בניית פפטידים מחזוריים חודרי תאים לחדירה מוגברת של מחסומים ביולוגיים

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הסינתזה של פפטידים מחזוריים החודרים לתאים עם קישורים צולבים ארומטיים ואת הערכת החדירות שלהם על פני מחסומים ביולוגיים.

Abstract

סרטן היה אתגר גדול בבריאות העולמית. עם זאת, המיקרו-סביבה המורכבת של הגידול בדרך כלל מגבילה את הגישה של טיפולים לתאי גידול עמוקים יותר, מה שמוביל להישנות הגידול. כדי להתגבר על החדירה המוגבלת של מחסומים ביולוגיים, פפטידים חודרי תאים (CPPs) התגלו עם יכולת טרנסלוקציה מעולה של הממברנה והתגלו כמובילים מולקולריים שימושיים להעברת מטענים שונים לתאים. עם זאת, CPPs ליניאריים קונבנציונליים מראים בדרך כלל יציבות פרוטאוליטית פגומה, מה שמגביל את החדירות שלהם על פני מחסומים ביולוגיים. לפיכך, הפיתוח של טרנספורטרים מולקולריים חדשניים שיכולים לחדור מחסומים ביולוגיים ולהפגין יציבות פרוטאוליטית משופרת הוא רצוי מאוד כדי לקדם יעילות אספקת תרופות ביישומים ביו-רפואיים. בעבר סינתזנו פאנל של CPPs מחזוריים קצרים עם קישורים צולבים ארומטיים, שהציגו חדירות מעולה בתאים וברקמות סרטניים בהשוואה למקביליהם הליניאריים. כאן, פרוטוקול תמציתי מתואר לסינתזה של פפטיד פוליארגינין R8 מחזורי המסומן פלואורסצנטית ומקבילו הלינארי, כמו גם שלבי מפתח לחקר חדירות התא שלהם.

Introduction

בעשורים האחרונים חלה התקדמות מהירה בפיתוח פפטידים חודרי תאים (CPP) לאספקת תרופות. CPPs נמצאים בשימוש נרחב כמובילים מולקולריים לטיפול במגוון מחלות מסכנות חיים, כולל הפרעות נוירולוגיות^1,2, מחלות לב³, סוכרת⁴, דרמטוזיס⁵ וסרטן ^6,7. מחלת הסרטן נותרה נטל בריאותי עולמי המלווה בשיעור גבוה של תחלואה ותמותה למרות מאמצי מחקר נרחבים⁸. מכשול רציני לטיפול בסרטן הוא הגישה המוגבלת של טיפולים לתאי גידול עמוקים יותר עקב מחסומים פיזיולוגיים כגון מטריצה חוץ-תאית קומפקטית (ECM), כלי דם גידוליים חריגים, מחסומי ממברנות מרובים ולחץ נוזל אינטרסטיציאלי גבוה (IFP)⁹. לפיכך, פיתוח CPPs חדשניים עם יכולת מעולה להעביר מטענים מעבר למחסומים ביולוגיים נחשב אסטרטגיה חיונית לטיפול בסרטן^10,11.

ניתן לסווג CPPs לקטיון, אמפיפתי והידרופובי במונחים של התכונות הפיזיקוכימיות שלהם¹². בין אלה, פפטיד HIV-TAT טעון חיובי ופוליארגינין סינתטי הם בעלי חשיבות רבה במחקר ביו-רפואי ונחקרו בהרחבה כדי להקל על מתן תרופות תוך תאיות¹³. טונמן ועמיתיו דיווחו כי אורך מינימלי של שמונה ארגינינים חיוני לחדירה יעילה של פפטידים פוליארגינין סינתטיים, בהתבסס על מחקר חדירות תאים שנערך באמצעות פפטידים R3 עד R12¹⁴. עם זאת, ל-CPPs אלה יש בדרך כלל זמן מחצית חיים קצר בפלזמה בשל ההידרוליזה המהירה שלהם in vivo. בנוסף, מעט ידוע על אופטימיזציה של המבנה הכימי של CPPs כדי להגדיל את יכולת מחסום הטרנס שלהם, שכן זה מאתגר לחדור קרומי תאים מרובים¹⁵. לפיכך, פיתוח של טרנספורטרים מולקולריים חדשניים המסוגלים לחדור מחסומים ביולוגיים רצוי מאוד כדי לשפר את יעילות אספקת התרופות. בשנת 2020, Komin et ^al.16 גילו CPP בשם CL peptide, המכיל מוטיב סליל (RLLRLLR) וזנב פוליארגינין (R7) לחציית חד-שכבה אפיתלית. קבוצה של גרסאות פפטיד CL סונתזו גם על ידי שינוי התבנית הסלילית. מחקר זה יכול להיות מדריך משמעותי לפיתוח CPPs חדשניים להובלת מטענים מעבר למחסומים ביולוגיים. יתר על כן, דיטריך ועמיתיו ייעלו את חדירות התאים של פפטיד StAX, ועיכבו את מסלול האיתות Wnt/β-catenin על ידי הגדלת ההידרופוביות הכוללת של הפפטידים¹⁷.

הגבלה קונפורמטיבית של פפטידים ליניאריים לא מובנים על ידי מחזוריות היא דרך יעילה לשפר את היציבות והחדירות הפרוטאוליטית שלהם^18,19,20. החיזוק המבני מגביר את עמידות הפרוטאז של פפטידים מחזוריים, מה שהופך אותם ליציבים יותר ב-vivo בהשוואה למקביליהם הלינאריים. בנוסף, מחזוריות של פפטידים יכולה באופן פוטנציאלי להסוות את עמוד השדרה של הפפטידים הקוטביים על ידי קידום קשרי מימן תוך-מולקולריים, ובכך להגדיל את חדירות הממברנה של הפפטידים²¹. בשני העשורים האחרונים, שיטות מחזוריות כימוסלקטיביות הפכו לאסטרטגיות יעילות לבניית פפטידים מחזוריים עם ארכיטקטורות שונות, כגון כל-פחמימנים, לקטם, טריאזול, m-xylene, perfluoroaryl, וקישורים צולבים אחרים^22,23. המחסום הביולוגי שמטילה המיקרו-סביבה המתוחכמת של הגידול יכול להפחית את חדירת התרופות בגידולים מוצקים²⁴. מצאנו בעבר כי CPPs מחזוריים הפגינו עמידות עדיפה לעיכול אנזימטי על פני עמיתיהם הליניאריים²⁰. יתר על כן, ההידרופוביות הכוללת של הפפטידים היא קריטית לחדירות התאים המשופרת שלהם²². בהתבסס על המחקרים שנדונו לעיל, ניתן לשער כי השילוב של דפוס טעון חיובי, הידרופוביות כללית מוגברת ויציבות פרוטאוליזה משופרת מגביר את החדירות של CPPs על פני מחסומים ביולוגיים. במחקר שנערך לאחרונה, זיהינו שני CPPs מחזוריים עם קישורים ארומטיים במיקומים i ו- i+7 המציגים חדירות משופרת בתאים וברקמות של הגידול בהשוואה למקביליהם הליניאריים¹⁵. כאן, פרוטוקול סינתטי תמציתי לסינתזה של CPPs מחזוריים מסומנים פלואורסצנטית ואת השלבים העיקריים כדי לחקור את החדירות שלהם מוצגים.