构建环状细胞穿透肽以增强生物屏障的穿透力

摘要

该协议描述了具有芳香交联的环细胞穿透肽的合成以及它们跨生物屏障的渗透性的评估。

摘要

癌症一直是全球卫生领域的一大挑战。然而，复杂的肿瘤微环境通常会限制治疗药物进入更深的肿瘤细胞，导致肿瘤复发。为了克服生物屏障的有限渗透，已经发现了具有出色膜易位能力的细胞穿透肽（CPP），并已成为将各种货物输送到细胞中的有用分子转运蛋白。然而，传统的线性CPP通常表现出蛋白水解稳定性受损，这限制了它们跨越生物屏障的渗透性。因此，开发能够穿透生物屏障并表现出增强的蛋白水解稳定性的新型分子转运蛋白是非常需要的，以促进生物医学应用中的药物递送效率。我们之前已经合成了一组具有芳香交联的短环CPP，与线性对应物相比，其在癌细胞和组织中表现出优异的渗透性。在这里，描述了用于合成荧光标记的环状精氨酸R8肽及其线性对应物的简明方案，以及研究其细胞通透性的关键步骤。

引言

在过去的几十年里，用于药物递送的细胞穿透肽（CPP）的开发取得了快速进展。CPP已被广泛用作分子转运蛋白，用于治疗一系列危及生命的疾病，包括神经系统疾病¹，²，心脏病³，糖尿病⁴，皮肤病⁵和癌症^6，7。尽管开展了广泛的^{研究工作，}但癌症仍然是一个全球健康负担，发病率和死亡率很高8。治疗癌症的一个严重障碍是，由于生理屏障，如紧凑的细胞外基质（ECM）、异常的肿瘤脉管系统、多重膜屏障和高组织液压力（IFP^）9，治疗药物对更深的肿瘤细胞的获取有限。因此，开发具有跨越生物屏障运送货物的卓越能力的新型CPP被认为是癌症治疗的基本策略^10，11。

CPP 根据其理化性质可分为阳离子性、两亲性和疏水性 CPP¹²。其中，带正电荷的HIV-TAT肽和合成的聚精氨酸在生物医学研究中具有相当的重要性，并且已被广泛研究以促进细胞内药物递送¹³。Tunnemann等人报告说，基于使用R3至R12肽¹⁴进行的细胞通透性研究，八个精氨酸的最小长度对于合成聚精氨酸肽的有效细胞渗透至关重要。然而，这些CPP由于其 在体内快速水解，通常具有较短的血浆半衰期。此外，关于优化CPP的化学结构以增加其跨屏障能力知之甚少，因为穿透多个细胞膜具有挑战性¹⁵。因此，强烈希望开发能够穿透生物屏障的新型分子转运蛋白以提高药物递送效率。2020 年，Komin 等人 ¹⁶ 发现了一种名为 CL 肽的 CPP，其中包含用于穿过上皮单层的螺旋基序 （RLLRLLR） 和聚精氨酸尾部 （R7）。通过改变螺旋模式，还合成了一组CL肽变体。这一探索可以成为开发新的CPPs的重要指南，用于跨越生物屏障运送货物。此外，Dietrich等人优化了StAX肽的细胞通透性，通过增加肽的整体疏水性来抑制Wnt/β-连环蛋白信号通路¹⁷。

通过环化对非结构化线性肽进行构象限制是增强其蛋白水解稳定性和渗透性的有效途径¹⁸，^19，20。结构增强增加了环肽的蛋白酶抗性，使其在体内比线性对应物更稳定。此外，肽的环化可以通过促进分子内氢键来潜在地掩盖极性肽主链，从而增加肽的膜通透性²¹。在过去的二十年中，化学选择性环化方法已成为构建具有不同结构的环肽的有效策略，例如全烃，内酰胺，三唑，间二甲苯，全氟芳基和其他交联^22，23。复杂的肿瘤微环境所施加的生物屏障可以减少药物在实体瘤中的渗透²⁴。我们之前发现，环状CPPs对酶消化的抵抗力优于线性对应物²⁰。此外，肽的整体疏水性对于增强细胞通透性至关重要²²。基于上面讨论的研究，可以假设带正电模式、升高的整体疏水性和增强的蛋白水解稳定性的组合可以增加 CPP 跨越生物屏障的渗透性。在最近的一项研究中，我们确定了两种在位置i和i + 7具有芳香交联的环状CPP，与线性对应物相比，它们在肿瘤细胞和组织中表现出更好的通透性¹⁵。本文介绍了用于合成荧光标记环状CPP的简明合成方案以及研究其渗透性的关键步骤。

研究方案

1. 设备准备

注意:使用合适的个人防护设备在操作通风橱中执行所有程序。

1. 将手动肽合成装置组装在通风橱中（图1）。将三通旋塞阀（见材料表）放在真空歧管上（见材料表）并连接到氮气（N₂）。确保盖上未使用的入口。
2. 将 10 mL 聚丙烯色谱柱（参见 材料表）连接到三通旋塞阀上。使用橡胶移液器灯泡或通过废物收集器 真空 从聚丙烯柱中排出反应混合物或溶剂。

2. FITC标记的线性R8肽（FITC-R8）和FITC标记的吻合R8肽（FITC-sR8-4）的合成

注意:肽是根据标准的基于Fmoc的固相肽合成（SPPS）方案²⁵合成的。在整个研究中使用了4-（2'，4'-二甲氧基苯丙基-Fmoc-氨甲基）-苯氧基乙酰氨基-去甲亮酰基-MBHA树脂（溜冰场酰胺MBHA树脂，见 材料表）。

注意:N，N-二甲基甲酰胺（DMF），N，N-二异丙基乙胺（DIPEA），吗啉和二氯甲烷（DCM）都是无色的，如果吸入或通过皮肤吸收会造成损害。乙醚极易燃。1，2-乙二硫醇（EDT）是一种特别有气味的物质。三氟乙酸（TFA）具有很强的腐蚀性，其酸度是乙酸的10-5倍。因此，所有试剂和化学品都应使用通风橱中的防护设备进行处理。

1. 准备用于肽合成的树脂。
   1. 计算合成所需的树脂质量:树脂质量（毫克）=水垢（毫摩尔）/树脂负载量（毫摩尔/克）×1，000（毫克/克）
      注意:例如，溜冰场酰胺MBHA树脂的质量（0.572毫摩尔/克）为0.2毫摩尔= 0.2毫摩尔/0.572毫摩尔/克×1，000毫克/克= 350毫克。
   2. 将4-5mL DMF加入所需量的树脂中，并转移到10 mL聚丙烯柱（步骤1.2）中，轻轻鼓泡N₂ 30分钟以使树脂充分膨胀，然后排出DMF。
   3. 向树脂中加入 4-5 mL 的 50% 吗啉/DMF （v/v），轻轻将 N 2 振荡 30 分钟₂ x 以除去 N 末端 Fmoc 基团，然后沥干混合物。之后，通过向色谱柱中加入 4-5 mL DMF 并每次用 N₂ 鼓泡至少 1 分钟，彻底清洗树脂 3 次。继续以相同的方式用DCM（3x）和DMF（3x）洗涤树脂。
2. 如下所述执行受Fmoc保护的氨基酸偶联。
   注意:这里以0.2 mmol规模的手动合成中精氨酸的偶联为例进行描述。
   1. 将 Fmoc-Arg （Pbf）-OH（5 当量，648.8 mg）和 2-（7-偶氮苯并三唑）-N，N，N'，N'-四甲基六氟磷酸尿酸铵（HATU，4.9 当量，372.6 mg）溶解在离心管中的 5 mL DMF 中。
   2. 加入DIPEA（10当量，348.4μL）以激活偶联反应，然后将反应混合物转移到装有树脂的10 mL聚丙烯柱中（在步骤2.1.3中制备）。然后，轻轻搅拌混合物，N 2冒泡_1-2 小时。
   3. 重复偶联反应（步骤2.2.1和步骤2.2.2）一次。
   4. 偶联完成后，排干反应混合物，依次用DMF，DCM和DMF 3x洗涤树脂，每次至少1分钟。
   5. 按顺序步骤对每个氨基酸进行偶联:向树脂中加入4-5mL的50%吗啉/ DMF （v / v），用N 2轻轻鼓泡30分钟2x以除去N α-Fmoc基团，然后洗涤树脂（如步骤2.2.4所示），并继续偶联下一个氨基酸（如步骤2.2.1和步骤2.2.2所示）。继续进行此步骤的几个循环以实现所需肽的合成。
      注意:此过程可以在此处暂停。用甲醇浓缩树脂，以N₂的连续流动干燥树脂。盖上聚丙烯柱，然后将树脂在4°C下储存几天（或在-20°C下储存更长时间）。在开始新的合成之前，用4-5mL DMF膨胀树脂0.5-1小时。如果直接进行下一步，则无需冷凝树脂。
3. 如下所述，用异硫氰酸荧光素（FITC）标记肽。
   1. 将β-丙氨酸偶联为FITC标记的间隔物，使用与步骤2.2中用于氨基酸偶联的相同过程。
   2. 通过将FITC的混合物（5当量），DIPEA（10当量）和DMF的混合物添加到聚丙烯柱中并在黑暗中反应8小时，对树脂上的肽进行FITC标记。
4. 对于FITC-sR8-4的合成，如下所述对线性肽进行环化。
   1. 将TFA/三异丙基硅烷（TIS）/DCM（3/5/92，v/v/v）的混合物加入聚丙烯柱中2分钟，选择性地除去Cys（Trt）保护基团，然后排出混合物。重复上述步骤，直到淡黄色溶液变为无色，以完全去除Trt保护基团。
   2. 随后，用DMF和DCM对树脂进行至少3次的顺序洗涤。然后，将4，4'-双（溴甲基）联苯（2当量）溶解在DMF中，与DIPEA（4当量）一起，将其加入色谱柱中，反应4小时。
5. 如上所述切割肽:肽合成完成后，用4-5mL甲醇洗涤树脂两次，每次5分钟，并用N₂的连续流干燥。对于含有半胱氨酸的肽，用有效的裂解混合物 TFA/TIS/H 2 O （95/2.5/2.5， v/v/v） 或 TFA/TIS/EDT/H 2 O （_92.5/2.5/2.5/2.5， v/v/v/v/v） 处理树脂，每 100 mg 树脂使用约 1 mL 的裂解混合物。处理肽结合树脂2-3小时以裂解肽，然后用N₂流小心地除去TFA。
6. 为了获得粗肽，向裂解的肽制剂中加入4-5mL乙醚以沉淀粗肽并以10，000× g 离心4分钟。小心地弃去上清液，并在有效的通风橱中风干肽3分钟。
7. 肽分析:将小规模粗肽（从约10mg肽结合树脂中裂解）溶解在800μL乙腈（ACN）/ H₂O（1/1，v / v）中，然后使用反相高效液相色谱（RP-HPLC）和液相色谱-质谱（LC-MS）（参见 材料表）。
8. 使用 RP-HPLC 和 LC-MS 纯化肽。
   1. 将 50 mg 粗肽产物溶解在 4 mL ACN/H₂O （1/1， v/v） 中，并将溶液注入配备 C18 色谱柱的 RP-HPLC 系统中（4.6 mm x 150 mm，孔径:120 Å，粒径:4 μm;参见 材料表）。使用含有0.1%TFA/H₂O （v/v）和乙腈的流动相洗脱肽，梯度为10%至90%乙腈，持续30分钟。在220 nm处检测到常规肽，在494 nm处检测到FITC标记的肽。
   2. 收集与MS鉴定的主肽峰相对应的级分，然后冻干所需的肽级分。将纯化的肽储存在-20°C。
      注意:纯化的FITC-R8的发现m / z如下:[M + 3 H]³⁺:576.63;[M + 4 小时]⁴⁺: 432.72;[M + 5 小时]⁵⁺: 346.39;[M + 6 小时]⁶⁺: 288.85.纯化的FITC-sR8-4的发现m/z如下:[M + 3 H]³⁺:704.74;[M + 4 小时]⁴⁺: 528.77;[M + 5 小时]⁵⁺: 423.34;[M + 6 小时]⁶⁺: 352.91.质谱分析条件:仪器:ESI（探头偏置:+4.5 kV;检测器:1.2 kV）;雾化器气体流量:1.5升/分钟;弯曲脱溶剂线: −20 V;城市发展温度:250°C;块温度:400°C;流速:0.2毫升/分钟;流动相:50% H₂O/50% 乙腈。

3. FITC标记肽的定量

1. 将少量纯化的肽溶解在DMSO中作为储备溶液（例如，40 μmol/mL）。
2. 使用多技术酶标仪（参见材料表）在498μL 10 mM磷酸盐缓冲盐水（1x PBS，pH 7.4）中测量2μL储备溶液在494nm（A₄₉₄）处的吸光度。稀释因子为 500 μL/ 2 μL = 250，微量滴定板的光程长度为 0.5 mm。
3. 使用以下公式计算储备溶液的浓度:
   浓度 （mM） = A₄₉₄ ×稀释因子 / 0.05 （cm） / 77，000 （cm⁻¹·M⁻¹） × 1，000 （mM^·M−1）
4. 调整到适当的稀释度，使测得的 A₄₉₄ 值介于 0.1 和 1.0 之间。
   注意:测量应重复几次，以确保测量的浓度准确。消光系数为77，000 cm⁻¹·M⁻¹ 起源于FITC群。

4. 胎牛血清（FBS）中肽的稳定性

1. 将肽以100μM的浓度与250μL的25%FBS_{/ H 2}O （v / v）在37°C孵育。 孵育0小时，1小时，2小时和4小时后，取10μL等分试样，然后加入150μl溶解在H₂O / ACN（1/3，v / v）中的12%三氯乙酸以沉淀血清蛋白。
2. 将样品以10，000× g 离心5分钟，并使用HPLC分析上清液（如步骤2.8中所述）以确定肽降解的程度。
3. 计算1小时，2小时和4小时峰面积与0小时峰面积的比值，以获得相应时间未降解肽的分数。结果是三个平行样本的平均值。

5. 细胞对肽的摄取

1. 荧光显微成像
   1. 将圆形盖玻片放入 12 孔板中。然后，在盖玻片上均匀接种 1 x 10⁵ 个细胞，并用 2 mL 培养基培养过夜。取出培养基，用 1 mL PBS 洗涤细胞 3 倍。
      注意:在本研究中，HeLa细胞和4T1细胞在Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM，参见 材料表）中培养，补充有10%FBS，在含有5%CO₂的37°C加湿培养箱中。
   2. 将细胞与1mL的3μM FITC标记的肽在不含FBS的DMEM中在37°C孵育1小时。 之后，除去含肽的培养基，并用 1 mL PBS 洗涤细胞 3 倍。
   3. 用 1 mL Hoechst 33258 对细胞染色 15 分钟。使用具有相同荧光强度和曝光时间的荧光显微镜（参见 材料表）观察每种肽的内化。
      注意:以下设置用于荧光显微镜。目标:平场复消色差:63 x/1.40 油 DIC M27;FITC 通道 1:激发滤光片:450-490 nm，发射滤光片:500-550 nm，曝光时间:230 ms;赫斯特 33258 的通道 2:激发滤光片:335-383 nm，发射滤光片:420-470 nm，曝光时间:27 ms。
2. 流式细胞术分析
   1. 在12孔板中均匀接种5 x 10^{5 HeLa} 细胞，并在37°C下在DMEM中培养24小时。 之后，取出培养基并用 1 mL PBS 洗涤细胞 3 倍。
   2. 将细胞与1mL的3μM FITC标记的肽在不含FBS的DMEM中在37°C孵育1小时。 除去含肽的培养基，在PBS中用0.25%（w / v）胰蛋白酶和0.53mM EDTA解离细胞5分钟，然后以306× g 离心4分钟收集细胞。用PBS洗涤细胞沉淀。
   3. 将细胞与 1 mL 的 0.05% （w/v） 台盼蓝在 PBS 中孵育 3 分钟以淬灭表面结合的荧光，并使用流式细胞仪进行细胞内荧光的定量分析（参见 材料表）。
      注意:流式细胞术设置:激发:488 nm，发射:530 nm。台盼蓝还可以淬灭死细胞的荧光，并在肽摄取分析过程中帮助区分活/死细胞。
   4. 使用流式细胞术处理和测定4T1细胞，遵循与HeLa细胞相同的方案。每个样品收集 5 x 10^{5 个} 细胞，每组设置三个平行样品。

6. 使用Transwell模型探索肽的细胞间渗透

1. 在带有组织培养板插入物的12孔室中接种2mLDMEM中的1 x 10 5 HeLa细胞（参见材料表），并在含有⁵%CO₂的37°C加湿培养箱中孵育24小时。之后，除去培养基并将细胞在无FBS的DMEM中用1mL的10μM FITC-R8或FITC-sR8-4（使用HPLC纯化）孵育1小时。
2. 除去含有肽的培养基，并用 1 mL PBS 洗涤细胞 3 倍。向腔室中加入 1 mL 新鲜的不含 FBS 的 DMEM，然后将 HeLa 细胞与组织培养板插入物在腔室中共同孵育，将 HeLa 细胞与底部圆形盖玻片上的 HeLa 细胞共同孵育 2 小时。
3. 用2.5%戊二醛将HeLa细胞固定在圆形盖玻片上15分钟，然后用DAPI染色细胞15分钟。然后，在荧光显微镜下观察盖玻片上的HeLa细胞。使用与HeLa细胞相同的方案处理和测定4T1细胞。

结果

在该协议中，提出了一种将线性聚精氨酸R8限制为其环状形式的合成程序。SPPS是使用简单的设备手动进行的（图1）。SPPS的详细合成过程如图2所示。简而言之，树脂充分膨胀，然后对N α-Fmoc保护基团进行脱保护。然后，将受N α-Fmoc保护的氨基酸锚定在树脂上，直到肽组装完成（图2中的步骤1-4）。然后...

讨论

通过结合构象约束来稳定肽已被证明是提高肽²⁶的稳定性和细胞通透性的有效策略。在该协议中，描述了用于合成具有芳香交联的环状CPPs并评估其跨生物屏障的渗透性的分步程序。与亲水性内酰胺或三唑交联²²，²⁷相比^，芳族交联的掺入（用于本研究）提高了CPP的整体疏水性，从而显着提高了其细胞通透性。另一方面，肽环化可以通过?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-ethanedithiol	Aladdin	K1722093	stench
2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU)	HEOWNS	A-0443697
4,4'-bis(bromomethyl)biphenyl	TCI	B1921
4T1 cells	ATCC		4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2.
Acetonitrile	Adamas	1484971	toxicity
Dichloromethane	Energy	W330229	skin harmful
Diethyl ether	Aldrich	673811	flammable
Dimethyl sulfoxide	Beyotime	ST038	skin harmful
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco
Electrospray Ionization Mass Spectrometer	Waters	G2-S Tof
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)	BioFroxx	1340
Fetal bovine serum (FBS)	HyClone
Flow cytometer	Beckman Coulter	CytoFLEX
Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC)	Energy	E0801812500
Fluorescent microscope	Carl Zeiss	Axio Observer 7
Fmoc-Arg(Pbf)-OH	HEOWNS	F-81070
Fmoc-Cys(Trt)-OH	GL Biochem	GLS201115-35202
Fmoc-βAla-OH	Adamas	51341C
HeLa cells	ATCC		HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2.
High-Performance Liquid Chromatography	Agilent	Agilent 1260
High-Performance Liquid Chromatography column	Agilent	Poroshell EC-C18 120, 4.6 × 150 mm (pore size 120 Å, particle size 4 μm)
Lyophilizer	SP Scientific	Vir Tis
Methanol	Aldrich	9758	toxicity
Microtiter plate	Thermo μdrop plate	N12391
Morpholine	HEOWNS	M99040	irritant
Multi-technology microplate reader	Thermo	VARIOSKAN LUX
N,N-Diisopropylethylamine	HEOWNS	E-81416	irritant
N,N-Dimethyl formamide	Energy	B020051	harmful to skin
Poly-Prep column	Bio-Rad	7321010	polypropylene chromatography columns
Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g)	GL Biochem	GLS180301-49101
Three-way stopcocks	Bio-Rad	7328107
Tissue culture plate insert	LABSELECT	14211
Trifluoroacetic acid	HEOWNS	T63278	corrosive
Triisopropylsilane	HEOWNS	T-0284475
Trypsin	BioFroxx	1004
Vacuum manifold	Promega	A7231