Costruzione di peptidi ciclici che penetrano nelle cellule per una maggiore penetrazione delle barriere biologiche

Riepilogo

Questo protocollo descrive la sintesi di peptidi ciclici penetranti nelle cellule con legami incrociati aromatici e la valutazione della loro permeabilità attraverso le barriere biologiche.

Abstract

Il cancro è stato una grande sfida per la salute globale. Tuttavia, il complesso microambiente tumorale generalmente limita l'accesso delle terapie alle cellule tumorali più profonde, portando alla recidiva del tumore. Per superare la limitata penetrazione delle barriere biologiche, sono stati scoperti peptidi che penetrano le cellule (CPP) con un'eccellente capacità di traslocazione della membrana e sono emersi come utili trasportatori molecolari per trasportare vari carichi nelle cellule. Tuttavia, le CPP lineari convenzionali mostrano generalmente una stabilità proteolitica compromessa, che limita la loro permeabilità attraverso le barriere biologiche. Pertanto, lo sviluppo di nuovi trasportatori molecolari in grado di penetrare le barriere biologiche e mostrare una maggiore stabilità proteolitica è altamente desiderato per promuovere l'efficienza della somministrazione di farmaci nelle applicazioni biomediche. Abbiamo precedentemente sintetizzato un pannello di CPP ciclici corti con reticoli aromatici, che hanno mostrato una permeabilità superiore nelle cellule tumorali e nei tessuti rispetto alle loro controparti lineari. Qui, viene descritto un protocollo conciso per la sintesi del peptide poliarginina R8 ciclico marcato fluorescentmente e della sua controparte lineare, nonché i passaggi chiave per studiare la loro permeabilità cellulare.

Introduzione

Gli ultimi decenni hanno assistito a rapidi progressi nello sviluppo di peptidi che penetrano nelle cellule (CPP) per la somministrazione di farmaci. I CPP sono stati ampiamente utilizzati come trasportatori molecolari per il trattamento di una serie di malattie potenzialmente letali, tra cui disturbi neurologici^1,2, malattie cardiache³, diabete⁴, dermatosi⁵ e cancro ^6,7. Il cancro rimane un onere sanitario globale accompagnato da un alto tasso di morbilità e mortalità nonostante i diffusi sforzi di ricerca⁸. Un serio ostacolo al trattamento del cancro è l'accesso limitato delle terapie alle cellule tumorali più profonde a causa di barriere fisiologiche come la matrice extracellulare compatta (ECM), la vascolarizzazione tumorale anormale, le barriere multimembrana e l'alta pressione del liquido interstiziale (IFP)⁹. Pertanto, lo sviluppo di nuovi CPP con una capacità superiore di consegnare carichi attraverso le barriere biologiche è considerato una strategia essenziale per il trattamento del cancro^10,11.

I CPP possono essere classificati in CPP cationici, anfipatici e idrofobici in termini di proprietà fisico-chimiche¹². Tra questi, il peptide HIV-TAT caricato positivamente e la poliarginina sintetica sono di notevole importanza nella ricerca biomedica e sono stati ampiamente studiati per facilitare la somministrazione intracellulare di farmaci¹³. Tunnemann et al. hanno riferito che una lunghezza minima di otto arginine è essenziale per un'efficiente penetrazione cellulare dei peptidi sintetici di poliarginina, sulla base di uno studio di permeabilità cellulare condotto utilizzando i peptidi da R3 a R12¹⁴. Tuttavia, questi CPP hanno generalmente brevi emivite plasmatiche a causa della loro rapida idrolisi in vivo. Inoltre, si sa poco per quanto riguarda l'ottimizzazione della struttura chimica dei CPP per aumentare la loro capacità di trans-barriera in quanto è difficile penetrare più membrane cellulari¹⁵. Pertanto, lo sviluppo di nuovi trasportatori molecolari in grado di penetrare le barriere biologiche è fortemente desiderato per migliorare l'efficienza della somministrazione dei farmaci. Nel 2020, Komin et ^al.16 hanno scoperto un CPP chiamato peptide CL, che contiene un motivo elicoidale (RLLRLLR) e una coda di poliarginina (R7) per attraversare il monostrato epiteliale. Una serie di varianti peptidiche CL sono state anche sintetizzate alterando il modello elicoidale. Questa esplorazione potrebbe essere una guida significativa per lo sviluppo di nuovi CPP per la consegna di carichi attraverso barriere biologiche. Inoltre, Dietrich et al. hanno ottimizzato la permeabilità cellulare del peptide StAX, inibendo la via di segnalazione Wnt / β-catenina aumentando l'idrofobicità complessiva dei peptidi¹⁷.

La restrizione conformazionale di peptidi lineari non strutturati mediante ciclizzazione è un modo efficace per migliorare la loro stabilità proteolitica e permeabilità^18,19,20. Il rinforzo strutturale aumenta la resistenza alla proteasi dei peptidi ciclici, rendendoli più stabili in vivo rispetto alle loro controparti lineari. Inoltre, la ciclizzazione dei peptidi può potenzialmente mascherare la spina dorsale del peptide polare promuovendo il legame idrogeno intramolecolare, aumentando così la permeabilità della membrana dei peptidi²¹. Negli ultimi due decenni, i metodi di ciclizzazione chemioselettiva sono diventati strategie efficaci per la costruzione di peptidi ciclici con architetture diverse, come tutto idrocarburi, lattamici, triazolo, m-xilene, perfluoroarile e altri legami incrociati^22,23. La barriera biologica imposta dal sofisticato microambiente tumorale potrebbe ridurre la penetrazione dei farmaci nei tumori solidi²⁴. Abbiamo precedentemente scoperto che i CPP ciclici mostravano una resistenza superiore alla digestione enzimatica rispetto alle loro controparti lineari²⁰. Inoltre, l'idrofobicità complessiva dei peptidi è fondamentale per la loro maggiore permeabilità cellulare²². Sulla base degli studi discussi sopra, la combinazione di un modello caricato positivamente, elevata idrofobicità complessiva e maggiore stabilità della proteolisi può essere ipotizzata per aumentare la permeabilità dei CPP attraverso le barriere biologiche. In uno studio recente, abbiamo identificato due CPP ciclici con legami incrociati aromatici nelle posizioni i e i + 7 che mostrano una migliore permeabilità nelle cellule e nei tessuti tumorali rispetto alle loro controparti lineari¹⁵. Qui viene presentato un protocollo sintetico conciso per la sintesi di CPP ciclici marcati con fluorescenza e i passaggi chiave per studiarne la permeabilità.

Protocollo

1. Preparazione dell'attrezzatura

NOTA: Eseguire tutte le procedure in una cappa aspirante funzionante con idonei dispositivi di protezione individuale.

1. Assemblare l'apparato manuale di sintesi dei peptidi nella cappa aspirante (Figura 1). Posizionare i rubinetti di arresto a tre vie (vedi tabella dei materiali) sul collettore a vuoto (vedere tabella dei materiali) e collegarli all'azoto (N₂). Assicurati di tappare le prese inutilizzate.
2. Fissare una colonna in polipropilene da 10 mL (vedere la tabella dei materiali) sui rubinetti di arresto a tre vie. Scaricare la miscela di reazione o i solventi dalla colonna di polipropilene utilizzando una lampadina per pipette di gomma o un vuoto tramite una trappola per rifiuti.

2. Sintesi del peptide lineare R8 marcato con FITC (FITC-R8) e del peptide R8 graffato marcato con fitc (FITC-sR8-4)

NOTA: I peptidi sono stati sintetizzati secondo un protocollo standard di sintesi peptidica in fase solida (SPPS) basato su Fmoc²⁵. La resina 4-(2',4'-Dimethoxypheyl-Fmoc-aminomethyl)-phenoxyacetamido-norleucyl-MBHA (resina MBHA ammidica da pista, vedi Tabella dei materiali) è stata utilizzata durante lo studio.

ATTENZIONE: N, N-dimetilformammide (DMF), N, N-diisopropiletilamina (DIPEA), morfolina e diclorometano (DCM) sono tutti incolori e sono dannosi se inalati o assorbiti attraverso la pelle. L'etere è estremamente infiammabile. L'1,2-Etanditiolo (EDT) è una sostanza particolarmente odorosa. L'acido trifluoroacetico (TFA) è altamente corrosivo e la sua acidità è 10⁵ volte quella dell'acido acetico. Di conseguenza, tutti i reagenti e le sostanze chimiche dovrebbero essere trattati utilizzando dispositivi di protezione in una cappa aspirante.

1. Preparare la resina per la sintesi peptidica.
   1. Calcola la massa di resina necessaria per la sintesi:Massa di resina (mg) = scala (mmol) / capacità di carico della resina (mmol / g) × 1.000 (mg / g)
      NOTA: Ad esempio, la massa di resina MBHA ammidica (0,572 mmol / g) per 0,2 mmol = 0,2 mmol / 0,572 mmol / g × 1.000 mg / g = 350 mg.
   2. Aggiungere 4-5 ml di DMF alla quantità necessaria di resina e trasferire nella colonna di polipropilene da 10 mL (fase 1.2) con un delicato gorgogliamento di N₂ per 30 minuti per gonfiare adeguatamente la resina, quindi drenare il DMF.
   3. Aggiungere 4-5 ml di morfolina/DMF (v/v) al 50% alla resina, bollire delicatamente N₂ per 30 minuti 2x per rimuovere il gruppo Fmoc N-terminale, quindi scolare la miscela. Successivamente, lavare accuratamente la resina 3 volte aggiungendo 4-5 ml di DMF alla colonna e gorgogliando con N₂ per almeno 1 minuto ogni volta. Continuare a lavare la resina con DCM (3x) e DMF (3x) allo stesso modo.
2. Eseguire l'accoppiamento aminoacidico protetto da Fmoc come descritto di seguito.
   NOTA: L'accoppiamento dell'arginina in una sintesi manuale su scala 0,2 mmol è descritto qui come esempio.
   1. Sciogliere Fmoc-Arg (Pbf)-OH (5 equiv., 648,8 mg) e 2-(7-azobenzotriazolo)-N, N, N', N'-tetrametiluronio esafluorofosfato (HATU, 4,9 equiv., 372,6 mg) in 5 mL di DMF in una provetta da centrifuga.
   2. Aggiungere DIPEA (10 equiv., 348,4 μL) per attivare la reazione di accoppiamento, quindi trasferire la miscela di reazione alla colonna di polipropilene da 10 mL con resina (preparata al punto 2.1.3). Quindi, agitare delicatamente la miscela con N 2 gorgogliando per_1-2 ore.
   3. Ripetere una volta la reazione di accoppiamento (punto 2.2.1 e passaggio 2.2.2).
   4. Dopo il completamento dell'accoppiamento, scaricare la miscela di reazione e lavare la resina in sequenza con DMF, DCM e DMF 3 volte ciascuno per almeno 1 minuto ogni volta.
   5. Eseguire l'accoppiamento di ciascun amminoacido in fasi ordinate: aggiungere 4-5 ml di morfolina/DMF al 50% (v/v) alla resina, bollire delicatamente con N 2 per 30 minuti 2x per rimuovere il gruppo N α-Fmoc, quindi lavare la resina (come mostrato al punto 2.2.4) e procedere all'accoppiamento dell'amminoacido successivo (come mostrato nei punti 2.2.1 e 2.2.2). Procedere con diversi cicli di questo passaggio per ottenere la sintesi del peptide desiderato.
      NOTA: questo processo può essere sospeso qui. Condensare la resina con metanolo e asciugare la resina con un flusso continuo di N₂. Tappare la colonna di polipropilene e conservare la resina a 4 °C per alcuni giorni (o a -20 °C per una conservazione più lunga). Gonfiare la resina con 4-5 ml di DMF per 0,5-1 h prima di iniziare una nuova sintesi. Se si procede direttamente al passaggio successivo, non è necessario condensare la resina.
3. Etichettare i peptidi con isotiocianato di fluoresceina (FITC) come descritto di seguito.
   1. Accoppiare la beta-alanina come distanziatore per l'etichettatura FITC utilizzando lo stesso processo utilizzato per l'accoppiamento degli aminoacidi nel passaggio 2.2.
   2. Eseguire la marcatura FITC dei peptidi sulla resina aggiungendo una miscela di FITC (5 equiv.), DIPEA (10 equiv.) e DMF alla colonna di polipropilene e reagendo al buio per 8 ore.
4. Per la sintesi di FITC-sR8-4, eseguire la ciclizzazione del peptide lineare come descritto di seguito.
   1. Aggiungere una miscela di TFA/triisopropilsilano (TIS)/DCM (3/5/92, v/v/v) alla colonna di polipropilene per 2 minuti per rimuovere selettivamente il gruppo protettivo Cys (Trt), quindi scolare la miscela. Ripetere la procedura precedente fino a quando la soluzione giallastra diventa incolore per rimuovere completamente il gruppo protettivo trt.
   2. Successivamente, eseguire lavaggi sequenziali della resina con DMF e DCM almeno 3x. Successivamente, sciogliere 4,4'-bis(bromometil)bifenile (2 equiv.) in DMF con DIPEA (4 equiv.), aggiungerlo alla colonna e reagire per 4 ore.
5. Fendere i peptidi come descritto: Dopo il completamento della sintesi peptidica, lavare la resina con 4-5 ml di metanolo due volte per 5 minuti ciascuno e asciugarla con un flusso continuo di N₂. Trattare la resina con un efficace cocktail di scissione TFA/TIS/H 2 O (95/2.5/2.5, v/v/v), o TFA/TIS/EDT/H 2 O (_92.5/2.5/2.5/2.5, v/v/v/v) per peptidi contenenti cisteine, utilizzando circa 1 mL di cocktail di scissione per 100 mg di resina. Trattare la resina legata al peptide per 2-3 ore per scindere il peptide e quindi rimuovere accuratamente il TFA con un flusso di N₂.
6. Per ottenere i peptidi grezzi, aggiungere 4-5 ml di etere etilico alla preparazione del peptide scisso per precipitare i peptidi grezzi e centrifugare a 10.000 × g per 4 minuti. Scartare con attenzione il surnatante e asciugare all'aria il peptide per 3 minuti in una cappa aspirante efficace.
7. Analisi dei peptidi: sciogliere un peptide grezzo su piccola scala (scisso da circa 10 mg di resina legata al peptide) in 800 μL di acetonitrile (ACN)/H₂O (1/1, v/v) e quindi analizzare utilizzando cromatografia liquida ad alte prestazioni a fase inversa (RP-HPLC) e cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) (vedi Tabella dei materiali).
8. Purificare i peptidi utilizzando RP-HPLC e LC-MS.
   1. Sciogliere 50 mg di prodotto peptidico grezzo in 4 mL di ACN/H₂O (1/1, v/v) e iniettare la soluzione in un sistema RP-HPLC dotato di una colonna C18 (4,6 mm x 150 mm, dimensione dei pori: 120 Å, dimensione delle particelle: 4 μm; vedere Tabella dei materiali). Eluire il peptide utilizzando una fase mobile contenente lo 0,1% di TFA/H₂O (v/v) e ACN, con un gradiente dal 10% al 90% di ACN nell'arco di 30 minuti. I peptidi convenzionali sono stati rilevati a 220 nm e i peptidi marcati con FITC a 494 nm.
   2. Raccogliere le frazioni corrispondenti al picco peptidico principale identificato dalla SM e quindi liofilizzare le frazioni peptidiche desiderate. Conservare il peptide purificato a -20 °C.
      NOTA: I m/z trovati del FITC-R8 purificato sono i seguenti: [M + 3 H]³⁺: 576.63; [M + 4 H] ⁴⁺: 432,72; [M + 5 H] ⁵⁺: 346,39; [M + 6 H] ⁶⁺: 288,85. I m/z trovati del FITC-sR8-4 purificato sono i seguenti: [M + 3 H]³⁺: 704.74; [M + 4 H] ⁴⁺: 528,77; [M + 5 H] ⁵⁺: 423,34; [M + 6 H] ⁶⁺: 352,91. Condizioni analitiche MS: strumento: ESI (polarizzazione della sonda: +4,5 kV; rivelatore: 1,2 kV); flusso gas nebulizzatore: 1,5 L/min; linea di desolvatazione curva (CDL): -20 V; Temperatura CDL: 250 °C; temperatura blocco: 400 °C; portata: 0,2 ml/min; fase mobile: 50% H₂O/50% ACN.

3. Quantificazione dei peptidi marcati con FITC

1. Sciogliere una piccola quantità di peptide purificato in DMSO come soluzione madre (ad esempio, 40 μmol / ml).
2. Misurare l'assorbanza a 494 nm (A 494) di 2 μL della soluzione madre in₄₉₈ μL di soluzione salina tamponata fosfato 10 mM (1x PBS, pH 7,4) con una piastra di microtitolazione (vedere Tabella dei materiali) utilizzando un lettore di micropiastre multitecnologia (vedere Tabella dei materiali). Il fattore di diluizione è 500 μL/ 2 μL = 250 e la lunghezza del percorso della piastra di microtitolazione è di 0,5 mm.
3. Calcolare la concentrazione della soluzione madre utilizzando la seguente formula:
   Concentrazione (mM) = A₄₉₄ × fattore di diluizione / 0,05 (cm) / 77.000 (cm⁻¹· M−1) × 1.000 (mM·M⁻¹)
4. Regolare una diluizione corretta in modo che il valore A₄₉₄ misurato sia compreso tra 0,1 e 1,0.
   NOTA: le misurazioni devono essere ripetute più volte per garantire che la concentrazione misurata sia accurata. Il coefficiente di estinzione di 77.000 cm⁻¹· M⁻¹ deriva dal gruppo FITC.

4. Stabilità dei peptidi nel siero fetale bovino (FBS)

1. Incubare il peptide ad una concentrazione di 100 μM con 250 μL di FBS/H₂O (v/v) al 25% a 37 °C. Dopo l'incubazione per 0 ore, 1 ora, 2 ore e 4 ore, prendere 10 μL di aliquote e quindi aggiungere 150 μl di acido tricloroacetico al 12% sciolto in H₂O/ACN (1/3, v/v) per precipitare le proteine sieriche.
2. Centrifugare i campioni a 10.000 × g per 5 minuti e analizzare il surnatante utilizzando HPLC (come descritto nella fase 2.8) per determinare l'entità della degradazione del peptide.
3. Calcolare il rapporto tra l'area di picco a 1 h, 2 h e 4 h e quella a 0 h per ottenere la frazione di peptide non degradato al momento corrispondente. Il risultato è la media di tre campioni paralleli.

5. Assorbimento cellulare dei peptidi

1. Imaging microscopico a fluorescenza
   1. Posizionare un coprislip rotondo in una piastra a 12 pozzetti. Quindi, inoculare 1 x 10⁵ cellule uniformemente su vetrini di copertura e coltura durante la notte con 2 ml di terreno. Rimuovere il mezzo e lavare le celle 3 volte con 1 mL di PBS.
      NOTA: In questo studio, le cellule HeLa e le cellule 4T1 sono state coltivate nel Modified Eagle Medium (DMEM, vedi Tabella dei materiali) di Dulbecco integrato con il 10% di FBS in un incubatore umidificato a 37 °C contenente il 5% di CO₂.
   2. Incubare le cellule con 1 mL di peptidi marcati con FITC da 3 μM in DMEM privo di FBS per 1 ora a 37 °C. Successivamente, rimuovere il mezzo contenente peptidi e lavare le cellule 3 volte con 1 mL di PBS.
   3. Colorare le cellule con 1 mL di Hoechst 33258 per 15 min. Osservare l'internalizzazione di ciascun peptide utilizzando un microscopio a fluorescenza (vedi Tabella dei materiali) con la stessa intensità di fluorescenza e tempo di esposizione.
      NOTA: per la microscopia a fluorescenza sono state utilizzate le seguenti impostazioni. Obiettivo: Plan-Apochromat: 63 x/1.40 Oil DIC M27; Canale 1 per FITC: filtro di eccitazione: 450-490 nm, filtro di emissione: 500-550 nm, tempo di esposizione: 230 ms; Canale 2 per Hoechst 33258: filtro di eccitazione: 335-383 nm, filtro di emissione: 420-470 nm, tempo di esposizione: 27 ms.
2. Analisi citometrica a flusso
   1. Inoculare uniformemente 5 x 10^{cellule HeLa 5} x 10 in piastre a 12 pozzetti e coltura in DMEM per 24 ore a 37 °C. Successivamente, rimuovere il mezzo e lavare le celle 3x con 1 mL di PBS.
   2. Incubare le cellule con 1 mL di peptidi marcati con FITC da 3 μM in DMEM privo di FBS per 1 ora a 37 °C. Rimuovere il mezzo contenente peptidi, dissociare le cellule con tripsina allo 0,25% (p/v) e 0,53 mM di EDTA in PBS per 5 minuti, quindi raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 306 × g per 4 minuti. Lavare il pellet cellulare con PBS.
   3. Incubare le cellule con 1 mL di blu tripano allo 0,05% (p/v) in PBS per 3 minuti per estinguere la fluorescenza legata alla superficie ed eseguire l'analisi quantitativa della fluorescenza intracellulare utilizzando un citometro a flusso (vedere Tabella dei materiali).
      NOTA: Impostazioni della citometria a flusso: eccitazione: 488 nm, emissione: 530 nm. Il blu di Trypan può anche estinguere la fluorescenza delle cellule morte e aiutare a distinguere le cellule vive / morte durante l'analisi dell'assorbimento del peptide.
   4. Trattare e dosare le cellule 4T1 utilizzando la citometria a flusso seguendo lo stesso protocollo descritto per le cellule HeLa. Raccogliere 5 x 10⁵ celle per campione e impostare tre campioni paralleli per gruppo.

6. Esplorazione della penetrazione cellula-cellula dei peptidi utilizzando modelli transwell

1. Inoculare 1 x 10 5 cellule HeLa in 2 mL di DMEM in una camera a 12 pozzetti con un inserto in piastra di coltura tissutale (vedi Tabella dei materiali) e incubare per 24 ore in un incubatore umidificato a 37 °C contenente il⁵% di CO₂. Successivamente, rimuovere il mezzo e incubare le cellule nelle camere con 1 mL di 10 μM FITC-R8 o FITC-sR8-4 (purificato con HPLC) in DMEM privo di FBS per 1 ora.
2. Rimuovere il mezzo contenente i peptidi e lavare le cellule 3 volte con 1 mL di PBS. Aggiungere 1 mL di DMEM fresco privo di FBS alle camere e quindi co-incubare le cellule HeLa nella camera con l'inserto della piastra di coltura tissutale con le cellule HeLa sui vetrini rotondi sul fondo per 2 ore.
3. Fissare le cellule HeLa sui coprivetrini rotondi con glutaraldeide al 2,5% per 15 minuti e quindi colorare le cellule con DAPI per 15 minuti. Quindi, osservare le cellule HeLa sui vetrini sotto un microscopio a fluorescenza. Trattare e dosare le cellule 4T1 utilizzando lo stesso protocollo utilizzato per le cellule HeLa.

Risultati

In questo protocollo, è stata presentata una procedura sintetica per vincolare la poliarginina lineare R8 nella sua forma ciclica. L'SPPS è stato condotto manualmente utilizzando un semplice apparato (Figura 1). Il processo sintetico dettagliato di SPPS è mostrato nella Figura 2. In breve, la resina è stata sufficientemente gonfiata, seguita dalla deprotezione del gruppo protettivo N α-Fmoc. Quindi, l'amminoacido protetto da N α...

Discussione

La stabilizzazione chimica dei peptidi incorporando vincoli conformazionali si è dimostrata una strategia efficace per migliorare la stabilità e la permeabilità cellulare del peptide²⁶. In questo protocollo, viene descritta una procedura passo-passo per la sintesi di CPP ciclici con legami incrociati aromatici e la valutazione della loro permeabilità attraverso barriere biologiche. Rispetto ai legami incrociati idrofili lattamici o triazolici^22,27, l'incorporazione di l...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-ethanedithiol	Aladdin	K1722093	stench
2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU)	HEOWNS	A-0443697
4,4'-bis(bromomethyl)biphenyl	TCI	B1921
4T1 cells	ATCC		4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2.
Acetonitrile	Adamas	1484971	toxicity
Dichloromethane	Energy	W330229	skin harmful
Diethyl ether	Aldrich	673811	flammable
Dimethyl sulfoxide	Beyotime	ST038	skin harmful
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco
Electrospray Ionization Mass Spectrometer	Waters	G2-S Tof
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)	BioFroxx	1340
Fetal bovine serum (FBS)	HyClone
Flow cytometer	Beckman Coulter	CytoFLEX
Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC)	Energy	E0801812500
Fluorescent microscope	Carl Zeiss	Axio Observer 7
Fmoc-Arg(Pbf)-OH	HEOWNS	F-81070
Fmoc-Cys(Trt)-OH	GL Biochem	GLS201115-35202
Fmoc-βAla-OH	Adamas	51341C
HeLa cells	ATCC		HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2.
High-Performance Liquid Chromatography	Agilent	Agilent 1260
High-Performance Liquid Chromatography column	Agilent	Poroshell EC-C18 120, 4.6 × 150 mm (pore size 120 Å, particle size 4 μm)
Lyophilizer	SP Scientific	Vir Tis
Methanol	Aldrich	9758	toxicity
Microtiter plate	Thermo μdrop plate	N12391
Morpholine	HEOWNS	M99040	irritant
Multi-technology microplate reader	Thermo	VARIOSKAN LUX
N,N-Diisopropylethylamine	HEOWNS	E-81416	irritant
N,N-Dimethyl formamide	Energy	B020051	harmful to skin
Poly-Prep column	Bio-Rad	7321010	polypropylene chromatography columns
Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g)	GL Biochem	GLS180301-49101
Three-way stopcocks	Bio-Rad	7328107
Tissue culture plate insert	LABSELECT	14211
Trifluoroacetic acid	HEOWNS	T63278	corrosive
Triisopropylsilane	HEOWNS	T-0284475
Trypsin	BioFroxx	1004
Vacuum manifold	Promega	A7231