АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В настоящем протоколе описывается индукция аутофагии в жировом теле личинки Drosophila melanogaster посредством истощения питательных веществ и анализируются изменения в аутофагии с использованием трансгенных штаммов мух.

Аннотация

Аутофагия — это процесс клеточного самопереваривания. Он доставляет груз к лизосомам для деградации в ответ на различные стрессы, в том числе и на голодание. Нарушение аутофагии связано со старением и множественными заболеваниями человека. Механизм аутофагии очень консервативен - от дрожжей до человека. Личиночное жировое тело Drosophila melanogaster, аналог печени и жировой ткани позвоночных, представляет собой уникальную модель для мониторинга аутофагии in vivo. Аутофагия может быть легко вызвана питательным голоданием в личиночном жировом теле. Большинство генов, связанных с аутофагией, сохраняются у дрозофилы. Было разработано много трансгенных штаммов мух, экспрессирующих меченые маркеры аутофагии, что облегчает мониторинг различных этапов процесса аутофагии. Клональный анализ позволяет провести тщательное сравнение маркеров аутофагии в клетках с разными генотипами в одном и том же фрагменте ткани. В текущем протоколе подробно описаны процедуры (1) генерации соматических клонов в личиночном жировом теле, (2) индуцирования аутофагии посредством аминокислотного голодания и (3) вскрытия личиночного жирового тела с целью создания модели для анализа различий в аутофагии с использованием маркера аутофагосом (GFP-Atg8a) и клонального анализа.

Введение

Аутофагия — это процесс «самопоедания», вызванный различными стрессами, включая аминокислотное голодание1. Макроаутофагия (далее именуемая аутофагией) является наиболее хорошо изученным типом аутофагии и играет незаменимую роль в поддержании клеточного гомеостаза2. Нарушение аутофагии связано с несколькими заболеваниями человека3. Кроме того, некоторые гены, связанные с аутофагией, являются потенциальными мишенями для лечения различных заболеваний4.

Аутофагия регулируется очень сложным образом5. При голодании изоляционные мембраны изолируют цитоплазматические материалы с образованием двухмембранных аутофагосом6. Затем аутофагосомы сливаются с эндосомами и лизосомами, образуя амфисомы и аутолизосомы. С помощью лизосомальных гидролитических ферментов поглощенное цитоплазматическое содержимое разлагается, а питательные вещества перерабатываются7.

Аутофагия является эволюционно консервативным процессом8. Drosophila melanogaster является отличной моделью для изучения процесса аутофагии in vivo. Аминокислотное голодание легко индуцирует аутофагию в жировой ткани тела мухи, аналог печени и жировой тканичеловека 9. Дефекты аутофагии нарушают отчетливые паттерны точек нескольких белков, связанных с аутофагией, таких как Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 и p62, среди других10. Таким образом, анализ паттернов этих маркеров аутофагии поможет различить возникновение дефектов аутофагии и стадию дефектной аутофагии. Например, убиквитин-подобный белок Atg8 является наиболее часто используемым маркером аутофагии11. У Drosophila melanogaster были успешно выведены трансгенные штаммы с зеленым флуоресцентным белком (GFP)-меченым Atg8a12. GFP-Atg8a диффундирует в цитозоль и ядра питаемых клеток. При голодании GFP-Atg8a обрабатывается и модифицируется фосфатидилэтаноламином (ПЭ) и образует пункты, которые маркируют изоляционные мембраны и полностью развитые аутофагосомы13,14. С помощью прямой флуоресцентной микроскопии можно легко наблюдать индукцию аутофагии в виде увеличения образования точек GFP-Atg815. Atg8a puncta не образуется в ответ на голодание при наличии дефекта инициации аутофагии. Поскольку GFP-Atg8a может гаситься и перевариваться при низком рН в аутолизосомах, GFP-Atg8a puncta может увеличиваться в количестве, если аутофагия блокируется на поздних стадиях16.

Поскольку аутофагия очень чувствительна к доступности питания17, небольшие различия в условиях культивирования часто приводят к различиям в фенотипах. Таким образом, клональный анализ, метод, который анализирует мутантные клетки по сравнению с контрольными клетками дикого типа в той же ткани, имеет большое преимущество в анализе дефектов аутофагии18. Используя преимущества мишени распознавания флиппазы / флиппазы (FLP / FRT), опосредованной сайт-специфической рекомбинацией между гомологичными хромосомами, мухи, несущие мозаичные ткани, легко получаются19,20. Клетки дикого типа, окружающие мутантные клетки, образуют идеальный внутренний контроль, позволяющий избежать индивидуальных различий21.

В настоящем исследовании описывается, как индуцировать аутофагию путем аминокислотного голодания и генерировать мозаичные жировые ткани тела, экспрессирующие GFP-Atg8a. Эти протоколы могут быть использованы для анализа различий в аутофагии среди мутантных клонов.

протокол

1. Скрещивание дрозофил и кладка яиц

  1. Ввести 3 самца (генотип hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a) и 15 самок (генотип y' w* Mu FRT19A/FM7, Kr GFP ) взрослых мух (см. Таблицу материалов) во флакон с культурой (со стандартной средой дрозофилы из кукурузной муки/патоки/агара при 25 °C) для спаривания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо установить несколько флаконов для культивирования одного и того же креста, чтобы обеспечить достаточное количество личинок для дальнейших экспериментов. Штамм самцов мухи с генотипом hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a несет сайт FRT на Х-хромосоме вблизи центромеры (FRT19A). Он также выражает FLP при тепловом шоке при 37 ° C. Трансген с повсеместной экспрессией RFP вставляется в Х-хромосому. GFP-Atg8a экспрессируется под контролем cgGal4 в личиночном жировом теле22. Штамм мухи женского пола с генотипом y' w* Mu FRT19A/FM7, Kr GFP несет летальную мутацию (Mu) и FRT19A на Х-хромосоме. Подробная схема пересечения показана на рисунке 1.
  2. Для яйцекладки пересадите мух в новый культуральный флакон. Через 48 часов после введения постучите по флакону для спаривания, пока мухи не будут оглушены и не упадут на носитель у основания флакона.
    1. Отключите «брачный» флакон от сети и закройте его горлышко незакупоренным перевернутым флаконом со свежей средой (флакон со свежей культурой). Затем перенесите мух во флакон со свежей культурой, переворачивая и постукивая по флаконам.
    2. Заткните флакон со свежей культурой (с перенесенными мухами) и выбросьте старый флакон с культурой. Поместите этот флакон со свежей культурой в инкубатор с температурой 25 °C для закладки яиц на свежую среду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительный прогрев флаконов со свежими культурами до 25 ° C в течение 15 минут перед процессом переноса мух поможет мухам быстро адаптироваться к новой среде и ускорить откладывание яиц.
  3. Удаляют мух через 6 ч после откладки яиц. Если эксперименты необходимо повторить, перенесите этих мух в другой флакон с культурой (как описано в шаге 1.2). В противном случае выбросьте мух, сбросив их в колбу, содержащую 75% этанола).
    1. Инкубируйте флакон с эмбрионами на водяной бане при температуре 37 °C в течение 1 ч, чтобы вызвать экспрессию FLP. Затем поместите их в инкубатор с температурой 25 ° C и дайте эмбрионам продолжать развиваться.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Успешное формирование мутантных клонов может быть подтверждено впоследствии с помощью визуализации. Отсутствие сигналов RFP отмечает клоны-мутанты.

2. Аминокислотное голодание вызывает аутофагию

  1. Используя лабораторный шпатель, зачерпните среду, содержащую развивающихся личинок, в чашку Петри через 75 часов после яйцекладки. Добавьте 3 мл 1x PBS в чашку и аккуратно отделите питательную среду и личинки с помощью длинных щипцов. Выберите от 10 до 15 личинок раннего третьего возраста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Личинки раннего третьего возраста нужно выбирать тщательно. Стадия развития личинок имеет решающее значение для успеха этого протокола. Из-за ограниченной продолжительности яйцекладки ожидается, что большинство личинок во флаконе с культурой будут находиться на ранней стадии третьего возраста к 75 часам инкубации. Однако различные рецепты питательных сред могут привести к различиям в сроках развития личинок. Критериями различения личинок раннего третьего возраста являются длина тела, наличие передних и задних дыхальцев, а также нижнечелюстных крючков ротового аппарата23.
  2. Заполните лунки 9-луночной стеклянной разреженной точечной пластины (см. Таблицу материалов) 1x PBS. Поместите отделенных личинок третьего возраста в лунки с помощью длинных щипцов и тщательно вымойте личинок, чтобы удалить все остатки среды.
  3. Возьмите 5 мл 20% раствора сахарозы (в 1x PBS) в пустой флакон и поместите чистых личинок третьего возраста в этот раствор с помощью длинных щипцов. Инкубируйте этот флакон в инкубаторе с температурой 25 °C в течение 6 часов, прежде чем собирать их для вскрытия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 20% раствор сахарозы (в 1x PBS) служит средой голодания с дефицитом аминокислот.

3. Вскрытие личинок третьего возраста и обработка образцов тканей

  1. Заточите две пары щипцов #5 (см. Таблицу материалов) равномерно с обеих сторон точильным камнем.
  2. Добавьте 400 мкл 1x PBS в каждую лунку 9-луночной стеклянной точечной пластины с разрежением и перенесите личинок в лунки с помощью длинных щипцов. Поместите одну личинку в лунку спинной стороной (стороной трахеи) вверх.
    1. Захватите кутикулу личинки двумя щипцами #5 в середине личиночного ствола и аккуратно разорвите кутикулу. Обнаженные жировые тела вместе с другими внутренними тканями личинок все равно будут прикрепляться к туше личинки. Потяните достаточно, чтобы максимально обнажить внутренние органы. Повторите этот шаг для всех личинок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая личинка имеет два больших куска жирового тела вдоль туловища. Жировая ткань тела представляет собой белый, непрозрачный и плоский монослой, который можно легко различить под диссекционным микроскопом24.
  3. Переложите тушу личинки в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 500 мкл 4% параформальдегида (ПФА). Инкубировать 30 мин при 25 °C, не встряхивая пробирки.
    ВНИМАНИЕ: 4% PFA токсичен. Надевайте перчатки и маски для защиты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется готовить 4% PFA в буфере 1x PBS. Порошок PFA не растворяется в 1x PBS мгновенно. Следовательно, смесь необходимо инкубировать при 65 ° C в инкубаторе в течение ночи или периодически встряхивать в течение 45 минут при 25 ° C.
  4. После 30-минутной инкубации туши с 4% ПФА вытащите раствор ПФА пипеткой, добавьте 500 мкл 1x PBS в пробирку и осторожно встряхните пробирку на плоском вращателе в течение 10 мин, прежде чем выбросить 1x раствор PBS (повторите 3x).
  5. Используя длинные щипцы, перенесите фиксированную и промытую тушу личинки в колодец в точечной пластине с 9 углублениями, заполненную 1x PBS. Используя щипцы #5, удалите все нежирные ткани тела.
  6. Используйте щипцы #5, чтобы закрепить кусочки жирового тела на предметном стекле микроскопа, используя 80% глицерина в качестве монтажной среды, и положите сверху покровное стекло.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед установкой проверьте рН 80% глицерина (используя бумагу pH, pH = 7 является оптимальным) для защиты сигнала GFP. Монтажные среды (см. Таблицу материалов) с DAPI в 80% глицерине помогут в визуализации ядер клеток жирового тела. Эти предметные стекла стабильны в течение 1 недели при хранении в темноте при температуре 4 °C.

Результаты

В условиях кормления GFP-меченый убиквитинподобный белок, GFP-Atg8a, диффундирует внутри клеток. При голодании он образует зеленые точки и метит аутофагосомы. Как только аутофагосомы сливаются с лизосомами, GFP гасится в кислых аутолизосомах, и зеленые точки исчезают. Если аутофагия не индуци...

Обсуждение

В настоящем протоколе описаны способы (1) получения мух, несущих мутантные клоны в личиночных жировых телах, (2) индуцирования аутофагии посредством аминокислотного голодания и (3) препарирования личиночных жировых тел. Чтобы успешно генерировать клоны в личиночных жировых телах, необхо...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарны THFC и BDSC за предоставление штаммов мух. Доктор Тун Чао поддерживается Национальным фондом естественных наук Китая (32030027, 91754103, 92157201) и фондами фундаментальных исследований для центральных университетов. Мы благодарим основное учреждение Института наук о жизни (LSI) за предоставление услуг.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubeAxygenMCT-150-C
#5 ForcepsDumontRS-5015
9 Dressions Spot platePYREX7220-85
Fluorescence MicroscopeNikonSMZ1500
GlycerolSangon BiotechA100854-0100
KClSangon BiotechA610440-0500Composition of 1x PBS solution
KH2PO4Sangon BiotechA600445-0500Composition of 1x PBS solution
Laboratory spatulaFisher14-375-10
Long forcepsR' DEERRST-14
Microscope cover glassCITOTEST80340-1130
Microscope slidesCITOTEST80302-2104
Na2HPO4Sangon BiotechA501727-0500Composition of 1x PBS solution
NaClSangon BiotechA610476-0005Composition of 1x PBS solution
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
Petri dishCorning430166
Standard cornmeal/molasses/agar fly foodTong Lab-made
Stereo microscopeNikonSMZ745
SucroseSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.10021418
Vectashield antifade mounting medium with DAPIVectorlabratoryH-1200-10Recommended mounting medium
Fly stocks
y'w* Iso FRT19ATong Lab's fly stocks
y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFPTong Lab's fly stocks
y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFPTong Lab's fly stocks
hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8aTong Lab's fly stocks

Ссылки

  1. Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. Autophagy: Molecular machinery for self-eating. Cell Death & Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).
  2. Jin, S., White, E. Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress. Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).
  3. Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).
  4. Mizushima, N., et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451 (7182), 1069-1075 (2008).
  5. Yang, Z., Klionsky, D. J. Eaten alive: A history of macroautophagy. Nature Cell Biology. 12 (9), 814-822 (2010).
  6. Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. The autophagosome: Origins unknown, biogenesis complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 759-774 (2013).
  7. Klionsky, D. J., Eskelinen, E. L., Deretic, V. Autophagosomes, phagosomes, autolysosomes, phagolysosomes, autophagolysosomes...Wait,I'mconfused. Autophagy. 10 (4), 549-551 (2014).
  8. Zhang, S., Hama, Y., Mizushima, N. The evolution of autophagy proteins-Diversification in eukaryotes and potential ancestors in prokaryotes. Journal of Cell Science. 134 (13), (2021).
  9. Scott, R. C., Schuldiner, O., Neufeld, T. P. Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body. Developmental Cell. 7 (2), 167-178 (2004).
  10. Liu, W., et al. Mitochondrial protein import regulates cytosolic protein homeostasis and neuronal integrity. Autophagy. 14 (8), 1293-1309 (2018).
  11. Ichimura, Y., et al. A ubiquitin-like system mediates protein lipidation. Nature. 408 (6811), 488-492 (2000).
  12. Rusten, T. E., et al. Programmed autophagy in the Drosophila fat body is induced by ecdysone through regulation of the PI3K pathway. Developmental Cell. 7 (2), 179-192 (2004).
  13. Nishida, Y., et al. Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy. Nature. 461 (7264), 654-658 (2009).
  14. Ravikumar, B., et al. Regulation of mammalian autophagy in physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 90 (4), 1383-1435 (2010).
  15. Xie, Z., Nair, U., Klionsky, D. J. Atg8 controls phagophore expansion during autophagosome formation. Molecular Biology of the Cell. 19 (8), 3290-3298 (2008).
  16. Shintani, T., Klionsky, D. J. Cargo proteins facilitate the formation of transport vesicles in the cytoplasm to vacuole targeting pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (29), 29889-29894 (2004).
  17. Russell, R. C., Yuan, H. X., Guan, K. L. Autophagy regulation by nutrient signaling. Cell Research. 24 (1), 42-57 (2014).
  18. Nagy, P., et al. How and why to study autophagy in Drosophila: It's more than just a garbage chute. Methods. 75, 151-161 (2015).
  19. Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59 (3), 499-509 (1989).
  20. Senecoff, J. F., Cox, M. M. Directionality in FLP protein-promoted site-specific recombination is mediated by DNA-DNA pairing. Journal of Biological Chemistry. 261 (16), 7380-7386 (1986).
  21. Germani, F., Bergantinos, C., Johnston, L. A. Mosaic analysis in Drosophila. Genetics. 208 (2), 473-490 (2018).
  22. Zappia, M. P., et al. E2F/Dp inactivation in fat body cells triggers systemic metabolic changes. eLife. 10, 67753 (2021).
  23. Demerec, M. . Biology of Drosophila. , (1965).
  24. Rizki, R. M., et al. Drosophila larval fat body surfaces. Wilhelm Roux's Archives of Developmental Biology. 192 (1), 1-7 (1983).
  25. Szeto, J., et al. ALIS are stress-induced protein storage compartments for substrates of the proteasome and autophagy. Autophagy. 2 (3), 189-199 (2006).
  26. Renna, M., et al. Chemical inducers of autophagy that enhance the clearance of mutant proteins in neurodegenerative diseases. Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11061-11067 (2010).
  27. Guo, S., et al. A large-scale RNA interference screen identifies genes that regulate autophagy at different stages. Scientific Reports. 8, 1-15 (2018).
  28. Tian, W., et al. An antibody for analysis of autophagy induction. Nature Methods. 17 (2), 232-239 (2020).
  29. Nezis, I. P. Selective autophagy in Drosophila. International Journal of Cell Biology. 2012, 146767 (2012).
  30. Chu, Y., et al. Fluorescent materials for monitoring mitochondrial biology. Materials. 14 (15), 4180 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE186

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены