sofort in 1x PBS auf. Daher muss das Gemisch bei 65 °C in einem Inkubator über Nacht inkubiert oder 45 min bei 25 °C intermittierend geschüttelt werden.
4. Nach 30-minütiger Inkubation des Schlachtkörpers mit 4 % PFA pipettieren Sie die PFA-Lösung aus, geben Sie 500 μl 1x PBS in das Röhrchen und schütteln Sie das Röhrchen 10 min lang vorsichtig auf einem Flachrotator, bevor Sie die 1x PBS-Lösung verwerfen (3x wiederholen).
5. Übertragen Sie den fixierten und gewaschenen Larvenkadaver mit einer langen Pinzette in eine Vertiefung in der 9-Depressions-Spotplatte, die mit 1x PBS gefüllt ist. Entfernen Sie mit der Pinzette #5 alle fettfreien Körpertücher.
6. Verwenden Sie #5 Pinzetten, um die Teile des Fettkörpers mit 80% Glycerin als Eindeckmedium auf einen Objektträger zu montieren und ein Deckglas darauf zu legen.
   Anmerkungen: Überprüfen Sie vor der Montage den pH-Wert des 80%igen Glycerins (verwenden Sie pH-Papiere, pH = 7 ist optimal), um das GFP-Signal zu schützen. Eindeckmedien (siehe Materialtabelle) mit DAPI in 80 % Glycerin helfen bei der Abbildung der Zellkerne von Fettkörperzellen. Diese Objektträger sind 1 Woche haltbar, wenn sie im Dunkeln bei 4 °C gelagert werden.

Ergebnisse

Unter gefütterten Bedingungen wird das GFP-markierte Ubiquitin-ähnliche Protein, GFP-Atg8a, in den Zellen diffundiert. Beim Verhungern bildet es grüne Puncta und markiert Autophagosomen. Sobald Autophagosomen mit Lysosomen verschmelzen, wird GFP in den sauren Autolysosomen gelöscht und die grünen Puncta verschwinden. Wenn keine Autophagie induziert wird oder die Autophagosomenreifung beschleunigt wird, ist zu erwarten, dass die Anzahl der GFP-Puncta gering ist. Wenn jedoch die Fusion zwischen Autophagosomen und Lyso...

Diskussion

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Methoden, um (1) Fliegen zu erzeugen, die mutierte Klone in den Larvenfettkörpern tragen, (2) Autophagie durch Aminosäuremangel zu induzieren und (3) die Larvenfettkörper zu sezieren. Um erfolgreich Klone in den Fettkörpern der Larven zu erzeugen, müssen die folgenden kritischen Schritte gewissenhaft durchgeführt werden. (1) Das genaue Timing des Hitzeschocks ist entscheidend, da die mitotische Rekombination nur dann stattfindet, wenn das Gewebe eine Mitose durchläuft, und ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
#5 Forceps	Dumont	RS-5015
9 Dressions Spot plate	PYREX	7220-85
Fluorescence Microscope	Nikon	SMZ1500
Glycerol	Sangon Biotech	A100854-0100
KCl	Sangon Biotech	A610440-0500	Composition of 1x PBS solution
KH2PO4	Sangon Biotech	A600445-0500	Composition of 1x PBS solution
Laboratory spatula	Fisher	14-375-10
Long forceps	R' DEER	RST-14
Microscope cover glass	CITOTEST	80340-1130
Microscope slides	CITOTEST	80302-2104
Na2HPO4	Sangon Biotech	A501727-0500	Composition of 1x PBS solution
NaCl	Sangon Biotech	A610476-0005	Composition of 1x PBS solution
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Petri dish	Corning	430166
Standard cornmeal/molasses/agar fly food			Tong Lab-made
Stereo microscope	Nikon	SMZ745
Sucrose	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	10021418
Vectashield antifade mounting medium with DAPI	Vectorlabratory	H-1200-10	Recommended mounting medium
Fly stocks
y'w* Iso FRT19A			Tong Lab's fly stocks
y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP			Tong Lab's fly stocks
y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP			Tong Lab's fly stocks
hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a			Tong Lab's fly stocks