Construction de peptides cycliques pénétrant dans les cellules pour une pénétration accrue des barrières biologiques

Résumé

Ce protocole décrit la synthèse de peptides cycliques pénétrant dans les cellules avec des réticulations aromatiques et l’évaluation de leur perméabilité à travers les barrières biologiques.

Résumé

Le cancer a été un grand défi pour la santé mondiale. Cependant, le microenvironnement tumoral complexe limite généralement l’accès des thérapies aux cellules tumorales plus profondes, conduisant à une récidive tumorale. Pour vaincre la pénétration limitée des barrières biologiques, des peptides pénétrant dans les cellules (CPP) ont été découverts avec une excellente capacité de translocation membranaire et sont apparus comme des transporteurs moléculaires utiles pour délivrer diverses cargaisons dans les cellules. Cependant, les CPP linéaires conventionnels présentent généralement une stabilité protéolytique compromise, ce qui limite leur perméabilité à travers les barrières biologiques. Ainsi, le développement de nouveaux transporteurs moléculaires capables de pénétrer les barrières biologiques et de présenter une stabilité protéolytique améliorée est fortement souhaité pour promouvoir l’efficacité de l’administration de médicaments dans des applications biomédicales. Nous avons déjà synthétisé un panel de CPP cycliques courts avec des réticulations aromatiques, qui ont montré une perméabilité supérieure dans les cellules et les tissus cancéreux par rapport à leurs homologues linéaires. Ici, un protocole concis est décrit pour la synthèse du peptide cyclique polyarginine R8 marqué par fluorescence et de son homologue linéaire, ainsi que des étapes clés pour étudier leur perméabilité cellulaire.

Introduction

Les dernières décennies ont vu des progrès rapides dans le développement de peptides pénétrant dans les cellules (CPP) pour l’administration de médicaments. Les CPP ont été largement utilisés comme transporteurs moléculaires pour le traitement d’une gamme de maladies potentiellement mortelles, notamment les troubles neurologiques^1,2, les maladies cardiaques³, le diabète⁴, la dermatose⁵ et le cancer ^6,7. Le cancer reste un fardeau sanitaire mondial accompagné d’un taux élevé de morbidité et de mortalité malgré les efforts de recherche généralisés⁸. Un obstacle sérieux au traitement du cancer est l’accès limité des thérapies aux cellules tumorales plus profondes en raison de barrières physiologiques telles que la matrice extracellulaire compacte (ECM), le système vasculaire tumoral anormal, les barrières membranaires multiples et la pression élevée du liquide interstitiel (IFP)⁹. Ainsi, le développement de nouveaux CPP ayant une capacité supérieure à livrer des cargaisons à travers les barrières biologiques est considéré comme une stratégie essentielle pour le traitement du cancer^10,11.

Les CPP peuvent être classés en CPP cationiques, amphipathiques et hydrophobes en termes de propriétés physico-chimiques¹². Parmi ceux-ci, le peptide VIH-TAT chargé positivement et la polyarginine synthétique sont d’une importance considérable dans la recherche biomédicale et ont été largement étudiés pour faciliter l’administration intracellulaire^{de médicaments 13}. Tunnemann et al. ont rapporté qu’une longueur minimale de huit arginines est essentielle pour une pénétration cellulaire efficace des peptides synthétiques de polyarginine, sur la base d’une étude de perméabilité cellulaire menée à l’aide de peptides R3 à R12¹⁴. Cependant, ces CPP ont généralement des demi-vies plasmatiques courtes en raison de leur hydrolyse rapide in vivo. En outre, on sait peu de choses sur l’optimisation de la structure chimique des CPP afin d’augmenter leur capacité de trans-barrière, car il est difficile de pénétrer dans plusieurs membranes cellulaires¹⁵. Ainsi, le développement de nouveaux transporteurs moléculaires capables de pénétrer les barrières biologiques est fortement souhaité pour améliorer l’efficacité de l’administration des médicaments. En 2020, Komin et ^al.16 ont découvert un CPP appelé peptide CL, qui contient un motif hélicoïdal (RLLRLLR) et une queue de polyarginine (R7) pour traverser la monocouche épithéliale. Un ensemble de variantes peptidiques CL ont également été synthétisées en modifiant le motif hélicoïdal. Cette exploration pourrait être un guide important pour le développement de nouveaux CPP pour la livraison de cargaisons à travers les barrières biologiques. De plus, Dietrich et al. ont optimisé la perméabilité cellulaire du peptide StAX, inhibant la voie de signalisation Wnt / β-caténine en augmentant l’hydrophobicité globale des peptides¹⁷.

La restriction conformationnelle des peptides linéaires non structurés par cyclisation est un moyen efficace d’améliorer leur stabilité protéolytique et leur perméabilité^18,19,20. Le renforcement structurel augmente la résistance à la protéase des peptides cycliques, les rendant plus stables in vivo par rapport à leurs homologues linéaires. De plus, la cyclisation des peptides peut potentiellement masquer le squelette peptidique polaire en favorisant la liaison hydrogène intramoléculaire, augmentant ainsi la perméabilité membranaire des peptides²¹. Au cours des deux dernières décennies, les méthodes de cyclisation chimiosélective sont devenues des stratégies efficaces pour la construction de peptides cycliques avec différentes architectures, telles que tous les hydrocarbures, lactamines, triazoles, m-xylène, perfluoroaryl et autres réticulations^{croisées 22,23}. La barrière biologique imposée par le microenvironnement tumoral sophistiqué pourrait réduire la pénétration des médicaments dans les tumeurs solides²⁴. Nous avons déjà constaté que les CPP cycliques présentaient une résistance supérieure à la digestion enzymatique par rapport à leurs homologues linéaires²⁰. De plus, l’hydrophobicité globale des peptides est essentielle pour améliorer leur perméabilité cellulaire²². D’après les études mentionnées ci-dessus, on peut émettre l’hypothèse que la combinaison d’un profil chargé positivement, d’une hydrophobicité globale élevée et d’une stabilité accrue de la protéolyse augmente la perméabilité des CPP à travers les barrières biologiques. Dans une étude récente, nous avons identifié deux CPP cycliques avec des réticulations aromatiques aux positions i et i+7 qui présentent une perméabilité améliorée dans les cellules et les tissus tumoraux par rapport à leurs homologues linéaires¹⁵. Ici, un protocole synthétique concis pour la synthèse de CPP cycliques marqués par fluorescence et les étapes clés pour étudier leur perméabilité sont présentés.

Protocole

1. Préparation de l’équipement

NOTE: Effectuez toutes les procédures dans une hotte de fonctionnement avec un équipement de protection individuelle approprié.

1. Assembler l’appareil manuel de synthèse peptidique dans la hotte (Figure 1). Placez les robinets d’arrêt à trois voies (voir Tableau des matériaux) sur le collecteur à vide (voir Tableau des matériaux) et connectez-les à l’azote (N₂). Assurez-vous de boucher les entrées inutilisées.
2. Fixer une colonne de polypropylène de 10 ml (voir le tableau des matériaux) sur les robinets d’arrêt à trois voies. Vidangez le mélange réactionnel ou les solvants de la colonne en polypropylène à l’aide d’une ampoule à pipette en caoutchouc ou d’un vide via un piège à déchets.

2. Synthèse du peptide R8 linéaire marqué FITC (FITC-R8) et du peptide R8 agrafé marqué FITC (FITC-sR8-4)

REMARQUE: Les peptides ont été synthétisés selon un protocole standard de synthèse de peptides en phase solide à base de Fmoc (SPPS)²⁵. La résine 4-(2',4'-Diméthoxyphéyl-Fmoc-aminométhyl)-phénoxyacétamido-norleucyl-MBHA (résine MBHA rinkamide, voir le tableau des matériaux) a été utilisée tout au long de l’étude.

ATTENTION: N, N-diméthylformamide (DMF), N, N-diisopropyléthylamine (DIPEA), morpholine et dichlorométhane (DCM) sont tous incolores et sont nocifs s’ils sont inhalés ou absorbés par la peau. L’éther est extrêmement inflammable. Le 1,2-éthanedithiol (EDT) est une substance particulièrement odorante. L’acide trifluoroacétique (AGT) est très corrosif et son acidité est 10 à 5 fois supérieure^à celle de l’acide acétique. Par conséquent, tous les réactifs et produits chimiques sont censés être traités à l’aide d’un équipement de protection dans une hotte.

1. Préparer la résine pour la synthèse peptidique.
   1. Calculer la masse de résine nécessaire à la synthèse :Masse de résine (mg) = échelle (mmol) / capacité de charge de résine (mmol/g) × 1 000 (mg/g)
      REMARQUE : Par exemple, la masse de résine MBHA amide de patinoire (0,572 mmol/g) pour 0,2 mmol = 0,2 mmol / 0,572 mmol/g × 1 000 mg/g = 350 mg.
   2. Ajouter 4-5 mL de DMF à la quantité requise de résine et transférer dans la colonne de polypropylène de 10 mL (étape 1.2) avec un léger bulle de N₂ pendant 30 minutes pour gonfler adéquatement la résine, puis égoutter le DMF.
   3. Ajouter 4-5 mL de morpholine/DMF (v/v) à 50% à la résine, faire doucement des bulles de_N2 pendant 30 min 2x pour éliminer le groupe Fmoc N-terminal, puis égoutter le mélange. Ensuite, lavez soigneusement la résine 3x en ajoutant 4-5 ml de DMF à la colonne et en faisant bouillonner de N₂ pendant au moins 1 min à chaque fois. Continuez à laver la résine avec du DCM (3x) et du DMF (3x) de la même manière.
2. Effectuez le couplage d’acides aminés protégé par Fmoc comme décrit ci-dessous.
   REMARQUE: Le couplage de l’arginine dans une synthèse manuelle à l’échelle de 0,2 mmol est décrit ici à titre d’exemple.
   1. Dissoudre le Fmoc-Arg (Pbf)-OH (5 équivalents, 648,8 mg) et le 2-(7-azobenzotriazole)-N, N, N', N'-hexafluorophosphate de tétraméthyluronium (HATU, 4,9 équiv., 372,6 mg) dans 5 mL de DMF dans un tube à centrifuger.
   2. Ajouter DIPEA (10 équivalents, 348,4 μL) pour activer la réaction de couplage, puis transférer le mélange réactionnel dans la colonne de polypropylène de 10 mL avec de la résine (préparée à l’étape 2.1.3). Ensuite, agiter doucement le mélange avec N 2 bouillonnant pendant_1-2 h.
   3. Répéter la réaction de couplage (étape 2.2.1 et étape 2.2.2) une fois.
   4. Une fois le couplage terminé, égoutter le mélange réactionnel et laver la résine séquentiellement avec DMF, DCM et DMF 3x chacun pendant au moins 1 min à chaque fois.
   5. Effectuer le couplage de chaque acide aminé par étapes ordonnées: Ajouter 4-5 mL de morpholine/DMF (v/v) à 50% à la résine, barboter doucement avec N 2 pendant 30 min 2x pour éliminer le groupe N α-FmoC, puis laver la résine (comme indiqué à l’étape 2.2.4) et procéder au couplage de l’acide aminé suivant (comme indiqué aux étapes 2.2.1 et 2.2.2). Procéder à plusieurs cycles de cette étape pour réaliser la synthèse du peptide désiré.
      REMARQUE: Ce processus peut être suspendu ici. Condenser la résine avec du méthanol et sécher la résine avec un flux continu de_N2. Capter la colonne de polypropylène puis stocker la résine à 4 °C pendant quelques jours (ou à -20 °C pour un stockage plus long). Gonfler la résine avec 4-5 mL de DMF pendant 0,5-1 h avant de commencer une nouvelle synthèse. Si vous passez directement à l’étape suivante, il n’est pas nécessaire de condenser la résine.
3. Étiqueter les peptides avec de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) comme décrit ci-dessous.
   1. Couplez la bêta-alanine comme espaceur pour le marquage FITC en utilisant le même processus que celui utilisé pour le couplage d’acides aminés à l’étape 2.2.
   2. Effectuer le marquage FITC des peptides sur la résine en ajoutant un mélange de FITC (5 équiv.), DIPEA (10 equiv.) et DMF à la colonne de polypropylène et en réagissant dans l’obscurité pendant 8 h.
4. Pour la synthèse de FITC-sR8-4, effectuer la cyclisation du peptide linéaire comme décrit ci-dessous.
   1. Ajouter un mélange de TFA/triisopropylsilane (TIS)/DCM (3/5/92, v/v/v) dans la colonne de polypropylène pendant 2 min pour éliminer sélectivement le groupe protecteur Cys (Trt), puis égoutter le mélange. Répétez la procédure ci-dessus jusqu’à ce que la solution jaunâtre devienne incolore pour éliminer complètement le groupe protecteur Trt.
   2. Par la suite, effectuez des lavages séquentiels de la résine avec DMF et DCM au moins 3x. Ensuite, dissoudre le 4,4'-bis(bromométhyl)biphényle (2 équiv.) dans du DMF avec du DIPEA (4 équiv.), l’ajouter à la colonne et réagir pendant 4 h.
5. Cliver les peptides comme décrit: Une fois la synthèse peptidique terminée, laver la résine avec 4-5 mL de méthanol deux fois pendant 5 minutes chacune et la sécher avec un flux continu de N₂. Traiter la résine avec un cocktail de clivage efficace TFA/TIS/H 2O (95/2,5/2,5, v/v/v), ou TFA/TIS/EDT/_H2O(_92,5/2,5/2,5/2,5, v/v/v/v) pour les peptides contenant des cystéines, en utilisant environ 1 mL de cocktail de clivage pour 100 mg de résine. Traiter la résine liée au peptide pendant 2-3 h pour cliver le peptide, puis retirer le TFA avec précaution avec un jet de N₂.
6. Pour obtenir les peptides bruts, ajouter 4-5 mL d’éther diéthylique à la préparation de peptides clivés pour précipiter les peptides bruts et centrifuger à 10 000 × g pendant 4 min. Jeter soigneusement le surnageant et sécher le peptide à l’air libre pendant 3 minutes dans une hotte efficace.
7. Analyse des peptides : Dissoudre un peptide brut à petite échelle (clivé à partir d’environ 10 mg de résine liée au peptide) dans 800 μL d’acétonitrile (ACN)/_H2O(1/1, v/v), puis analyser par chromatographie liquide haute performance en phase inverse (RP-HPLC) et chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS) (voir Tableau des matériaux).
8. Purifier les peptides en utilisant RP-HPLC et LC-MS.
   1. Dissoudre 50 mg de produit peptidique brut dans 4 mL d’ACN/_H2O(1/1, v/v) et injecter la solution dans un système RP-HPLC équipé d’une colonne C18 (4,6 mm x 150 mm, taille des pores : 120 Å, granulométrie : 4 μm ; voir tableau des matières). Éluer le peptide à l’aide d’une phase mobile contenant 0,1% TFA/_H2O(v/v) et ACN, avec un gradient de 10% à 90% ACN sur 30 min. Des peptides conventionnels ont été détectés à 220 nm et des peptides marqués FITC à 494 nm.
   2. Recueillir les fractions correspondant au pic peptidique majeur tel qu’identifié par la SEP, puis lyophiliser les fractions peptidiques souhaitées. Conserver le peptide purifié à −20 °C.
      NOTE: Les m/z trouvés du FITC-R8 purifié sont les suivants: [M + 3 H]³⁺: 576.63; [M + 4 H] ⁴⁺ : 432,72; [H + 5 H] ⁵⁺ : 346,39; [M + 6 H] ⁶⁺ : 288,85. Les m/z trouvés du FITC-sR8-4 purifié sont les suivants : [M + 3 H]³⁺: 704,74; [M + 4 H] ⁴⁺ : 528,77; [H + 5 H] ⁵⁺ : 423,34; [M + 6 H] ⁶⁺ : 352,91. Conditions d’analyse de la SM: instrument: ESI (polarisation de la sonde: +4,5 kV; détecteur: 1,2 kV); débit de gaz du nébuliseur : 1,5 L/min; ligne de désolvatation courbe (CDL) : −20 V ; Température CDL: 250 °C; température du bloc: 400 °C; débit : 0,2 mL/min; phase mobile: 50% H₂O / 50% ACN.

3. Quantification des peptides marqués FITC

1. Dissoudre une petite quantité de peptide purifié dans du DMSO sous forme de solution mère (p. ex. 40 μmol/mL).
2. Mesurer l’absorbance à 494 nm (A 494) de 2 μL de la solution mère dans₄₉₈ μL de solution saline tamponnée au phosphate de 10 mM (1x PBS, pH 7,4) avec une plaque de microtitrage (voir le tableau des matériaux) à l’aide d’un lecteur de microplaques multi-technologie (voir le tableau des matériaux). Le facteur de dilution est de 500 μL/2 μL = 250, et la longueur de trajet de la plaque de microtitrage est de 0,5 mm.
3. Calculer la concentration de la solution mère à l’aide de la formule suivante:
   Concentration (mM) = A₄₉₄ × facteur de dilution / 0,05 (cm) / 77 000 (cm⁻¹· M⁻1) × 1 000 (mM·M⁻¹)
4. Ajuster à une dilution appropriée de sorte que la valeur mesurée de A₄₉₄ soit comprise entre 0,1 et 1,0.
   NOTE: Les mesures doivent être répétées plusieurs fois pour s’assurer que la concentration mesurée est exacte. Le coefficient d’extinction de 77 000 cm⁻¹· M⁻¹ provient du groupe FITC.

4. Stabilité des peptides dans le sérum fœtal bovin (FBS)

1. Incuber le peptide à une concentration de 100 μM avec 250 μL de FBS/H₂O (v/v) à 250 μL à 37 °C. Après avoir incubé pendant 0 h, 1 h, 2 h et 4 h, prélever 10 μL d’aliquotes, puis ajouter 150 μl d’acide trichloracétique à 12 % dissous dans H₂O/ACN (1/3, v/v) pour précipiter les protéines sériques.
2. Centrifuger les échantillons à 10 000 × g pendant 5 min et analyser le surnageant à l’aide de CLHP (comme décrit à l’étape 2.8) pour déterminer l’étendue de la dégradation peptidique.
3. Calculer le rapport de l’aire du pic à 1 h, 2 h et 4 h à celui à 0 h pour obtenir la fraction de peptide non dégradé au moment correspondant. Le résultat est la moyenne de trois échantillons parallèles.

5. Absorption cellulaire des peptides

1. Imagerie microscopique à fluorescence
   1. Placez une lamelle de couverture ronde dans une plaque de 12 puits. Ensuite, inoculer 1 x 10⁵ cellules uniformément sur des lames de couverture et cultiver pendant la nuit avec 2 mL de milieu. Retirez le milieu et lavez les cellules 3x avec 1 mL de PBS.
      REMARQUE : Dans cette étude, des cellules HeLa et des cellules 4T1 ont été cultivées dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, voir le tableau des matériaux) complété par 10 % de FBS dans un incubateur humidifié à 37 °C contenant 5 % de CO₂.
   2. Incuber les cellules avec 1 mL de 3 μM de peptides marqués FITC dans du DMEM sans FBS pendant 1 h à 37 °C. Ensuite, retirez le milieu contenant des peptides et lavez les cellules 3x avec 1 mL de PBS.
   3. Colorer les cellules avec 1 mL de Hoechst 33258 pendant 15 min. Observez l’internalisation de chaque peptide à l’aide d’un microscope à fluorescence (voir le tableau des matériaux) avec la même intensité de fluorescence et le même temps d’exposition.
      REMARQUE: Les paramètres suivants ont été utilisés pour la microscopie à fluorescence. Objectif: Plan-Apochromat: 63 x / 1.40 huile DIC M27; Canal 1 pour FITC: filtre d’excitation: 450-490 nm, filtre d’émission: 500-550 nm, temps d’exposition: 230 ms; Canal 2 pour Hoechst 33258 : filtre d’excitation : 335-383 nm, filtre d’émission : 420-470 nm, temps d’exposition : 27 ms.
2. Analyse de cytométrie en flux
   1. Inoculer 5 x 10⁵ cellules HeLa uniformément dans des plaques à 12 puits et les cultiver dans du DMEM pendant 24 h à 37 °C. Ensuite, retirez le milieu et lavez les cellules 3x avec 1 mL de PBS.
   2. Incuber les cellules avec 1 mL de 3 μM de peptides marqués FITC dans du DMEM sans FBS pendant 1 h à 37 °C. Retirer le milieu contenant des peptides, dissocier les cellules avec 0,25% (p/v) de trypsine et 0,53 mM d’EDTA dans du PBS pendant 5 min, puis recueillir les cellules par centrifugation à 306 × g pendant 4 min. Lavez la pastille de cellule avec du PBS.
   3. Incuber les cellules avec 1 mL de bleu de trypan à 0,05 % (p/v) dans du PBS pendant 3 minutes pour éteindre la fluorescence liée à la surface et effectuer une analyse quantitative de la fluorescence intracellulaire à l’aide d’un cytomètre en flux (voir le tableau des matériaux).
      NOTE: Paramètres de cytométrie de flux: excitation: 488 nm, émission: 530 nm. Le bleu de trypan peut également éteindre la fluorescence des cellules mortes et aider à distinguer les cellules vivantes / mortes lors de l’analyse de l’absorption des peptides.
   4. Traiter et doser les cellules 4T1 à l’aide de la cytométrie en flux en suivant le même protocole que celui décrit pour les cellules HeLa. Prélever 5 x 10⁵ cellules par échantillon et constituer trois échantillons parallèles par groupe.

6. Exploration de la pénétration intercellulaire des peptides à l’aide de modèles transwell

1. Inoculer 1 x 10 5 cellules HeLa dans 2 mL de DMEM dans une chambre de 12 puits avec un insert de plaque de culture tissulaire (voir le tableau des matériaux) et incuber pendant 24 h dans un incubateur humidifié à 37 °C contenant⁵% de CO₂. Ensuite, retirez le milieu et incuber les cellules dans les chambres avec 1 mL de 10 μM FITC-R8 ou FITC-sR8-4 (purifié par HPLC) dans du DMEM sans FBS pendant 1 h.
2. Retirer le milieu contenant les peptides et laver les cellules 3x avec 1 mL de PBS. Ajouter 1 mL de DMEM frais sans FBS dans les chambres, puis co-incuber les cellules HeLa dans la chambre avec l’insert de plaque de culture tissulaire avec les cellules HeLa sur les lamelles rondes au fond pendant 2 h.
3. Fixez les cellules HeLa sur les lamelles rondes avec 2,5% de glutaraldéhyde pendant 15 min, puis colorez les cellules avec DAPI pendant 15 min. Ensuite, observez les cellules HeLa sur les lames de couverture sous un microscope à fluorescence. Traiter et doser les cellules 4T1 en utilisant le même protocole que celui utilisé pour les cellules HeLa.

Résultats

Dans ce protocole, une procédure synthétique pour contraindre la polyarginine linéaire R8 dans sa forme cyclique a été présentée. Le SPPS a été effectué manuellement à l’aide d’un appareil simple (figure 1). Le procédé synthétique détaillé de SPPS est illustré à la figure 2. Brièvement, la résine a été suffisamment gonflée, suivie d’une déprotection du groupe protecteur N α-FmoC. Ensuite, l’acide^<...

Discussion

La stabilisation chimique des peptides par l’incorporation de contraintes conformationnelles s’est avérée être une stratégie efficace pour améliorer la stabilité et la perméabilité cellulaire du peptide²⁶. Dans ce protocole, une procédure étape par étape est décrite pour la synthèse de CPP cycliques avec des réticulations aromatiques et l’évaluation de leur perméabilité à travers les barrières biologiques. Par rapport aux réticulations hydrophiles lactamines ou triazoles<...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-ethanedithiol	Aladdin	K1722093	stench
2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU)	HEOWNS	A-0443697
4,4'-bis(bromomethyl)biphenyl	TCI	B1921
4T1 cells	ATCC		4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2.
Acetonitrile	Adamas	1484971	toxicity
Dichloromethane	Energy	W330229	skin harmful
Diethyl ether	Aldrich	673811	flammable
Dimethyl sulfoxide	Beyotime	ST038	skin harmful
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco
Electrospray Ionization Mass Spectrometer	Waters	G2-S Tof
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)	BioFroxx	1340
Fetal bovine serum (FBS)	HyClone
Flow cytometer	Beckman Coulter	CytoFLEX
Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC)	Energy	E0801812500
Fluorescent microscope	Carl Zeiss	Axio Observer 7
Fmoc-Arg(Pbf)-OH	HEOWNS	F-81070
Fmoc-Cys(Trt)-OH	GL Biochem	GLS201115-35202
Fmoc-βAla-OH	Adamas	51341C
HeLa cells	ATCC		HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2.
High-Performance Liquid Chromatography	Agilent	Agilent 1260
High-Performance Liquid Chromatography column	Agilent	Poroshell EC-C18 120, 4.6 × 150 mm (pore size 120 Å, particle size 4 μm)
Lyophilizer	SP Scientific	Vir Tis
Methanol	Aldrich	9758	toxicity
Microtiter plate	Thermo μdrop plate	N12391
Morpholine	HEOWNS	M99040	irritant
Multi-technology microplate reader	Thermo	VARIOSKAN LUX
N,N-Diisopropylethylamine	HEOWNS	E-81416	irritant
N,N-Dimethyl formamide	Energy	B020051	harmful to skin
Poly-Prep column	Bio-Rad	7321010	polypropylene chromatography columns
Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g)	GL Biochem	GLS180301-49101
Three-way stopcocks	Bio-Rad	7328107
Tissue culture plate insert	LABSELECT	14211
Trifluoroacetic acid	HEOWNS	T63278	corrosive
Triisopropylsilane	HEOWNS	T-0284475
Trypsin	BioFroxx	1004
Vacuum manifold	Promega	A7231