Construção de Peptídeos Cíclicos Penetrantes em Células para Maior Penetração de Barreiras Biológicas

Resumo

Este protocolo descreve a síntese de peptídeos cíclicos penetrantes em células com ligações cruzadas aromáticas e a avaliação de sua permeabilidade através de barreiras biológicas.

Resumo

O câncer tem sido um grande desafio na saúde global. No entanto, o complexo microambiente tumoral geralmente limita o acesso da terapêutica a células tumorais mais profundas, levando à recorrência tumoral. Para vencer a penetração limitada de barreiras biológicas, peptídeos penetrantes de células (CPPs) foram descobertos com excelente capacidade de translocação de membrana e emergiram como transportadores moleculares úteis para entregar várias cargas nas células. No entanto, as PPCs lineares convencionais geralmente apresentam estabilidade proteolítica comprometida, o que limita sua permeabilidade através de barreiras biológicas. Assim, o desenvolvimento de novos transportadores moleculares que possam penetrar em barreiras biológicas e exibir maior estabilidade proteolítica é altamente desejado para promover a eficiência na liberação de fármacos em aplicações biomédicas. Nós sintetizamos previamente um painel de CPPs cíclicos curtos com ligações cruzadas aromáticas, que exibiram permeabilidade superior em células e tecidos cancerosos em comparação com seus homólogos lineares. Aqui, um protocolo conciso é descrito para a síntese do peptídeo R8 cíclico de poliarginina fluorescentemente marcado e sua contraparte linear, bem como os principais passos para investigar sua permeabilidade celular.

Introdução

As últimas décadas testemunharam rápidos avanços no desenvolvimento de peptídeos penetrantes em células (CPPs) para liberação de fármacos. As PPCs têm sido amplamente utilizadas como transportadores moleculares para o tratamento de uma série de doenças potencialmente fatais, incluindo distúrbios neurológicos^1,2, doenças cardíacas³, diabetes⁴, dermatoses⁵ e câncer ^6,7. O câncer continua sendo um fardo de saúde global acompanhado por uma alta taxa de morbidade e mortalidade, apesar dos amplos esforços de pesquisa⁸. Um sério obstáculo ao tratamento do câncer é o acesso limitado da terapêutica a células tumorais mais profundas devido a barreiras fisiológicas, como matriz extracelular compacta (MEC), vasculatura tumoral anormal, múltiplas barreiras de membrana e alta pressão do fluido intersticial (IFP)⁹. Assim, o desenvolvimento de novas PPCs com capacidade superior de entregar cargas através de barreiras biológicas é considerado uma estratégia essencial para o tratamento do câncer^10,11.

As PPCs podem ser classificadas em catiônicas, anfipáticas e hidrofóbicas em termos de suas propriedades físico-químicas¹². Dentre estes, o peptídeo HIV-TAT carregado positivamente e a poliarginina sintética são de considerável importância na pesquisa biomédica e têm sido extensivamente estudados para facilitar a liberação intracelular de fármacos¹³. Tunnemann e col. relataram que um comprimento mínimo de oito argininas é essencial para a penetração celular eficiente dos peptídeos sintéticos de poliarginina, com base em um estudo de permeabilidade celular realizado usando peptídeos R3 a^{R12 14}. No entanto, essas PPCs geralmente têm meias-vidas plasmáticas curtas devido à sua rápida hidrólise in vivo. Além disso, pouco se sabe sobre a otimização da estrutura química das PPCs para aumentar sua capacidade de transbarreira, uma vez que é um desafio penetrar em múltiplas membranas celulares¹⁵. Assim, o desenvolvimento de novos transportadores moleculares capazes de penetrar barreiras biológicas é fortemente desejado para aumentar a eficiência da liberação de fármacos. Em 2020, Komin et ^al.16 descobriram um CPP chamado peptídeo CL, que contém um motivo de hélice (RLLRLLR) e uma cauda de poliarginina (R7) para cruzar a monocamada epitelial. Um conjunto de variantes peptídicas CL também foram sintetizadas alterando o padrão helicoidal. Esta exploração pode ser um guia significativo para o desenvolvimento de novos CPPs para a entrega de cargas através de barreiras biológicas. Além disso, Dietrich e col. otimizaram a permeabilidade celular do peptídeo StAX, inibindo a via de sinalização Wnt/β-catenina por aumentar a hidrofobicidade global dos peptídeos¹⁷.

A restrição conformacional de peptídeos lineares não estruturados por ciclização é uma maneira eficaz de aumentar sua estabilidade proteolítica e permeablidade^18,19,20. O reforço estrutural aumenta a resistência às proteases dos peptídeos cíclicos, tornando-os mais estáveis in vivo em comparação com seus equivalentes lineares. Além disso, a ciclização de peptídeos pode potencialmente mascarar a espinha dorsal do peptídeo polar por promover a ligação intramolecular de hidrogênio, aumentando assim a permeabilidade da membrana dos peptídeos²¹. Nas últimas duas décadas, métodos quimiosseletivos de ciclização tornaram-se estratégias eficazes para a construção de peptídeos cíclicos com diferentes arquiteturas, como hidrocarbonetos, lactâmicos, triazóis, m-xileno, perfluoroaril e outras ligações cruzadas^22,23. A barreira biológica imposta pelo sofisticado microambiente tumoral poderia reduzir a penetração de fármacos em tumores^sólidos24. Verificamos anteriormente que as PPCs cíclicas apresentaram resistência superior à digestão enzimática em relação às suas contrapartes lineares²⁰. Além disso, a hidrofobicidade global dos peptídeos é crítica para sua maior permeabilidade celular²². Com base nos estudos discutidos acima, a combinação de um padrão carregado positivamente, hidrofobicidade global elevada e maior estabilidade da proteólise pode ser hipotetizada para aumentar a permeabilidade das PPCs através de barreiras biológicas. Em um estudo recente, identificamos duas CPPs cíclicas com ligações cruzadas aromáticas nas posições i e i+7 que exibem melhor permeabilidade em células e tecidos tumorais em comparação com suas contrapartes lineares¹⁵. Aqui, um protocolo sintético conciso para a síntese de CPPs cíclicas marcadas fluorescentemente e os principais passos para investigar sua permeabilidade são apresentados.

Protocolo

1. Preparação do equipamento

OBS: Realizar todos os procedimentos em exaustor de operação com equipamentos de proteção individual adequados.

1. Montar o aparelho manual de síntese de peptídeos na capela de fumaça (Figura 1). Coloque as torneiras de três vias (ver Tabela de Materiais) no coletor de vácuo (ver Tabela de Materiais) e conecte-as ao nitrogênio (N₂). Certifique-se de tampar as entradas não utilizadas.
2. Fixe uma coluna de polipropileno de 10 ml (ver Tabela de Materiais) nas torneiras de três vias. Escorra a mistura de reacção ou solventes da coluna de polipropileno utilizando um bulbo de pipeta de borracha ou um vácuo através de uma armadilha de resíduos.

2. Síntese do peptídeo R8 linear marcado com FITC (FITC-R8) e do peptídeo R8 grampeado marcado com FITC (FITC-sR8-4)

NOTA: Os peptídeos foram sintetizados de acordo com um protocolo padrão de síntese de peptídeos em fase sólida (SPPS) baseado em Fmoc²⁵. A resina 4-(2',4'-Dimetoxifeil-Fmoc-aminometil)-fenoxiacetamido-norleucil-MBHA (resina de MBHA de amida de rinque, ver Tabela de Materiais) foi usada durante todo o estudo.

CUIDADO: N, N-dimetilformamida (DMF), N, N-diisopropiletilamina (DIPEA), morfolina e diclorometano (DCM) são todos incolores e são prejudiciais se inalados ou absorvidos através da pele. O éter é extremamente inflamável. O 1,2-etaniol (EDT) é uma substância particularmente odorífera. O ácido trifluoroacético (TFA) é altamente corrosivo, e sua acidez é de 10 a^{5 vezes a} do ácido acético. Consequentemente, todos os reagentes e produtos químicos devem ser tratados com o uso de equipamentos de proteção em uma capela de fumaça.

1. Preparar a resina para síntese de peptídeos.
   1. Calcular a massa de resina necessária para a síntese:Massa de resina (mg) = escala (mmol) / capacidade de carga de resina (mmol/g) × 1.000 (mg/g)
      NOTA: Por exemplo, a massa da resina MBHA de amida de rinque (0,572 mmol/g) para 0,2 mmol = 0,2 mmol / 0,572 mmol/g × 1.000 mg/g = 350 mg.
   2. Adicionar 4-5 mL de DMF à quantidade necessária de resina e transferir para a coluna de polipropileno de 10 mL (passo 1.2) com borbulhamento suave de N₂ por 30 min para inchar adequadamente a resina e, em seguida, drenar o DMF.
   3. Adicionar 4-5 mL de morfolina/DMF a 50% (v/v) à resina, borbulhar suavemente N₂ por 30 min 2x para remover o grupo Fmoc N-terminal e, em seguida, drenar a mistura. Em seguida, lave bem a resina 3x adicionando 4-5 mL de DMF à coluna e borbulhando com N₂ por pelo menos 1 min de cada vez. Continue a lavar a resina com DCM (3x) e DMF (3x) da mesma forma.
2. Execute o acoplamento de aminoácidos protegido por Fmoc conforme descrito abaixo.
   NOTA: O acoplamento de arginina em uma síntese manual em escala de 0,2 mmol é descrito aqui como um exemplo.
   1. Dissolver Fmoc-Arg (Pbf)-OH (5 equiv., 648,8 mg) e 2-(7-azobenzotriazol)-N, N, N', N'-tetrametilurônio hexafluorofosfato (HATU, 4,9 equiv., 372,6 mg) em 5 mL de DMF em um tubo de centrífuga.
   2. Adicionar DIPEA (10 equiv., 348,4 μL) para activar a reacção de acoplamento e, em seguida, transferir a mistura reactiva para a coluna de polipropileno de 10 ml com resina (preparada no passo 2.1.3). Em seguida, agite suavemente a mistura com N 2 borbulhando por_1-2 h.
   3. Repetir a reacção de engate (passo 2.2.1 e passo 2.2.2) uma vez.
   4. Após a conclusão do acoplamento, drene a mistura de reação e lave a resina sequencialmente com DMF, DCM e DMF 3x cada por pelo menos 1 min cada vez.
   5. Realizar o acoplamento de cada aminoácido em etapas ordenadas: Adicionar 4-5 mL de morfolina/DMF a 50% (v/v) à resina, borbulhar suavemente com N 2 por 30 min 2x para remover o grupo N α-Fmoc, depois lavar a resina (como mostrado na etapa 2.2.4) e proceder ao acoplamento do próximo aminoácido (conforme mostrado nas etapas 2.2.1 e 2.2.2). Prossiga com vários ciclos desta etapa para alcançar a síntese do peptídeo desejado.
      NOTA: Este processo pode ser pausado aqui. Condensar a resina com metanol e secar a resina com um fluxo contínuo de N₂. Tampe a coluna de polipropileno e, em seguida, armazene a resina a 4 °C por alguns dias (ou a -20 °C para armazenamento mais longo). Inchar a resina com 4-5 mL de DMF por 0,5-1 h antes de iniciar uma nova síntese. Se avançar diretamente para a próxima etapa, não há necessidade de condensar a resina.
3. Rotular os peptídeos com isotiocianato de fluoresceína (FITC) conforme descrito abaixo.
   1. Acoplar a beta-alanina como espaçador para marcação FITC usando o mesmo processo usado para acoplamento de aminoácidos na etapa 2.2.
   2. Realizar a marcação FITC de peptídeos na resina adicionando uma mistura de FITC (5 equiv.), DIPEA (10 equiv.) e DMF à coluna de polipropileno e reagindo no escuro por 8 h.
4. Para a síntese do FITC-sR8-4, realizar a ciclização do peptídeo linear conforme descrito abaixo.
   1. Adicionar uma mistura de TFA/triisopropilsilano (TIS)/DCM (3/5/92, v/v/v) à coluna de polipropileno durante 2 minutos para remover selectivamente o grupo protector Cys (Trt) e, em seguida, drenar a mistura. Repita o procedimento acima até que a solução amarelada se torne incolor para remover completamente o grupo protetor Trt.
   2. Em seguida, realizar lavagens sequenciais da resina com DMF e DCM pelo menos 3x. Em seguida, dissolver 4,4'-bis(bromometil)bifenil (2 equiv.) em DMF com DIPEA (4 equiv.), adicioná-lo à coluna e reagir por 4 h.
5. Clivar os peptídeos conforme descrito: Após a conclusão da síntese peptídica, lavar a resina com 4-5 mL de metanol duas vezes por 5 min cada e secá-la com um fluxo contínuo de N₂. Trate a resina com um coquetel de clivagem eficaz TFA/TIS/H 2 O (95/2,5/2,5, v/v/v), ou TFA/TIS/EDT/H 2 O (_92,5/2,5/2,5/2,5, v/v/v/v) para peptídeos contendo cisteínas, usando aproximadamente 1 mL de coquetel de clivagem para cada 100 mg de resina. Trate a resina ligada ao peptídeo por 2-3 h para clivar o peptídeo e, em seguida, remover o TFA cuidadosamente com uma corrente de N₂.
6. Para obter os peptídeos brutos, adicione 4-5 mL de éter dietílico à preparação peptídica clivada para precipitar os peptídeos brutos e centrifugar a 10.000 × g por 4 min. Descarte cuidadosamente o sobrenadante e seque o peptídeo ao ar por 3 minutos em uma exaustora eficaz.
7. Análise dos peptídeos: Dissolver um peptídeo bruto em pequena escala (clivado de aproximadamente 10 mg de resina ligada a peptídeos) em 800 μL de acetonitrila (ACN)/H₂O (1/1, v/v) e, em seguida, analisar usando cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (RP-HPLC) e cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS) (ver Tabela de Materiais).
8. Purificar os peptídeos usando RP-HPLC e LC-MS.
   1. Dissolver 50 mg de produto peptídico bruto em 4 ml de ACN/H₂O (1/1, v/v) e injetar a solução num sistema RP-HPLC equipado com uma coluna C18 (4,6 mm x 150 mm, tamanho dos poros: 120 Å, tamanho da partícula: 4 μm; ver Tabela de Materiais). Eluir o peptídeo usando uma fase móvel contendo 0,1% TFA/H₂O (v/v) e ACN, com um gradiente de 10% a 90% ACN ao longo de 30 min. Peptídeos convencionais foram detectados a 220 nm e peptídeos marcados com FITC a 494 nm.
   2. Coletar as frações correspondentes ao pico peptídico principal identificado por MS e, em seguida, liofilizar as frações peptídicas desejadas. Conservar o péptido purificado a -20 °C.
      NOTA: Os m/z encontrados do FITC-R8 purificado são os seguintes: [M + 3 H]³⁺: 576,63; [M + 4 H] ⁴⁺: 432,72; [M + 5 H] ⁵⁺: 346,39; [M + 6 H] ⁶⁺: 288,85. Os m/z encontrados do FITC-sR8-4 purificado são os seguintes: [M + 3 H]³⁺: 704,74; [M + 4 H] ⁴⁺: 528,77; [M + 5 H] ⁵⁺: 423,34; [M + 6 H] ⁶⁺: 352,91. Condições analíticas de EM: instrumento: ESI (viés de sonda: +4,5 kV; detector: 1,2 kV); fluxo de gás do nebulizador: 1,5 L/min; linha de desolvação curva (CDL): −20 V; Temperatura CDL: 250 °C; temperatura do bloco: 400 °C; vazão: 0,2 mL/min; fase móvel: 50% H₂O/50% ACN.

3. Quantificação dos peptídeos marcados com FITC

1. Dissolva uma pequena quantidade de peptídeo purificado em DMSO como solução estoque (por exemplo, 40 μmol/mL).
2. Medir a absorbância a 494 nm (A 494) de 2 μL da solução-mãe em₄₉₈ μL de solução salina tamponada com fosfato 10 mM (1x PBS, pH 7,4) com uma placa de microtitulação (ver Tabela de Materiais) utilizando um leitor de microplacas multitecnologia (ver Tabela de Materiais). O fator de diluição é de 500 μL/ 2 μL = 250, e o comprimento do caminho da placa de microtitulação é de 0,5 mm.
3. Calcular a concentração da solução-mãe utilizando a seguinte fórmula:
   Concentração (mM) = A₄₉₄ × fator de diluição / 0,05 (cm) / 77.000 (cm⁻¹· M−1) × 1.000 (mM·M⁻¹)
4. Ajustar a uma diluição adequada de modo a que o valor A₄₉₄ medido se situe entre 0,1 e 1,0.
   NOTA: As medições devem ser repetidas várias vezes para garantir que a concentração medida é precisa. O coeficiente de extinção de 77.000 cm⁻¹· M⁻¹ surge do grupo FITC.

4. Estabilidade de peptídeos no soro fetal bovino (SFB)

1. Incubar o peptídeo a uma concentração de 100 μM com 250 μL de 25% FBS/H₂O (v/v) a 37 °C. Depois de incubar por 0 h, 1 h, 2 h e 4 h, tomar alíquotas de 10 μL e, em seguida, adicionar 150 μl de ácido tricloroacético a 12% dissolvido em H₂O/ACN (1/3, v/v) para precipitar as proteínas séricas.
2. Centrifugar as amostras a 10.000 × g durante 5 minutos e analisar o sobrenadante utilizando HPLC (conforme descrito no passo 2.8) para determinar a extensão da degradação do péptide.
3. Calcular a razão entre a área do pico em 1 h, 2 h e 4 h e aquela em 0 h para obter a fração de peptídeo não degradado no tempo correspondente. O resultado é a média de três amostras paralelas.

5. Captação celular dos peptídeos

1. Imagem microscópica de fluorescência
   1. Coloque uma tampa redonda em uma placa de 12 poços. Em seguida, inocular 1 x 10⁵ células uniformemente nas lamínulas e cultivar durante a noite com 2 mL de meio. Retire o meio e lave as células 3x com 1 mL de PBS.
      NOTA: Neste estudo, células HeLa e células 4T1 foram cultivadas em meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM, ver Tabela de Materiais) suplementado com 10% de FBS em uma incubadora umidificada a 37 °C contendo 5% de CO₂.
   2. Incubar as células com 1 mL de peptídeos marcados com FITC 3 μM em DMEM livre de FBS por 1 h a 37 °C. Em seguida, remova o meio contendo peptídeo e lave as células 3x com 1 mL de PBS.
   3. Manchar as células com 1 mL de Hoechst 33258 por 15 min. Observe a internalização de cada peptídeo usando um microscópio de fluorescência (ver Tabela de Materiais) com a mesma intensidade de fluorescência e tempo de exposição.
      NOTA: As seguintes configurações foram usadas para microscopia de fluorescência. Objetivo: Plano-Apócroma: 63 x/1,40 óleo DIC M27; Canal 1 para FITC: filtro de excitação: 450-490 nm, filtro de emissão: 500-550 nm, tempo de exposição: 230 ms; Canal 2 para Hoechst 33258: filtro de excitação: 335-383 nm, filtro de emissão: 420-470 nm, tempo de exposição: 27 ms.
2. Análise por citometria de fluxo
   1. Inocular 5 x 10⁵ células HeLa uniformemente em placas de 12 poços e cultura em DMEM por 24 h a 37 °C. Em seguida, retire o meio e lave as células 3x com 1 mL de PBS.
   2. Incubar as células com 1 mL de peptídeos marcados com FITC 3 μM em DMEM livre de FBS por 1 h a 37 °C. Remover o meio contendo peptídeo, dissociar as células com tripsina 0,25% (p/v) e EDTA 0,53 mM em PBS por 5 min e, em seguida, coletar as células por centrifugação a 306 × g por 4 min. Lave o pellet de células com PBS.
   3. Incubar as células com 1 mL de azul de tripano a 0,05% (p/v) em PBS por 3 min para extinguir a fluorescência ligada à superfície e realizar análise quantitativa da fluorescência intracelular usando um citômetro de fluxo (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: Configurações de citometria de fluxo: excitação: 488 nm, emissão: 530 nm. O azul de tripano também pode extinguir a fluorescência de células mortas e ajudar a distinguir células vivas / mortas durante a análise da captação de peptídeos.
   4. Tratar e testar células 4T1 usando citometria de fluxo seguindo o mesmo protocolo descrito para células HeLa. Coletar 5 x 10⁵ células por amostra e configurar três amostras paralelas por grupo.

6. Exploração da penetração célula-célula dos peptídeos utilizando modelos transwell

1. Inocular 1 x 10⁵ células HeLa em 2 mL de DMEM em uma câmara de 12 poços com uma inserção de placa de cultura de tecidos (ver Tabela de Materiais) e incubar por 24 h em uma incubadora umidificada a 37 °C contendo 5% de CO₂. Em seguida, remover o meio e incubar as células nas câmaras com 1 mL de FITC-R8 10 μM ou FITC-sR8-4 (purificado por HPLC) em DMEM livre de FBS por 1 h.
2. Retire o meio que contém os peptídeos e lave as células 3x com 1 mL de PBS. Adicionar 1 mL de DMEM fresco livre de FBS às câmaras e, em seguida, co-incubar as células HeLa na câmara com a placa de cultura de tecidos inserida com as células HeLa nas lamínulas redondas na parte inferior por 2 h.
3. Fixar as células HeLa nas lamínulas redondas com glutaraldeído a 2,5% durante 15 min e, em seguida, corar as células com DAPI durante 15 min. Em seguida, observe as células HeLa nas lamínulas sob um microscópio de fluorescência. Tratar e testar células 4T1 usando o mesmo protocolo usado para células HeLa.

Resultados

Neste protocolo, um procedimento sintético para restringir a poliarginina linear R8 em sua forma cíclica foi apresentado. A SPPS foi realizada manualmente, utilizando-se aparelho simples (Figura 1). O processo sintético detalhado da SPPS é mostrado na Figura 2. Resumidamente, a resina estava suficientemente inchada, seguida pela desproteção do grupo protetor N α-Fmoc. Em seguida, o aminoácido N α-Fmoc protegido foi ancorado n...

Discussão

A estabilização química de peptídeos pela incorporação de restrições conformacionais tem se mostrado uma estratégia eficaz para melhorar a estabilidade e a permeabilidade celular do peptídeo²⁶. Neste protocolo, um procedimento passo-a-passo é descrito para a síntese de CPPs cíclicas com ligações cruzadas aromáticas e a avaliação de sua permeabilidade através de barreiras biológicas. Comparada às ligações cruzadas hidrofílicas lactâmicas ou triazólicas22,27, a incorporaç?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-ethanedithiol	Aladdin	K1722093	stench
2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU)	HEOWNS	A-0443697
4,4'-bis(bromomethyl)biphenyl	TCI	B1921
4T1 cells	ATCC		4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2.
Acetonitrile	Adamas	1484971	toxicity
Dichloromethane	Energy	W330229	skin harmful
Diethyl ether	Aldrich	673811	flammable
Dimethyl sulfoxide	Beyotime	ST038	skin harmful
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco
Electrospray Ionization Mass Spectrometer	Waters	G2-S Tof
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)	BioFroxx	1340
Fetal bovine serum (FBS)	HyClone
Flow cytometer	Beckman Coulter	CytoFLEX
Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC)	Energy	E0801812500
Fluorescent microscope	Carl Zeiss	Axio Observer 7
Fmoc-Arg(Pbf)-OH	HEOWNS	F-81070
Fmoc-Cys(Trt)-OH	GL Biochem	GLS201115-35202
Fmoc-βAla-OH	Adamas	51341C
HeLa cells	ATCC		HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2.
High-Performance Liquid Chromatography	Agilent	Agilent 1260
High-Performance Liquid Chromatography column	Agilent	Poroshell EC-C18 120, 4.6 × 150 mm (pore size 120 Å, particle size 4 μm)
Lyophilizer	SP Scientific	Vir Tis
Methanol	Aldrich	9758	toxicity
Microtiter plate	Thermo μdrop plate	N12391
Morpholine	HEOWNS	M99040	irritant
Multi-technology microplate reader	Thermo	VARIOSKAN LUX
N,N-Diisopropylethylamine	HEOWNS	E-81416	irritant
N,N-Dimethyl formamide	Energy	B020051	harmful to skin
Poly-Prep column	Bio-Rad	7321010	polypropylene chromatography columns
Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g)	GL Biochem	GLS180301-49101
Three-way stopcocks	Bio-Rad	7328107
Tissue culture plate insert	LABSELECT	14211
Trifluoroacetic acid	HEOWNS	T63278	corrosive
Triisopropylsilane	HEOWNS	T-0284475
Trypsin	BioFroxx	1004
Vacuum manifold	Promega	A7231