ショウジョウバエメラノガスター幼虫脂肪体における飢餓誘発オートファジーの解析

要約

本プロトコルは、ショ ウジョウバエメラノガスター 幼虫の脂肪体における栄養素の枯渇 による オートファジーの誘導を説明し、トランスジェニックハエ株を使用してオートファジーの変化を分析します。

要約

オートファジーは細胞の自己消化プロセスです。飢餓を含む様々なストレスに応答して分解のためにリソソームに貨物を届ける。オートファジーの機能不全は、老化と複数の人間の病気に関連しています。オートファジー機構は、酵母からヒトまで高度に保存されています。脊椎動物の肝臓および脂肪組織の類似体である ショウジョウバエメラノガスターの幼虫脂肪体は、 in vivoでオートファジーをモニタリングするためのユニークなモデルを提供します。オートファジーは、幼虫の脂肪体の栄養飢餓によって容易に誘発される可能性があります。ほとんどのオートファジー関連遺伝子は ショウジョウバエに保存されています。 タグ付けされたオートファジーマーカーを発現する多くのトランスジェニックハエ株が開発されており、オートファジープロセスのさまざまなステップのモニタリングが容易になっています。クローン解析により、同じ組織片内の異なる遺伝子型を持つ細胞のオートファジーマーカーを綿密に比較することができます。本プロトコルでは、(1)幼虫の脂肪体内で体細胞クローンを作製する手順、(2)アミノ酸飢餓 による オートファジーの誘導、(3)幼虫の脂肪体を解剖する手順を詳述し、オートファゴソームマーカー(GFP-Atg8a)を用いたオートファジーの違いを解析するモデルの作成とクローン解析を目指しています。

概要

オートファジーは、アミノ酸飢餓を含むさまざまなストレスによって引き起こされる「自食」プロセス^です1。マクロオートファジー(以下、オートファジーと呼びます)は、最もよく研究されているタイプのオートファジーであり、細胞の恒常性を維持する上でかけがえのない役割を果たしています²。オートファジーの機能不全は、いくつかのヒト疾患と関連している³。さらに、いくつかのオートファジー関連遺伝子は、さまざまな疾患を治療するための潜在的な標的です⁴。

オートファジーは高度に高度に制御されています⁵.飢餓状態になると、単離膜は細胞質物質を隔離して二重膜オートファゴソームを形成する⁶。次に、オートファゴソームはエンドソームおよびリソソームと融合して、アンフィソームおよびオートリソソームを形成します。リソソーム加水分解酵素の助けを借りて、飲み込まれた細胞質内容物が分解され、栄養素がリサイクルされます⁷。

オートファジーは進化的に保存されたプロセスです⁸。ショ....

プロトコル

1. ショウジョウバエ の交配と産卵

1. 3匹のオス(遺伝子型 hsFLP ubiRFP FRT19A;cgGal4 UAS-GFP-Atg8a)と15匹のメス(遺伝子型 y' w * Mu FRT19A / FM7、Kr GFP )の成虫( 材料の表を参照)を培養バイアル(標準的なコーンミール/糖蜜/寒天ショ ウジョウバエ 培地を25°C)に入れて交配します。
   注:さらなる実験に十分な幼虫を確保するために、同じ交配の複数の培養バイアルをセットアップする必要があります。遺伝子型hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8aを有する雄のハエ株は、セントロメア(FRT19A)近くのX染色体にFRT部位を有する。また、37°Cのヒートショック時のFLPも発現します。 ユビキタスRFP発現を有する導入遺伝子がX染色体に挿入される。GFP-Atg8aは、幼虫脂肪体²²においてcgGal4の制御下で発現している。遺伝子型y' w * Mu FRT19A / FM7、Kr GFPを有する雌のハエ株は、X染色体上に致死的突然変異(Mu)およびFRT19Aを有する。詳細な交差スキームを

結果

摂食条件下では、GFPタグ付きユビキチン様タンパク質GFP-Atg8aが細胞内に拡散します。飢餓状態になると、緑色のプンクタを形成し、オートファゴソームを標識します。オートファゴソームがリソソームと融合すると、GFPは酸性オートリソソームで消光し、緑色の点状突起は消失します。オートファジーが誘導されない場合、またはオートファゴソームの成熟が促進される場合、GFP点状突起の?.......

ディスカッション

本プロトコルは、(1)幼虫の脂肪体に変異クローンを運ぶハエを作製し、(2)アミノ酸飢餓によってオートファジーを誘導し、(3)幼虫の脂肪体を解剖する方法を記載しています。幼虫の脂肪体でクローンを正常に生成するためには、以下の重要なステップを熱心に実行する必要があります。(1)組織が有糸分裂を起こしている場合にのみ有糸分裂の再結合が起こるため、ヒートショックの正確なタ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
#5 Forceps	Dumont	RS-5015
9 Dressions Spot plate	PYREX	7220-85
Fluorescence Microscope	Nikon	SMZ1500
Glycerol	Sangon Biotech	A100854-0100
KCl	Sangon Biotech	A610440-0500	Composition of 1x PBS solution
KH2PO4	Sangon Biotech	A600445-0500	Composition of 1x PBS solution
Laboratory spatula	Fisher	14-375-10
Long forceps	R' DEER	RST-14
Microscope cover glass	CITOTEST	80340-1130
Microscope slides	CITOTEST	80302-2104
Na2HPO4	Sangon Biotech	A501727-0500	Composition of 1x PBS solution
NaCl	Sangon Biotech	A610476-0005	Composition of 1x PBS solution
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Petri dish	Corning	430166
Standard cornmeal/molasses/agar fly food			Tong Lab-made
Stereo microscope	Nikon	SMZ745
Sucrose	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	10021418
Vectashield antifade mounting medium with DAPI	Vectorlabratory	H-1200-10	Recommended mounting medium
Fly stocks
y'w* Iso FRT19A			Tong Lab's fly stocks
y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP			Tong Lab's fly stocks
y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP			Tong Lab's fly stocks
hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a			Tong Lab's fly stocks