Konstruktion zyklischer zellpenetrierender Peptide zur verbesserten Durchdringung biologischer Barrieren

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese von zyklischen zellpenetrierenden Peptiden mit aromatischen Querverbindungen und die Bewertung ihrer Permeabilität über biologische Barrieren hinweg.

Zusammenfassung

Krebs ist eine große Herausforderung für die globale Gesundheit. Die komplexe Mikroumgebung des Tumors schränkt jedoch im Allgemeinen den Zugang von Therapeutika zu tieferen Tumorzellen ein, was zu einem Tumorrezidiv führt. Um die begrenzte Durchdringung biologischer Barrieren zu überwinden, wurden zellpenetrierende Peptide (CPPs) mit ausgezeichneter Membrantranslokationsfähigkeit entdeckt und haben sich als nützliche molekulare Transporter für den Transport verschiedener Frachten in Zellen erwiesen. Konventionelle lineare CPPs weisen jedoch im Allgemeinen eine beeinträchtigte proteolytische Stabilität auf, was ihre Permeabilität über biologische Barrieren hinweg einschränkt. Daher ist die Entwicklung neuartiger molekularer Transporter, die biologische Barrieren durchdringen können und eine verbesserte proteolytische Stabilität aufweisen, sehr wünschenswert, um die Effizienz der Wirkstoffabgabe in biomedizinischen Anwendungen zu fördern. Wir haben zuvor eine Reihe von kurzen zyklischen CPPs mit aromatischen Vernetzungen synthetisiert, die im Vergleich zu ihren linearen Gegenstücken eine überlegene Permeabilität in Krebszellen und -geweben aufwiesen. In dieser Arbeit wird ein prägnantes Protokoll für die Synthese des fluoreszenzmarkierten zyklischen Polyarginin-R8-Peptids und seines linearen Gegenstücks sowie wichtige Schritte zur Untersuchung ihrer Zellpermeabilität beschrieben.

Einleitung

In den letzten Jahrzehnten gab es rasante Fortschritte bei der Entwicklung von zellpenetrierenden Peptiden (CPPs) für die Verabreichung von Medikamenten. CPPs werden häufig als molekulare Transporter zur Behandlung einer Reihe von lebensbedrohlichen Krankheiten eingesetzt, darunter neurologische Erkrankungen^1,2, Herzerkrankungen³, Diabetes⁴, Dermatose⁵ und Krebs ^6,7. Krebs ist nach wie vor eine globale Gesundheitsbelastung, die mit einer hohen Morbiditäts- und Mortalitätsrate einhergeht, trotz breit angelegter Forschungsbemühungen⁸. Ein ernsthaftes Hindernis für die Behandlung von Krebs ist der eingeschränkte Zugang von Therapeutika zu tieferen Tumorzellen aufgrund physiologischer Barrieren wie der kompakten extrazellulären Matrix (EZM), abnormen Tumorgefäßen, multiplen Membranbarrieren und hohem interstitiellen Flüssigkeitsdruck (IFP)⁹. Daher wird die Entwicklung neuartiger CPPs mit überlegener Fähigkeit, Ladungen über biologische Barrieren hinweg zu transportieren, als eine wesentliche Strategie für die Krebsbehandlung angesehen^10,11.

CPPs können hinsichtlich ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften in kationische, amphipathische und hydrophobe CPPs eingeteilt werden¹². Unter diesen sind das positiv geladene HIV-TAT-Peptid und das synthetische Polyarginin von erheblicher Bedeutung in der biomedizinischen Forschung und wurden ausgiebig untersucht, um die intrazelluläre Wirkstoffverabreichung zu erleichtern¹³. Tunnemann et al. berichteten, dass eine Mindestlänge von acht Argininen für eine effiziente Zellpenetration der synthetischen Polyarginin-Peptide unerlässlich ist, basierend auf einer Zellpermeabilitätsstudie, die mit R3- bis R12-Peptiden durchgeführt wurde¹⁴. Diese CPPs haben jedoch aufgrund ihrer schnellen Hydrolyse in vivo in der Regel kurze Plasmahalbwertszeiten. Darüber hinaus ist wenig über die Optimierung der chemischen Struktur von CPPs bekannt, um ihre Transbarrierefähigkeit zu erhöhen, da es schwierig ist, mehrere Zellmembranen zu durchdringen¹⁵. Daher ist die Entwicklung neuartiger molekularer Transporter, die in der Lage sind, biologische Barrieren zu durchdringen, dringend erwünscht, um die Effizienz der Wirkstoffabgabe zu verbessern. Im Jahr 2020 entdeckten Komin et ^al.16 ein CPP namens CL-Peptid, das ein Helix-Motiv (RLLRLLR) und einen Polyarginin-Schwanz (R7) zur Durchquerung der Epithel-Monoschicht enthält. Eine Reihe von CL-Peptidvarianten wurde ebenfalls synthetisiert, indem das helikale Muster verändert wurde. Diese Erkundung könnte ein wichtiger Leitfaden für die Entwicklung neuartiger CPPs für die Lieferung von Ladungen über biologische Barrieren hinweg sein. Darüber hinaus optimierten Dietrich et al. die Zellpermeabilität des StAX-Peptids, indem sie den Wnt/β-Catenin-Signalweg hemmten, indem sie die Gesamthydrophobie der Peptide erhöhten¹⁷.

Die Konformationsrestriktion von unstrukturierten linearen Peptiden durch Cyclisierung ist ein effektiver Weg, um ihre proteolytische Stabilität und Permeabilität zu verbessern^18,19,20. Die strukturelle Verstärkung erhöht die Proteaseresistenz zyklischer Peptide und macht sie in vivo im Vergleich zu ihren linearen Gegenstücken stabiler. Darüber hinaus kann die Cyclisierung von Peptiden potenziell das polare Peptidrückgrat maskieren, indem sie intramolekulare Wasserstoffbrückenbindungen fördert und so die Membranpermeabilität der Peptide²¹ erhöht. In den letzten zwei Jahrzehnten haben sich chemoselektive Cyclisierungsmethoden zu effektiven Strategien für die Konstruktion zyklischer Peptide mit unterschiedlichen Architekturen entwickelt, wie z. B. reiner Kohlenwasserstoff, Lactam, Triazol, m-Xylol, Perfluoraryl und anderen Querverbindungen^22,23. Die biologische Barriere, die durch die ausgeklügelte Tumormikroumgebung auferlegt wird, könnte das Eindringen von Medikamenten in solide Tumore verringern²⁴. Wir haben bereits festgestellt, dass die zyklischen CPPs eine überlegene Resistenz gegen enzymatische Verdauung aufwiesen als ihre linearen Gegenstücke²⁰. Darüber hinaus ist die Gesamthydrophobie der Peptide entscheidend für ihre verbesserte Zellpermeabilität²². Basierend auf den oben diskutierten Studien kann die Hypothese aufgestellt werden, dass die Kombination aus einem positiv geladenen Muster, einer erhöhten Gesamthydrophobie und einer verbesserten Proteolysestabilität die Permeabilität von CPPs über biologische Barrieren hinweg erhöht. In einer kürzlich durchgeführten Studie haben wir zwei zyklische CPPs mit aromatischen Vernetzungen an den Positionen i und i+7 identifiziert, die im Vergleich zu ihren linearen Gegenstücken eine verbesserte Permeabilität in Tumorzellen und -geweben aufweisen¹⁵. In dieser Arbeit werden ein prägnantes Syntheseprotokoll für die Synthese fluoreszenzmarkierter zyklischer CPPs und die wichtigsten Schritte zur Untersuchung ihrer Permeabilität vorgestellt.

Protokoll

1. Vorbereitung der Ausrüstung

Anmerkungen: Führen Sie alle Vorgänge in einem Betriebsabzug mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung durch.

1. Montieren Sie die manuelle Peptidsynthesevorrichtung im Abzug (Abbildung 1). Setzen Sie die Dreiwegehähne (siehe Materialtabelle) auf den Vakuumverteiler (siehe Materialtabelle) und schließen Sie sie an den Stickstoff (N₂) an. Stellen Sie sicher, dass Sie die ungenutzten Einlässe verschließen.
2. Befestigen Sie eine 10-ml-Polypropylensäule (siehe Materialtabelle) an den Dreiwegehähnen. Lassen Sie das Reaktionsgemisch oder die Lösungsmittel mit einem Gummipipettenkolben oder einem Vakuum über einen Abfallabscheider aus der Polypropylensäule ab.

2. Synthese von FITC-markiertem linearem R8-Peptid (FITC-R8) und FITC-markiertem geklammertem R8-Peptid (FITC-sR8-4)

HINWEIS: Die Peptide wurden gemäß einem Standardprotokoll der Fmoc-basierten Festphasenpeptidsynthese (SPPS) synthetisiert²⁵. Das 4-(2',4'-Dimethoxypheyl-Fmoc-aminomethyl)-phenoxyacetamido-norleucyl-MBHA-Harz (Rink-Amid-MBHA-Harz, siehe Materialtabelle) wurde während der gesamten Studie verwendet.

VORSICHT: N, N-Dimethylformamid (DMF), N, N-Diisopropylethylamin (DIPEA), Morpholin und Dichlormethan (DCM) sind alle farblos und schädlich, wenn sie eingeatmet oder über die Haut aufgenommen werden. Äther ist hochentzündlich. 1,2-Ethanedithiol (EDT) ist eine besonders geruchsintensive Substanz. Trifluoressigsäure (TFA) ist stark korrosiv und ihr Säuregehalt ist 10 bis⁵ Mal so hoch wie der von Essigsäure. Folglich sollten alle Reagenzien und Chemikalien mit Schutzausrüstung in einem Abzug behandelt werden.

1. Bereiten Sie das Harz für die Peptidsynthese vor.
   1. Berechnen Sie die für die Synthese benötigte Harzmasse:Masse des Harzes (mg) = Zunder (mmol) / Harzbeladungskapazität (mmol/g) × 1.000 (mg/g)
      HINWEIS: Zum Beispiel die Masse des Eisbahnamid-MBHA-Harzes (0,572 mmol/g) für 0,2 mmol = 0,2 mmol / 0,572 mmol/g × 1.000 mg/g = 350 mg.
   2. Fügen Sie 4-5 ml DMF zur erforderlichen Menge Harz hinzu und geben Sie es in die 10-ml-Polypropylensäule (Schritt 1.2), wobei N₂ 30 Minuten lang sanft sprudelt, um das Harz ausreichend aufzuquellen, und lassen Sie dann das ZMS ab.
   3. Fügen Sie dem Harz 4-5 ml 50% Morpholin/DMF (v/v) hinzu, blasen Sie N₂ 30 Minuten lang 2x lang sanft auf, um die N-terminale Fmoc-Gruppe zu entfernen, und lassen Sie die Mischung dann abtropfen. Waschen Sie das Harz anschließend 3x gründlich, indem Sie 4-5 ml DMF in die Säule geben und jedes Mal mindestens 1 Minute lang mit N₂ sprudeln. Waschen Sie das Harz weiterhin mit DCM (3x) und DMF (3x) auf die gleiche Weise.
2. Führen Sie die Fmoc-geschützte Aminosäurekopplung wie unten beschrieben durch.
   HINWEIS: Die Kopplung von Arginin in einer manuellen Synthese im 0,2-mmol-Maßstab wird hier als Beispiel beschrieben.
   1. Fmoc-Arg (Pbf)-OH (5-Äquiv., 648,8 mg) und 2-(7-Azobenzotriazol)-N, N, N', N'-Tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HATU, 4,9 Äquivalent, 372,6 mg) in 5 ml DMF in einem Zentrifugenröhrchen lösen.
   2. Zur Aktivierung der Kupplungsreaktion wird DIPEA (entspricht 10, 348,4 μl) zugegeben und dann das Reaktionsgemisch mit Harz in die 10-ml-Polypropylensäule überführt (hergestellt in Schritt 2.1.3). Dann rühren Sie die Mischung vorsichtig mit_N2-Sprudel für 1-2 h.
   3. Die Kupplungsreaktion (Schritt 2.2.1 und Schritt 2.2.2) einmal wiederholen.
   4. Nach Abschluss der Kopplung das Reaktionsgemisch abtropfen lassen und das Harz nacheinander mit DMF, DCM und DMF jeweils 3x für jeweils mindestens 1 min waschen.
   5. Führen Sie die Kopplung jeder Aminosäure in geordneten Schritten durch: Fügen Sie dem Harz 4-5 ml 50% Morpholin/DMF (v/v) hinzu, sprudeln Sie 30 Minuten lang 2x vorsichtig mit_N2, um die N α-Fmoc-Gruppe zu entfernen, waschen Sie dann das Harz (wie in Schritt 2.2.4 gezeigt) und fahren Sie mit der Kopplung der nächsten Aminosäure fort (wie in Schritt 2.2.1 und Schritt 2.2.2 gezeigt). Fahren Sie mit mehreren Zyklen dieses Schritts fort, um die Synthese des gewünschten Peptids zu erreichen.
      HINWEIS: Dieser Vorgang kann hier pausiert werden. Kondensieren Sie das Harz mit Methanol und trocknen Sie das Harz mit einem kontinuierlichen Fluss von N₂. Verschließen Sie die Polypropylensäule und lagern Sie das Harz dann einige Tage bei 4 °C (oder bei −20 °C bei längerer Lagerung). Quellt das Harz mit 4-5 ml DMF für 0,5-1 h auf, bevor eine neue Synthese beginnt. Wenn Sie direkt mit dem nächsten Schritt fortfahren, ist es nicht erforderlich, das Harz zu kondensieren.
3. Markieren Sie die Peptide wie unten beschrieben mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC).
   1. Koppeln Sie das Beta-Alanin als Abstandshalter für die FITC-Markierung mit dem gleichen Verfahren wie bei der Aminosäurekopplung in Schritt 2.2.
   2. Führen Sie eine FITC-Markierung von Peptiden auf dem Harz durch, indem Sie eine Mischung aus FITC (5 Äquiv.), DIPEA (10 Äquiv.) und DMF in die Polypropylensäule geben und 8 Stunden lang im Dunkeln reagieren.
4. Für die Synthese von FITC-sR8-4 wird die Cyclisierung des linearen Peptids wie unten beschrieben durchgeführt.
   1. Geben Sie eine Mischung aus TFA/Triisopropylsilan (TIS)/DCM (3/5/92, v/v/v) für 2 Minuten in die Polypropylensäule, um die Cys (Trt)-Schutzgruppe selektiv zu entfernen, und lassen Sie die Mischung dann ab. Wiederholen Sie den obigen Vorgang, bis die gelbliche Lösung farblos wird, um die Trt-Schutzgruppe vollständig zu entfernen.
   2. Führen Sie anschließend mindestens 3x sequentielle Waschvorgänge des Harzes mit DMF und DCM durch. Danach 4,4'-Bis(brommethyl)biphenyl (2 Äquiv.) in DMF mit DIPEA (4 Äquiv.) lösen, in die Säule geben und 4 h reagieren.
5. Spalten Sie die Peptide wie beschrieben: Waschen Sie das Harz nach Abschluss der Peptidsynthese zweimal zweimal für 5 min mit 4-5 mL Methanol und trocknen Sie es mit einem kontinuierlichen Fluss von N₂. Behandeln Sie das Harz mit einem wirksamen Spaltcocktail TFA/TIS/H 2 O (95/2,5/2,5, v/v/v) oder TFA/TIS/EDT/H 2 O (_92,5/2,5/2,5/2,5, v/v/v/v) für Cysteinhaltige Peptide, wobei Sie etwa 1 ml Spaltcocktail pro 100 mg Harz verwenden. Behandeln Sie das peptidgebundene Harz 2-3 h lang, um das Peptid zu spalten, und entfernen Sie dann das TFA vorsichtig mit einem Strom von_N2.
6. Um die rohen Peptide zu erhalten, werden 4-5 ml Diethylether in die gespaltene Peptidzubereitung gegeben, um die rohen Peptide auszufällen, und bei 10.000 × g für 4 min zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und lassen Sie das Peptid 3 Minuten lang in einem wirksamen Abzug an der Luft trocknen.
7. Analyse der Peptide: Lösen Sie ein rohes Peptid in kleinem Maßstab (gespalten aus ca. 10 mg peptidgebundenem Harz) in 800 μl Acetonitril (ACN)/_H2O (1/1, v/v) und analysieren Sie es anschließend mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) und Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) (siehe Materialtabelle).
8. Aufreinigung der Peptide mittels RP-HPLC und LC-MS.
   1. Lösen Sie 50 mg Rohpeptidprodukt in 4 ml ACN/_H2O(1/1, v/v) auf und injizieren Sie die Lösung in ein RP-HPLC-System, das mit einer C18-Säule ausgestattet ist (4,6 mm x 150 mm, Porengröße: 120 Å, Partikelgröße: 4 μm; siehe Materialtabelle). Das Peptid wird mit einer mobilen Phase eluiert, die 0,1 % TFA/_H2O (v/v) und ACN enthält, mit einem Gradienten von 10 % bis 90 % ACN über 30 Minuten. Konventionelle Peptide wurden bei 220 nm und FITC-markierte Peptide bei 494 nm detektiert.
   2. Sammeln Sie die Fraktionen, die dem Hauptpeptidpeak entsprechen, wie er durch MS identifiziert wurde, und lyophilisieren Sie dann die gewünschten Peptidfraktionen. Lagern Sie das gereinigte Peptid bei −20 °C.
      HINWEIS: Die gefundenen m/z des gereinigten FITC-R8 lauten wie folgt: [M + 3 H]³⁺: 576,63; [M + 4 H] ⁴⁺: 432,72; [M + 5 H] ⁵⁺: 346,39; [M + 6 H] ⁶⁺: 288,85. Die gefundenen m/z des gereinigten FITC-sR8-4 lauten wie folgt: [M + 3 H]³⁺: 704.74; [M + 4 H] ⁴⁺: 528,77; [M + 5 H] ⁵⁺: 423,34; [M + 6 H] ⁶⁺: 352,91. MS-Analysebedingungen: Instrument: ESI (Sondenvorspannung: +4,5 kV; Detektor: 1,2 kV); Gasdurchfluss des Verneblers: 1,5 l/min; gekrümmte Desolvationslinie (CDL): −20 V; CDL-Temperatur: 250 °C; Blocktemperatur: 400 °C; Flussrate: 0,2 ml/min; mobile Phase: 50 % H₂O/50 % ACN.

3. Quantifizierung der FITC-markierten Peptide

1. Lösen Sie eine kleine Menge des gereinigten Peptids in DMSO als Stammlösung (z. B. 40 μmol/ml).
2. Messen Sie die Absorption bei 494 nm (A 494) von 2 μl der Stammlösung in₄₉₈ μl 10 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS, pH 7,4) mit einer Mikrotiterplatte (siehe Materialtabelle) unter Verwendung eines Multitechnologie-Mikroplatten-Readers (siehe Materialtabelle). Der Verdünnungsfaktor beträgt 500 μL/ 2 μL = 250, und die Weglänge der Mikrotiterplatte beträgt 0,5 mm.
3. Berechnen Sie die Konzentration der Stammlösung mit der folgenden Formel:
   Konzentration (mM) = A₄₉₄ × Verdünnungsfaktor / 0,05 (cm) / 77.000 (cm⁻¹· M−1) × 1.000 (mM·M⁻¹)
4. Stellen Sie eine angemessene Verdünnung ein, so dass der gemessene A_494-Wert zwischen 0,1 und 1,0 liegt.
   Anmerkungen: Die Messungen sollten mehrmals wiederholt werden, um sicherzustellen, dass die gemessene Konzentration genau ist. Der Extinktionskoeffizient von 77.000 cm⁻¹· M⁻¹ geht aus der FITC-Gruppe hervor.

4. Stabilität von Peptiden im fötalen Kälberserum (FBS)

1. Inkubieren Sie das Peptid in einer Konzentration von 100 μM mit 250 μL 25% FBS/_H2O(v/v) bei 37 °C. Nach einer Inkubationszeit von 0 h, 1 h, 2 h und 4 h werden 10 μl Aliquots entnommen und dann 150 μl 12%ige Trichloressigsäure, gelöst in_H2O/ACN (1/3, v/v), hinzugefügt, um die Serumproteine auszufällen.
2. Zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 × g für 5 min und analysieren Sie den Überstand mittels HPLC (wie in Schritt 2.8 beschrieben), um das Ausmaß des Peptidabbaus zu bestimmen.
3. Berechnen Sie das Verhältnis der Peakfläche bei 1 h, 2 h und 4 h zu dem bei 0 h, um den Anteil des nicht abgebauten Peptids zum entsprechenden Zeitpunkt zu erhalten. Das Ergebnis ist der Durchschnitt von drei parallelen Stichproben.

5. Zelluläre Aufnahme der Peptide

1. Fluoreszenzmikroskopische Bildgebung
   1. Legen Sie ein rundes Deckglas in eine 12-Well-Platte. Dann 1 x 10^{5 Zellen gleichmäßig} auf Deckgläser beimpfen und über Nacht mit 2 ml Medium kultivieren. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen 3x mit 1 ml PBS.
      HINWEIS: In dieser Studie wurden HeLa-Zellen und 4T1-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, siehe Materialtabelle) kultiviert, das mit 10 % FBS in einem bei 37 °C befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ ergänzt wurde.
   2. Inkubieren Sie die Zellen mit 1 ml 3 μM FITC-markierten Peptiden in FBS-freiem DMEM für 1 h bei 37 °C. Entfernen Sie anschließend das peptidhaltige Medium und waschen Sie die Zellen 3x mit 1 ml PBS.
   3. Die Zellen mit 1 ml Hoechst 33258 für 15 min anfärben. Beobachten Sie die Internalisierung jedes Peptids mit einem Fluoreszenzmikroskop (siehe Materialtabelle) mit der gleichen Fluoreszenzintensität und Belichtungszeit.
      HINWEIS: Die folgenden Einstellungen wurden für die Fluoreszenzmikroskopie verwendet. Objektiv: Plan-Apochromat: 63 x/1,40 Öl DIC M27; Kanal 1 für FITC: Anregungsfilter: 450-490 nm, Emissionsfilter: 500-550 nm, Belichtungszeit: 230 ms; Kanal 2 für Hoechst 33258: Anregungsfilter: 335-383 nm, Emissionsfilter: 420-470 nm, Belichtungszeit: 27 ms.
2. Durchflusszytometrische Analyse
   1. 5 x 10⁵ HeLa-Zellen gleichmäßig in 12-Well-Platten beimpfen und 24 h bei 37 °C in DMEM kultivieren. Entfernen Sie anschließend das Medium und waschen Sie die Zellen 3x mit 1 ml PBS.
   2. Inkubieren Sie die Zellen mit 1 ml 3 μM FITC-markierten Peptiden in FBS-freiem DMEM für 1 h bei 37 °C. Entfernen Sie das peptidhaltige Medium, dissoziieren Sie die Zellen mit 0,25 % (w/v) Trypsin und 0,53 mM EDTA in PBS für 5 min und sammeln Sie die Zellen dann durch Zentrifugation bei 306 × g für 4 min. Waschen Sie das Zellpellet mit PBS.
   3. Inkubieren Sie die Zellen mit 1 ml 0,05 % (w/v) Trypanblau in PBS für 3 Minuten, um die oberflächengebundene Fluoreszenz zu löschen, und führen Sie eine quantitative Analyse der intrazellulären Fluoreszenz mit einem Durchflusszytometer durch (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Durchflusszytometrie-Einstellungen: Anregung: 488 nm, Emission: 530 nm. Trypanblau kann auch die Fluoreszenz abgestorbener Zellen unterdrücken und bei der Analyse der Peptidaufnahme helfen, lebende und tote Zellen zu unterscheiden.
   4. Behandlung und Analyse von 4T1-Zellen mittels Durchflusszytometrie nach dem gleichen Protokoll wie bei HeLa-Zellen. Sammeln Sie 5 x 10⁵ Zellen pro Probe und stellen Sie drei parallele Proben pro Gruppe auf.

6. Untersuchung der Zell-zu-Zell-Penetration der Peptide mit Hilfe von Transwell-Modellen

1. Inokulieren Sie 1 x 10 5 HeLa-Zellen in 2 ml DMEM in einer 12-Well-Kammer mit einem Gewebekulturplatteneinsatz (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie sie 24 h lang in einem bei 37 °C befeuchteten Inkubator mit⁵ % CO₂. Anschließend wird das Medium entnommen und die Zellen in den Kammern mit 1 mL 10 μM FITC-R8 oder FITC-sR8-4 (mittels HPLC gereinigt) in FBS-freiem DMEM für 1 h inkubiert.
2. Entfernen Sie das Medium, das die Peptide enthält, und waschen Sie die Zellen 3x mit 1 ml PBS. Geben Sie 1 ml frisches FBS-freies DMEM in die Kammern und inkubieren Sie dann die HeLa-Zellen in der Kammer mit der Gewebekulturplatte für 2 h mit den HeLa-Zellen auf den runden Deckgläsern am Boden.
3. Fixieren Sie die HeLa-Zellen mit 2,5 % Glutaraldehyd für 15 min auf den runden Deckgläsern und färben Sie die Zellen dann 15 min lang mit DAPI an. Beobachten Sie dann die HeLa-Zellen auf den Deckgläsern unter einem Fluoreszenzmikroskop. Behandeln und untersuchen Sie 4T1-Zellen mit dem gleichen Protokoll wie HeLa-Zellen.

Ergebnisse

In diesem Protokoll wurde ein Syntheseverfahren vorgestellt, um das lineare Polyarginin R8 in seine cyclische Form zu bringen. Die SPPS wurde manuell mit einer einfachen Apparatur durchgeführt (Abbildung 1). Der detaillierte Syntheseprozess von SPPS ist in Abbildung 2 dargestellt. Kurzzeitig war das Harz ausreichend aufgequollen, gefolgt von der Entschützung der N α-Fmoc-Schutzgruppe. Anschließend wurde die N α-Fmoc-geschützte A...

Diskussion

Die chemische Stabilisierung von Peptiden unter Einbeziehung von Konformationsbeschränkungen hat sich als effektive Strategie zur Verbesserung der Stabilität und Zellpermeabilität des Peptids²⁶ erwiesen. In diesem Protokoll wird ein schrittweises Vorgehen für die Synthese zyklischer CPPs mit aromatischen Querverbindungen und die Bewertung ihrer Permeabilität über biologische Barrieren hinweg beschrieben. Im Vergleich zu den hydrophilen Lactam- oder Triazol-Quervernetzungen^2...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-ethanedithiol	Aladdin	K1722093	stench
2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU)	HEOWNS	A-0443697
4,4'-bis(bromomethyl)biphenyl	TCI	B1921
4T1 cells	ATCC		4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2.
Acetonitrile	Adamas	1484971	toxicity
Dichloromethane	Energy	W330229	skin harmful
Diethyl ether	Aldrich	673811	flammable
Dimethyl sulfoxide	Beyotime	ST038	skin harmful
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco
Electrospray Ionization Mass Spectrometer	Waters	G2-S Tof
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)	BioFroxx	1340
Fetal bovine serum (FBS)	HyClone
Flow cytometer	Beckman Coulter	CytoFLEX
Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC)	Energy	E0801812500
Fluorescent microscope	Carl Zeiss	Axio Observer 7
Fmoc-Arg(Pbf)-OH	HEOWNS	F-81070
Fmoc-Cys(Trt)-OH	GL Biochem	GLS201115-35202
Fmoc-βAla-OH	Adamas	51341C
HeLa cells	ATCC		HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2.
High-Performance Liquid Chromatography	Agilent	Agilent 1260
High-Performance Liquid Chromatography column	Agilent	Poroshell EC-C18 120, 4.6 × 150 mm (pore size 120 Å, particle size 4 μm)
Lyophilizer	SP Scientific	Vir Tis
Methanol	Aldrich	9758	toxicity
Microtiter plate	Thermo μdrop plate	N12391
Morpholine	HEOWNS	M99040	irritant
Multi-technology microplate reader	Thermo	VARIOSKAN LUX
N,N-Diisopropylethylamine	HEOWNS	E-81416	irritant
N,N-Dimethyl formamide	Energy	B020051	harmful to skin
Poly-Prep column	Bio-Rad	7321010	polypropylene chromatography columns
Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g)	GL Biochem	GLS180301-49101
Three-way stopcocks	Bio-Rad	7328107
Tissue culture plate insert	LABSELECT	14211
Trifluoroacetic acid	HEOWNS	T63278	corrosive
Triisopropylsilane	HEOWNS	T-0284475
Trypsin	BioFroxx	1004
Vacuum manifold	Promega	A7231