JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Erratum Notice
  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Erratum
  • Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Summary

רקמות לב תלת-ממדיות שהונדסו ביולוגית באמצעות קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע התגלו כמודלים מבטיחים לחקר שריר הלב האנושי הבריא והחולה במבחנה תוך שחזור היבטים מרכזיים של נישת הלב הטבעית. כתב יד זה מתאר פרוטוקול לייצור וניתוח רקמות לב מהונדסות בעלות תוכן גבוה שנוצרו מקרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע המושרים על ידי בני אדם.

Abstract

אי ספיקת לב נותרה סיבת המוות המובילה ברחבי העולם, מה שיוצר צורך דחוף במודלים פרה-קליניים טובים יותר של הלב האנושי. הנדסת רקמות חיונית למחקר לב מדעי בסיסי; תרבית תאים אנושית במבחנה מבטלת את ההבדלים בין המינים של מודלים של בעלי חיים, בעוד שסביבה תלת-ממדית דמוית רקמה יותר (למשל, עם מטריצה חוץ-תאית וצימוד הטרו-תאי) מדמה תנאי in vivo במידה רבה יותר מאשר תרבית דו-ממדית מסורתית על צלחות פטרי מפלסטיק. עם זאת, כל מערכת מודל דורשת ציוד מיוחד, למשל, ביוריאקטורים שתוכננו בהתאמה אישית והתקני הערכה פונקציונליים. בנוסף, פרוטוקולים אלה הם לעתים קרובות מסובכים, עתירי עבודה, ונגועים בכשל של רקמות קטנות ועדינות.

מאמר זה מתאר תהליך ליצירת מערכת מודל חזקה של רקמת לב מהונדסת אנושית (hECT) באמצעות קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים מושרים שמקורם בתאי גזע לצורך מדידה אורכית של תפקוד הרקמות. שישה hECTs עם גיאומטריית רצועה ליניארית מתורבתים במקביל, כאשר כל hECT תלוי מזוג עמודי פולידימתילסילוקסאן (PDMS) חישת כוח המחוברים לארונות תקשורת PDMS. כל פוסט מכוסה במעקב פוסט יציב PDMS שחור (SPoT), תכונה חדשה המשפרת את קלות השימוש, התפוקה, שימור הרקמות ואיכות הנתונים. הצורה מאפשרת מעקב אופטי אמין אחר סטיות פוסט, ומניבה עקבות כוח עווית משופרות עם מתח אקטיבי ופסיבי מוחלט. גיאומטריית המכסה מבטלת כשל רקמות עקב hECTs המחליקים מהעמודים, ומכיוון שהם כרוכים בשלב שני לאחר ייצור ארון תקשורת PDMS, ניתן להוסיף את ה- SPoTs לתכנונים קיימים מבוססי PDMS לאחר ללא שינויים משמעותיים בתהליך ייצור הביוריאקטורים.

המערכת משמשת להדגמת החשיבות של מדידת תפקוד hECT בטמפרטורות פיזיולוגיות ומראה תפקוד רקמה יציב במהלך איסוף נתונים. לסיכום, אנו מתארים מערכת מודל חדישה המשחזרת מצבים פיזיולוגיים מרכזיים כדי לקדם את הנאמנות הביולוגית, היעילות והקפדנות של רקמות לב מהונדסות ליישומי מבחנה .

Introduction

מודלים הנדסיים של רקמת לב מגיעים במגוון רחב של גיאומטריות ותצורות לסיכום היבטים שונים של נישת הלב הטבעית שקשה להשיג עם תרבית תאים דו-ממדית מסורתית. אחת התצורות הנפוצות ביותר היא רצועת הרקמה הליניארית, עם עוגנים גמישים בכל קצה כדי לגרום להרכבה עצמית של הרקמה ולספק לרקמה עומס מקדים מוגדר וקריאה של כוחות העווית המתקבלים 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21
,22,23,24,25,26,27. ניתן לקבוע את הכוח שנוצר באמצעות מעקב אופטי אחר קיצור הרקמה ושימוש בתורת הקרן האלסטית כדי לחשב את הכוח מהסטיות הנמדדות וקבוע הקפיץ של העוגנים 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,
21,22,25,26,28.

עם זאת, הנדסת רקמות לב היא עדיין תחום מתפתח, וכמה אתגרים נותרו. ציוד מיוחד, כגון ביוריאקטורים בהתאמה אישית והתקני הערכה פונקציונליים, נדרשים עבור כל מערכת דגם 10,29,30,31. הגודל והמורכבות של המיקרו-סביבה של מבנים אלה מוגבלים לעתים קרובות על ידי תפוקה נמוכה עקב פרוטוקולים עתירי עבודה, מספר גבוה של תאים ושבריריות רקמות. כדי להתמודד עם זה, כמה קבוצות פנו לייצור של מיקרו-רקמות המכילות רק מאות או אלפי תאים כדי להקל על בדיקות תפוקה גבוהה כי הם שימושיים לגילוי תרופות. עם זאת, קנה מידה מופחת זה מסבך את ההערכה המדויקת של תפקוד12, מבטל היבטים מרכזיים של נישה לבבית טבעית (כגון שיפועים של דיפוזיה של חומרים מזינים / חמצן וארכיטקטורה מורכבת36), ומגביל את כמות החומר הזמין לניתוח מולקולרי ומבני לאחר מכן (לעתים קרובות דורש איגום של הרקמות). טבלה 1 מסכמת חלק מהתצורות של מודלים של רצועות רקמה ליניאריות בספרות 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20,
21,22,23,24,25,26,37,38,39,40.

קבוצהתאים לרקמהרקמות לצלחתפורמט צלחתתכונת עיגוןשיטת רכישת נתונים פונקציונליתאמבט מדיה משותף?מדד פונקציונלי-
מנט באתרו?
יושידה (ECT)384 מיליון6צלחת שונה עם 6 בארות*מתמר כוחמדידת כוח ישירלאלא
צ'אן (hESC-CM-ECTs)26310 אלף6מנה מותאמת אישית של 6 בארותהודעות PDMSמדידת כוח ישירכןלא
פיינברג (DYN-EHT)161.5 מיליון6מנה מותאמת אישית של 6 בארותחוט PDMSצורת רקמהלאכן
רדיסי (BioWire)39, 40110 אלף8חוט פולימריצורת חוטכןכן
קוסטה (hECT)1, 21-2 מיליון4**צלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ**הודעות PDMSסטייה אופטית (מעקב אחר קצוות/אובייקטים)כןכן
קוסטה (multi-hECT)3–9500 K-1 מיליון6צלחת פטרי בקוטר 6 ס"מהודעות PDMSסטייה אופטית (מעקב אחר קצוות/אובייקטים)כןכן
קוסטה (multi-hECT עם SPoT)1 מיליון6צלחת פטרי בקוטר 6 ס"מפוסטים PDMS עם אותיות גדולות בשחורסטייה אופטית (מעקב אחר אובייקטים)כןכן
פסייר (EHT)17245 אלף36צלחת 12 בארותפוסטים PDMS עם אותיות גדולות בשחורסטייה אופטית (מעקב אחר אובייקטים)כןכן
וונג'אק-נובקוביץ'13, 181 מיליון12צלחת פטרי בקוטר 6 ס"מהודעות PDMS עם מכסותסטייה אופטית (זיהוי שוליים)כןכן
ווניאק-נובקוביץ' (מיליפילאר)14550 אלף6מנה מותאמת אישית של 6 בארותהודעות PDMS עם מכסותסטייה אופטית (מעקב אחר אובייקטים); הדמיית סידןלאכן
Eschenhagen (EHT)10, 19–211 מיליון12צלחת 12 בארותהודעות PDMS עם מכסותסטייה אופטית (זיהוי קצה של סטייה לאחר מכן); הדמיית סידןלאכן
זנדסטרה (קמירי)2225-150 אלף96צלחת 96 בארהודעות PDMS עם וויםסטייה אופטית (זיהוי שוליים)לאכן
מורי23, 24900 אלף24צלחת 24 בארותעמודי PDMS עם מכסים, מגנט משולבחיישן מגנטילאכן
רייך (μTUG)11, 12, 25מוגדר156מנה של 156 בארותעמודי PDMS עם מכסים, מגנט משולבמעקב אופטי (חרוז פלואורסצנטי)כןכן

טבלה 1: מאפיינים של כמה מודלים ליניאריים של רקמת לב מהונדסת בספרות. מודלים ליניאריים של רקמת לב מהונדסים משתנים בגודל, בתפוקה, בעיצובי תכונות העיגון ובהקלה על אמבטיות בינוניות משותפות, כמו גם בדרישות למערכת אמבט שרירים נפרדת לאפיון פונקציונלי. * החוקרים השתמשו במערכת רקמות מהונדסת זמינה מסחרית המבוססת על הממדים של צלחת סטנדרטית בעלת 6 בארות. ** מערכת מודולרית שבה ביוריאקטורים של רקמה בודדת מעוגנים לכל צלחת תרבית פלסטיק במספר ובמיקום הרצויים.

מאמר זה מתאר את הפרוטוקול העדכני ביותר לייצור המודל המבוסס שלנו של רקמת לב מהונדסת אנושית ליניארית (hECT)1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 ושיטות להערכת תפקוד התכווצות hECT. כל ביוריאקטור רב-רקמתי מכיל עד שישה hECTs באמבטיה בינונית משותפת ומורכב משתי חתיכות "מתלה" העשויות מאלסטומר סיליקון פולידימתילסילוקסאן (PDMS) המורכב על מסגרת פוליסולפון קשיחה. כל ארון תקשורת PDMS מכיל שישה עמודי חישת כוח משולבים גמישים בקוטר 0.5 מ"מ ובאורך 3.25 מ"מ, ויחד, שני ארונות תקשורת מספקים שישה זוגות עמודים, שכל אחד מהם מכיל hECT אחד. היפוך הביוריאקטור מסייע להתגבר על כל מכשול להדמיה של hECTs מלמטה עקב עיבוי מים ממדיום התרבית או עיוותים מהמניסקוס של ממשק אוויר-נוזל. כל התכווצות של hECT גורמת להטיה של עמדות הקצה המשולבות, והמדידה האופטית של אות הסטייה מעובדת למעקב כוח לעומת זמן המייצג את פונקציית ההתכווצות של hECT 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 . בהשוואה לביוריאקטורים של רקמה בודדת המשמשים בדרך כלל לרקמות בגודל זה, התכנון הרב-רקמתי משפר את תפוקת הניסוי ומאפשר לחקור איתות פרקריני בין רקמות סמוכות בעלות הרכב תאי שונה. מערכת זו אומתה במחקרים שפורסמו המתארים יישומים במידול מחלות 4,8, איתות פרקריני 6,7, תרבית הטרו-תאית 5,9 וסינון טיפולי 7,9.

במערכת זו, hECTs מתוכננים להיות באורך של כ -6 מ"מ וקוטר של 0.5 מ"מ כדי להקל על מעקב אופטי חזק של מדידות כוח עם רעש נמוך. יתר על כן, היבטים של מורכבות הרקמה כגון שיפועי דיפוזיה וארגון תאי מאוזנים עם דרישה ניתנת לניהול של 1 מיליון תאים לכל רקמה. עם טכנולוגיית מצלמת CCD סטנדרטית, כוחות חלשים כמו 1 μN (המייצגים פחות מ -5 מיקרומטר לאחר הסטיה) מייצרים אות ברור, ומבטיחים כי אפילו תפקוד כיווץ חלש מאוד, כפי שנצפה עם כמה מודלים של מחלת hECT, ניתן למדוד במדויק. זה גם מקל על ניתוח מפורט של עקומת כוח העווית, ובכך מאפשר ניתוח תוכן גבוה של עד 16 מדדי התכווצות41, כולל כוח מפותח, שיעורי התכווצות (+dF / dt) והרפיה (−dF / dt), והשתנות קצב פעימה.

פרוטוקול זה מתחיל בהוראות לייצור רכיבי הביוריאקטורים. תשומת לב מיוחדת מוקדשת לצעדים כדי למקסם את תפוקת hECT, להפחית את השונות הטכנית בתפקוד הרקמה, ולייעל את האיכות והעומק של הערכת הרקמות. רוב מחקרי הנדסת רקמות הלב אינם מדווחים על שיעורי אובדן רקמות במהלך ייצור ובדיקות ארוכות טווח, אם כי זהו אתגר ידוע בתחום ומפחית את התפוקה והיעילות של המחקרים27. שיטות הנדסת הרקמות המתוארות כאן שוכללו במהלך השנים כדי להבטיח שמירה על כל hECTs ברוב הביוריאקטורים (ללא קשר לאופן הייצור של ארונות PDMS). עם זאת, אפילו אובדן של 5%-20% של רקמות יכול להשפיע באופן משמעותי על הכוח הסטטיסטי, במיוחד בניסויים קטנים יותר המוגבלים על ידי מספר הקרדיומיוציטים הזמינים (למשל, בשל אתגרי התמיינות עם כמה קווי תאים חולים4 או בשל העלות הגבוהה של קרדיומיוציטים שנרכשו באופן מסחרי), או על ידי מצב הטיפול (למשל, זמינות מוגבלת או עלות גבוהה של תרכובות טיפול שונות).

פרוטוקול זה מתאר ייצור של עוקבי פוסט יציבים (SPoTs), תכונה חדשה של ארונות תקשורת PDMS, המתפקדים כמכסים בקצות עמדות חישת הכוח המחזיקות את hECTs27. הוא מדגים כיצד גיאומטריית הכובע מפחיתה באופן משמעותי את אובדן hECT מנפילה או משיכת העמודים, ובכך פותחת הזדמנויות חדשות לטיפוח hECTs עם מגוון גדול יותר של נוקשות ומתחים, אשר מאתגרים את התרבות על עמודים לא מכוסים . בנוסף, ה- SPoTs מספק אובייקט בעל ניגודיות גבוהה לשיפור המעקב האופטי אחר התכווצות hECT באמצעות צורה עקבית ומוגדרת היטב27. לאחר מכן מופיע תיאור של גידול תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSCs) והתמיינות קרדיומיוציטים בהתבסס על פרוטוקולים 3,42,43 שפורסמו בעבר והסבר על ייצור hECT, תרבית ומדידות תפקודיות.

מאמר זה מתייחס גם לצורך למדוד את תפקוד הרקמה בטמפרטורה פיזיולוגית. שריר הלב האנושי (רקמות בריאות וחולות עובריות כמו גם בוגרות), כמו גם רקמת לב ממגוון רחב של מיני בעלי חיים (כולל חולדות, חתולים, עכברים, חמוסים וארנבות)44,45, מציג עלייה ניכרת בכוח העווית התואם לתדר בטמפרטורות של 28 ° C - 32 ° C בהשוואה לטמפרטורה פיזיולוגית - תופעה המכונה אינוטרופיה היפותרמית45, 46. עם זאת, ההשפעות של הטמפרטורה על תפקוד רקמת שריר הלב המהונדסת עדיין לא נחקרו. מודלים רבים של רקמת לב מהונדסים לאחרונה בספרות מתוכננים להיות מוערכים תפקודית ב 37 ° C כדי להעריך תנאים פיזיולוגיים מקורבים 13,14,37. עם זאת, למיטב ידיעתנו, ההשפעות תלויות הטמפרטורה על הכוח שנוצר על ידי רקמות לב מהונדסות, לא נחקרו באופן שיטתי. פרוטוקול זה מתאר תכנון אלקטרודות קצב הממזער את איבוד החום במהלך הבדיקה, וכן מאפשר שילוב של גוף חימום מבודד במערך למדידות פונקציונליות, אשר יכול לשמור על hECTs בטמפרטורה פיזיולוגית מבלי להתפשר על סטריליות27. לאחר מכן אנו מדווחים על חלק מההשפעות הנצפות של הטמפרטורה על תפקוד hECT, כולל על הכוח המפותח, תדירות המכות הספונטניות, +dF/dt ו- −dF/dt. בסך הכל, מאמר זה מספק את הפרטים הדרושים לייצור מערכת ביוריאקטור רב-רקמתית זו לחישת כוח כדי לייצר רקמות לב מהונדסות-אנושיות ולהעריך את תפקוד ההתכווצות שלהן, ומוצגת קבוצה של נתונים המספקת בסיס להשוואה למדידות בטמפרטורת החדר וב-37°C27.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

פרוטוקול זה השתמש בקו iPSC ללא זיהוי, SkiPS 31.3 (במקור תוכנת מחדש באמצעות פיברובלסטים עוריים מגבר בריא בן 45)47, ולכן היה פטור מאישור ספציפי של ועדת הביקורת המוסדית, בהתאם להנחיות ועדת האתיקה של המחקר האנושי של המוסד. בצע את כל המניפולציות של התא וה-hECT בתנאים אספטיים בארון בטיחות ביולוגי Class II מסונן HEPA או בספסל עבודה של זרימה למינרית. לעקר את כל התמיסות הלא סטריליות על ידי סינון דרך מסנן 0.22 מיקרומטר, ולשמור על כל התאים וה- hECTs באינקובטור ב 37 ° C, 95% לחות יחסית, ו 5% CO2.

1. ייצור ביוריאקטורים

  1. רכיבי ביוריאקטור וייצור יציקת מאסטר אלומיניום
    הערה: קובצי תכנון בעזרת מחשב (CAD) מסופקים בקובץ משלים 1. ייתכן שהפרוטוקול יושהה בכל מקום בין שלבים אלה. מומלץ לגייס מכונאי מקצועי לייצור תבניות המאסטר המתוארות בסעיף זה, שכן נדרשים טולרנסים גבוהים (≤5 מיקרומטר) וגימור חלק לגיאומטריה מדויקת של הפוסט-גיאומטריה ולהתאמת לחיצה נכונה של מסגרות הפוליסולפון ללוחות הבסיס של פוליטטרה-פלואוראתילן (PTFE) (במטרה להתאים חיכוך צמוד, אך לא הדוק מדי).
    1. באמצעות טחנת בקרה נומרית ממוחשבת (CNC), מכונת את לוח הבסיס מתוך PTFE בהתאם לסכמות באיור 1A. ה-hECTs ייווצרו בשש הבארות במרווחים שווים (חיצים לבנים).
    2. באמצעות טחנת CNC, מכונת המאסטר השלילי של ארון התקשורת פולידימתילסילוקסאן (PDMS) יצוקה מאלומיניום בהתאם לסכמות באיור 1B, עם שלוש תומכי מסגרת (כוכביות ירוקות). קדח שישה חורים במרווחים שווים (ראשי חץ מגנטה) בקוטר 0.5 מ"מ ליצירת עמודי PDMS.
    3. באמצעות טחנת CNC, מכונו את מסגרת הביוריאקטור מתוך פוליסולפון בהתאם לסכמות באיור 1C. תומכי המסגרת (כוכביות ירוקות) תואמים לתמיכות המסגרת שנראות ביציקת ארון התקשורת (איור 1B, כוכביות ירוקות).
    4. באמצעות טחנת CNC, מכונה את מחזיק יציקת האלומיניום מאלומיניום בהתאם לסכמות באיור 1D. כל חריץ מכיל מדף משולש (משולש כתום) שגובהו 0.25 מ"מ כדי לספק שטח מת ל-PDMS לזרום דרך החורים ביציקות ארון התקשורת PDMS (איור 1B, ראשי חץ מגנטה).
  2. יציקת מתלה PDMS מאסטרים שליליים אלומיניום
    1. באמצעות מדפסת תלת-ממד למידול התכה תרמופלסטית, הדפס שני סוגריים של מנגנון יציקת ארון תקשורת PDMS (קובץ משלים 1). השתמש בהגדרות ההדפסה הבאות: גובה שכבה של 0.1 מ"מ, עובי קיר/תחתון/עליון של 1 מ"מ, צפיפות מילוי של 90% במשולשים, טמפרטורת הדפסה של 230°C, טמפרטורת לוח בנייה של 70°C ושוליים להידבקות.
    2. מקמו ארבע יציקות מאסטר שליליות מאלומיניום במחזיק הגבס (איור 2AI) כך שחורי העמודים יתיישרו עם החלל המת שממול למדפי המשולש (ראו איור 1D). עטפו את המכשיר בחתיכה מלבנית של יריעות סיליקון בעובי 0.5 מ"מ (איור 2B, חיצים לבנים) כאטם כדי למנוע דליפה של PDMS נוזלי והדקו אותו בין שני סוגרים מקבילים מודפסים בתלת-ממד באמצעות מהדק בורג.
    3. יש להוסיף 0.5 מ"ל של חומר מרפא PDMS ל-5 מ"ל בסיס אלסטומר PDMS (יחס של 1:10, לפי הוראות היצרן) במיכל רדוד, ולערבב נמרצות במשך 5 דקות. נטרלו את תערובת PDMS בתא ואקום, והפעילו ואקום חזק (0.1-1 kPa) למשך 20-60 דקות בטמפרטורת החדר או עד להיעלמות הבועות.
    4. שפכו את תערובת ה-PDMS על מנגנון היציקה, ומלאו יתר על המידה כדי להבטיח כיסוי מלא של כל חריץ (איור 2AII). אם תרצו, הוסיפו חרוזי זכוכית קטנים וצבעוניים לגוף ארונות התקשורת PDMS (איור 2AII), מול הצד עם העמודים (איור 2B), לזיהוי ייחודי של כל ארון תקשורת PDMS. החזירו את מנגנון היציקה לתא הוואקום (וודאו שהוא ישר אופקית), והפעילו ואקום חזק למשך 12 שעות לפחות. אפשרו ל-PDMS להחלים בטמפרטורת החדר למשך כ-48 שעות הרחק מאבק כדי לאפשר ריפוי מלא וחוזק מרבי של העמודים העדינים. הימנע משימוש בתנור מכיוון שהוא מעקם את הרכיבים המודפסים בתלת-ממד.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
  3. הסרת ארון תקשורת PDMS מיציקות המאסטר השליליות מאלומיניום
    1. הסר את המהדק, הסוגרים ויריעות הסיליקון ממנגנון היציקה. באמצעות סכין גילוח מפלדת אל-חלד, חתוך את סרט ה-PDMS מעל מנגנון היציקה ותומכי המסגרת, והשתמש בעדינות באצבעות כדי להפריד את מתלי PDMS מצידי מחזיק הגבס. הכניסו סכין גילוח מפלדת אל-חלד קהה לחלל המת שבין הגבס למחזיק הגבס, וחטטו אותם זה מזה (איור 2CI, II), כדי להבטיח שה-PDMS הממלא את החלל המת יישאר עם מחזיק הגבס (מכיוון שהוא מחובר לעמודים). בעזרת להב נירוסטה חד, חתכו את יריעות ה-PDMS הנותרות וחתכו את ה-PDMS של החלל המת מקצות העמודים (איור 2C III-V).
    2. שלב קריטי: שחררו את מדף PDMS מהגבס (איור 2D). החל מהצד שממול לעמודים, השתמש באצבעות כדי להפריד באיטיות את מתלה PDMS מהגבס, ועבוד על צדדים חלופיים עד שהעמודים יהיו נקיים מיציקות המאסטר.
    3. חזור על השלב הקודם עד שכל ארונות התקשורת PDMS וכל הפוסטים יתפנו. השתמש בסכין גילוח חד כדי לסלק את עודפי PDMS שנותרו מהמדפים. התוצאה היא ארון תקשורת PDMS (איור 2E) עם שישה עמודים שלמים (ראשי חץ כתומים) וחרוזים צבעוניים (חץ כחול) לזיהוי.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
  4. ייצור מעקב פוסט יציב (SPoT)
    1. באמצעות מדפסת תלת-ממד למידול התכה תרמופלסטית, הדפס את רכיבי מנגנון היציקה SPoT (קובץ משלים 2 ואיור 3AI, II). השתמש בהגדרות ההדפסה הבאות: גובה שכבה של 0.1 מ"מ, עובי קיר/תחתון/עליון של 1 מ"מ, צפיפות מילוי של 80% עם משולשים, טמפרטורת הדפסה של 230°C, טמפרטורת לוח בנייה של 70°C ושוליים להדבקה.
    2. ודא התאמה מאובטחת של מכונת הדפוס בין החלקים המודפסים בתלת-ממד, כמו גם בין ארונות ה-PDMS לבין הג'יג בעל שלושת הראשים, וודא שארונות ה-PDMS מתאימים היטב לעמודים המגיעים רק לתחתית הבארות מבלי להיות כפופים. חתוך/תייק את הפלסטיק במידת הצורך.
    3. יש להוסיף 0.5 מ"ל של PDMS שחור חלק A עד 0.5 מ"ל של חלק B (יחס של 1:1, לפי הוראות היצרן) לסירת שקילה קטנה (או מיכל קטן ורדוד דומה), ולערבב היטב עד לקבלת צבע אחיד. נטרלו את ה-PDMS השחור המעורב בתא ואקום תחת ואקום חזק למשך 20 דקות. שפכו את ה-PDMS השחור על הבסיס המודפס בתלת-ממד כדי למלא את החורים, והקישו כדי לוודא שלא יישארו בועות. לגרד כמה שיותר PDMS עודפים מהבסיס.
    4. הצמידו את החתיכה התלת-ראשית לבסיס, והניחו את מתלי ה-PDMS בחריצים שעל הג'יג התלת-ראשי (איור 3AII, מלבן טורקיז), כדי להבטיח שקצות העמודים ישקעו לתוך ה-PDMS השחור בבארות העגולות (איור 3B, C). רפא את PDMS השחור בטמפרטורת החדר ומוגן מפני אבק למשך 48 שעות.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
    5. החליקו החוצה את החתיכה התלת-ראשית, תוך מזעור המתח על העמודים. השתמש במלקחיים קטנים כדי לגרד את הסרט הדק של PDMS שחור המקיף כל SPoT; לאחר מכן, הכניסו מלקחיים מכופפים עדינים לבאר ה-SPoT כדי לשחרר אותה מהבסיס המודפס בתלת-ממד (איור 3D).
    6. בדקו את ה-SPoTs (איור 3E), וחתכו כל סרט PDMS שחור שנותר מתהליך הליהוק שלא הוסר בשלב 1.4.5 באמצעות מספריים עדינים של Vannas. ודא שהעמודים המוגמרים הם באורך הנכון על-ידי התאמת מתלי PDMS למסגרת הפוליסולפון ולאחר מכן החלקה שלהם על לוח הבסיס השחור (איור 4A).
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
    7. שייך את ארונות התקשורת מסוג PDMS והוסף אותם למסגרת באמצעות כרטיסיות המסגרות (איור 4A). Autoclave בשקית עם לוח בסיס PTFE למשך מחזור של 30 דקות לפחות (<122°C כדי להפחית את העיוות).

figure-protocol-7823
איור 1: רכיבי ביוריאקטור hECT. (A) מבט מלמעלה (משמאל) ומהצד (מימין) של לוח הבסיס של PTFE עם שש בארות במרווחים שווים ליצירת hECTs (חיצים לבנים). (B) מבט צדדי (משמאל) ומבט עליון (מימין) של יציקות המאסטר השליליות מאלומיניום עבור ארונות תקשורת PDMS עם שישה עמודים במרווחים שווים (ראשי חץ מגנטה) ושלושה רווחים לחיבור למסגרת הביוריאקטור (כוכביות ירוקות). (C) מבט צדדי (משמאל) ומבט תחתון (מימין) של מסגרות פוליסולפון עבור ארונות תקשורת PDMS עם שלוש תומכי מסגרת במרווחים שווים (כוכביות ירוקות) המתאימים לתמיכות המסגרת ביציקת ארון התקשורת PDMS (לוח B). (D) מבט מלמעלה (למעלה) ומהצד (למטה) של מחזיק יציקת האלומיניום עם ארבעה חריצים ליציקות ארון התקשורת PDMS, כל אחד עם מדף משולש בגובה 0.25 מ"מ (המדף השמאלי ביותר מסומן בכתום). נתון זה שונה מוואן נסטה27. קיצורים: hECT = רקמת לב מהונדסת אנושית; Ø = קוטר; PTFE = polytetrafluoroethylene; PDMS = polydimethylsiloxane; R = רדיוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-9145
איור 2: ייצור ארונות תקשורת PDMS. (A) הדמיות CAD מציגות תצוגה אלכסונית של מנגנון היציקה. (I) יציקת מאסטר שלילית של ארון תקשורת PDMS מוכנסת לכל אחד מארבעת החריצים של מחזיק הגבס, כאשר החורים שיוצרים את עמודי PDMS (ראשי חץ מגנטה) ממוקמים מעל החלל המת מול המדף המשולש (איור 1D, משולש כתום). (II) PDMS מוזג לכל חלל של יציקת המאסטר השלילית. (III) חרוזים צבעוניים מתווספים ל-PDMS שלא נרפא כמערכת זיהוי מקודדת בצבע. (B) תמונה המציגה את מנגנון יציקת ארון התקשורת PDMS שהורכב, המהודק משני צדדיו באמצעות שני סוגרים מודפסים בתלת-ממד המוחזקים במקומם על ידי מהדק בורג ועטופים ביריעות סיליקון בעובי 0.5 מ"מ (חיצים לבנים) כדי לאטום את הדפנות המהודקות. החרוזים הצבעוניים ממוקמים כך שלא יכסו את החורים בקוטר 0.5 מ"מ היוצרים את העמודים (ראשי חץ מגנטה). (C) לאחר ריפוי ה-PDMS, הגבס מוסר ממחזיק הגבס. (I) סכין גילוח מפלדת אל-חלד קהה או כלי מתכת דק דומה מוכנס בין הגבס למחזיק הגבס כדי לחלץ את הגבס ממחזיק הגבס (II). (III) הסרט (סוגריים בצבע טורקיז) שנוצר על ידי PDMS הזורם דרך חורי העמודים מחובר לקצות העמודים ויש לחתוך אותו באמצעות להב חד (IV,V). (D) ארון התקשורת PDMS מופרד מהגבס. (E) תמונות המציגות תצוגות אלכסוניות (למעלה), בצד (באמצע) ולמטה (למטה) של מדף PDMS עם חרוז זכוכית מוטבע בגוף לצורך זיהוי (חץ כחול). קצות העמודים (ראשי חץ כתומים) סומנו בדיו שחור. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. נתון זה שונה מוואן נסטה27. קיצורים: CAD = תכנון בעזרת מחשב; PDMS = polydimethylsiloxane. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-11118
איור 3: ייצור SPoT. (A) הדמיות CAD המציינות את מידות המפתח של הבסיס (I) ו-(II) חתיכה תלת-ראשית של ג'יג היציקה של SPoT. הממדים של צורות SPoT מעגליות (AI, חצים שחורים) נקבעים כעומק 0.2 מ"מ x 1.2 מ"מ קוטר, וכל אחד מהם מכיל PDMS שחור עבור SPoT בודד. המדף בגודל 11.1 מ"מ x 27 מ"מ הנראה בתצוגה העליונה (AII, למעלה, מלבן טורקיז) מדוכא ב-0.4 מ"מ (כפי שניתן לראות במבט הצדדי למטה) כדי להחזיק את מדף PDMS במקומו במהלך הריפוי. (B) עיבוד CAD המציג את הרכבת מנגנון היציקה SPoT. (ג) תצלום של מנגנון יציקת ה-SPoT שהורכב. (D) לאחר שה-PDMS נרפא, הג'יג התלת-ראשי מחליק החוצה מתחת למתלים של PDMS, וה-SPOTs משוחררים מהבארות שלהם באמצעות מלקחיים עדינים. (E) תמונות של ארון תקשורת PDMS ללא SPoTs (למעלה) ועם SPoTs (תחתון). כניסות מציגות תצוגות מוגדלות של הפוסטים. פסי קנה מידה = 1 ס"מ (E), 2.5 ס"מ (תמונות מוגדלות ב- E). נתון זה שונה מוואן נסטה27. קיצורים: CAD = תכנון בעזרת מחשב; Ø = קוטר; PDMS = polydimethylsiloxane; R = רדיוס; SPoT = מעקב פוסט יציב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

2. תרבית תאים

  1. טיפוח תאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSC)
    הערה: קווי תאים שונים עשויים לדרוש התאמות לדילול המעבר ולתדירות ו/או לטיטרציה של התוספים הבינוניים.
    1. מצפים צלחת בת 6 בארות שטופלה בתרבית תאים במטריצת קרום מרתף מוסמכת (מדוללת ב-1:1 Dulbecco's Modified Eagle Medium:Ham's F12 Nutrient Solution [DMEM/F12] בהתאם להוראות היצרן), ודגרו על הצלחת ב-37°C למשך 30 דקות לפחות. הכינו 500 מ"ל של תרבית iPSC בהתאם להוראות היצרן, והוסיפו 5 מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 IU/mL עד 10,000 מיקרוגרם/מ"ל).
    2. כדי לעבור את iPSCs, לשאוף את התווך מן הבארות ולשטוף כל באר פעם אחת עם 1 מ"ל של מלוחים חוצץ פוספט (PBS). הוסף 1 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה iPSC לכל באר, ודגר במכסה מנוע זרימה למינרית למשך דקה אחת.
    3. שאפו את תמיסת הדיסוציאציה iPSC, ודגרו על התאים בטמפרטורה של 37°C (ללא תווך) למשך 5 דקות. הוסף 1 מ"ל של 2 מיקרומטר thiazovivin בתווך iPSC כדי לנטרל את פתרון הדיסוציאציה iPSC.
    4. השתמש פיפטה סרולוגית 2 מ"ל כדי לנתק את המושבות לגושים של בערך 10 תאים, ולשטוף כל באר עם 1 מ"ל נוסף של 2 מיקרומטר thiazovivin בתווך iPSC. הוסף 2 מ"ל של תרחיף תאים לכל באר של הצלחת המצופה לאחרונה במטריצת קרום מרתף (שלב 2.1.1).
    5. לאחר 24 שעות, להסיר את המדיום, ולהוסיף מדיום iPSC טרי (ללא thiazovivin). הזן את iPSCs כל 48 שעות עם 2 מ"ל של iPSC בינוני או כל 72 שעות עם 4 מ"ל של בינוני. להחזיר את התאים בדילול של 1:6 למעבר כל 3 ימים או כאשר הם מגיעים למפגש של 80%.
      הערה: קווי תאים שונים עשויים לדרוש התאמה של תדירות הדילול והמעבר .
  2. התמיינות קרדיומיוציטים
    1. התחל את ההבחנה כאשר החד-שכבות של iPSC נפגשות ב-80%-90%.
    2. הכן את מדיום ההבחנה על ידי הוספת 10 מ"ל של תוסף B27 ללא אינסולין ו 5 מ"ל של תמיסת מלאי פניצילין-סטרפטומיצין ל 500 מ"ל של Roswell Park Memorial Institute 1640 בינוני (RPMI). הכן את אמצעי תחזוקת קרדיומיוציטים על ידי הוספת 10 מ"ל של תוספת B27 ו 5 מ"ל של תמיסת מלאי פניצילין-סטרפטומיצין ל 500 מ"ל של RPMI 1640.
      הערה: ניתן לאחסן את מדיום ההתמיינות ואת מדיום תחזוקת קרדיומיוציטים ב -4 ° C למשך עד שבועיים.
    3. יום 0: שטפו את התאים עם 1 מ"ל DMEM/F12, והוסיפו 2 מ"ל של 10 מיקרומטר CHIR99021 ומטריצת קרום מרתף מדוללת בתווך התמיינות (differentiation).
    4. יום 1: לאחר 24 שעות, או כאשר מפגש התאים הצטמצם מתחת ל -70%, לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של DMEM/F12, להוסיף 2 מ"ל של מדיום התמיינות ולדגור במשך 48 שעות.
    5. ימים 3-4: שטפו את התאים עם 1 מ"ל DMEM/F12, והוסיפו 2 מ"ל של 5 מיקרומטר IWR-1 במדיום התמיינות. חזור על הפעולה ביום הרביעי.
    6. ימים 5-6: לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של DMEM/F12, ולהוסיף 2 מ"ל של מדיום התמיינות. חזור על הפעולה ביום השישי.
    7. ימים 7-10: לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של DMEM/F12, ולהוסיף 2 מ"ל של אמצעי תחזוקת קרדיומיוציטים. חזור על הפעולה כל 24 שעות.
    8. ימים 11+: להחליף את המדיום עם 4 מ"ל של אמצעי תחזוקת קרדיומיוציטים טריים כל 48-72 שעות. שאפו ופיפטה לאט כדי למנוע פגיעה בחד-שכבות הפועמות במרץ.

3. תרבות hECT

  1. קצירת cardiomyocytes
    1. קצור את monolayers cardiomyocyte לשימוש בייצור hECT 8-60 ימים לאחר אינדוקציה התמיינות. צפו ל-2-5 מיליון תאים בכל באר.
      הערה: אם התאים לא התחילו לפעום עד היום ה-10, סביר להניח שההתמיינות לא תצליח. מכות נמרצות של חד-שכבות מתנתקות לעתים קרובות לאחר 11-15 ימים לתוך ההתמיינות ונדחסות לרקמות צפופות. מומלץ להשתמש או replate תאים כאלה בשלב זה.
    2. לשטוף כל באר של cardiomyocytes 2x עם 2 מ"ל של PBS. הוסף 1 מ"ל בטמפרטורת החדר: 0.25% טריפסין-EDTA. דוגרים בטמפרטורה של 37°C למשך 5-10 דקות עד שהתאים נראים מעוגלים ויתנתקו בהקשה קלה על הצלחת.
    3. הוסף 1 מ"ל של 10% FBS במדיום תחזוקת קרדיומיוציטים לכל באר כדי לנטרל את הדיסוציאציה. מחזירים בעדינות את החד-שכבות באמצעות קצה פיפטה סרולוגי של 5 מ"ל, ומעבירים לצינור חרוטי של 50 מ"ל כדי לפרק את הגלולה לגושים של 10-20 תאים.
    4. מערבבים את תרחיף התא על ידי היפוך הצינור החרוטי לפני העברת 10 μL של תאים ל 10 μL של כחול טריפאן. ספור את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי או המוציטומטר זכוכית. הפרד את תרחיף התא כראוי אם לא כל התאים ישמשו או אם חלק מהתאים מוקצים לציטומטריית זרימה.
      הערה: ניתן להוסיף תאים משלימים (כגון פיברובלסטים) בשלב זה.
    5. צנטריפוגה את התאים ב 250 × גרם במשך 5 דקות. שאפו מיד כמה שיותר סופרנאטנט מבלי להפריע לכדורית התא, ושמרו על קרח. עבוד במהירות כדי למזער את הזמן שהתאים מבלים בכדור.
  2. ייצור hECT
    1. השתמש באמצעי האחסון בטבלה 2, והתאם בהתאם למספר התאים בכדורית כך שכל hECT יכיל מיליון תאים. לאחר כל שלב, מערבבים על ידי פיפטינג איטי כדי למנוע בועות.
      הערה: בצע את שלבים 3.2.2-3.2.3 כשהם מוגנים מפני אור ישיר מכיוון שרכיבים מסוימים רגישים לאור.
    2. הכינו תמיסת קולגן מסוג 1 במינון 2.9 גרם/מ"ל במיקרו-צינורית של 1.7 מ"ל על ידי הוספת 13.442 מיקרוליטר מים מזוקקים, 4.4 מיקרוליטר של 10x PBS ו-0.638 מיקרוליטר של 1M NaOH. הוסיפו 25.52 מיקרוליטר של תמיסת קולגן במינון 5 מ"ג/מ"ל וערבבו לאט.
    3. הכן תערובת מטריצה חוץ-תאית (תערובת ECM מטבלה 2): הוסף 5.5 μL של תמיסת 0.2 N pH 9 HEPES ואחריה 5.5 μL של 10x MEM. מערבבים היטב עד לקבלת צבע אחיד של צהוב בהיר עד ורוד בהיר. העבר 35.2 μL של תמיסת תערובת ECM לכדורית התא, והוסף 4.4 μL של מטריצת קרום מרתף.
    4. פתחו את השקית האוטומטית של חלקי ביוריאקטור (שלב 1.4.7, איור 4A). כשאתם לובשים כפפות מעוקרות עם 70% אתנול, הסירו את לוחית הבסיס השחורה מהשקית האוטוקלאבית, והניחו בכלי בקוטר 60 מ"מ כשהבארות פונות כלפי מעלה. פיפטה 44 μL של תערובת התא לתוך כל באר לאט כדי למנוע החדרת בועות. במידת הצורך, השתמש פיפטה כדי להסיר את כל הבועות שהוכנסו על ידי pipetting או נוצרו עקב הידרופוביות של PTFE. שחזרו את נפח ה-hECT כך שפני השטח של הנוזל יהיו צמודים לשפת הבאר (איור 4BI).
    5. לבשו זוג כפפות מעוקרות טריות, והסירו את מסגרת הפוליסולפון עם מתלי PDMS משקית האוטוקלב. הנמיכו את המסגרת ללוח הבסיס כך שקצות המסגרת יתאימו לחריצים בקצות לוח הבסיס (איור 4BII, III). בדקו את הביוריאקטור כדי לוודא שהעמודים ישרים לחלוטין והמסגרת אינה מוטה לפני הכנסתם לצלחת בקוטר 60 מ"מ.
    6. הוסף 1 מ"ל של 10% FBS בתווך תחזוקת קרדיומיוציטים לצלחת 60 מ"מ (היזהר לא להפריע hECTs) כדי להגדיל את הלחות בצלחת כמו hECTs להתמצק. מניחים את צלחת 60 מ"מ ללא מכסה לתוך צלחת פרופיל גבוה (20 מ"מ גובה) 100 מ"מ, מכסים במכסה צלחת 100 מ"מ, ומחזירים את הביוריאקטור לאינקובטור 37°C, 5% CO2 כדי לאפשר לקולגן ליצור ג'ל עם התאים בתרחיף.
    7. לאחר שעתיים, מוציאים את המנה מהאינקובטור. הוסף 13 מ"ל של 10% FBS במדיום תחזוקת קרדיומיוציטים, והטה את הצלחת כדי לעודד את התווך לזרום בין לוח הבסיס PTFE לבין ארונות התקשורת PDMS.
    8. בדוק את הביוריאקטור מהצד כדי לוודא שלא נלכדו בועות אוויר בין המשטחים ההידרופוביים של לוח הבסיס PTFE לבין ארונות התקשורת PDMS, והחזיר את הצלחת לאינקובטור. אם יש אוויר כלוא, הטו את הביוריאקטור אל מחוץ לתווך כדי לאפשר לבועה להישבר, והורידו אותה שוב באיטיות, או השתמשו במיקרופיפטה עם קצה העמסת ג'ל כדי לשאוב את האוויר, תוך זהירות לא להפריע לעמודים.
  3. הסרת לוחית בסיס
    1. בדוק את דחיסת hECT דרך הרווח במסגרת. במהלך 24-96 שעות, ה-hECTs נדחסים ונעשים אטומים יותר (איור 4CI-III). ברגע שיש רווח נראה לעין בין hECTs לבין הקיר של לוחית הבסיס (איור 4CII), בצע שני שינויים בינוניים בחצי נפח כדי לשנות את המדיום למדיום תחזוקת קרדיומיוציטים ללא FBS. הסירו את לוח הבסיס כאשר ה-hECTs נדחסים בלפחות 30% בהשוואה לקוטר המקורי (איור 4CIII). ממלאים את צלחת 60 מ"מ המכילה את הביוריאקטור באמצעי תחזוקה קרדיומיוציטים עד שהנוזל נשטף עם שפת המנה, ומוסיפים 14 מ"ל לצלחת חדשה בקוטר 60 מ"מ.
    2. שלב קריטי: כשאתם לובשים כפפות סטריליות, הפכו את הביוריאקטור בצלוחית שלו כך שלוח הבסיס יהיה למעלה (איור 4BIV). בדוק אם יש בועות אוויר לכודות כמו בשלב 3.2.8. הרימו באיטיות את לוח הבסיס ושמרו עליו בגובה (איור 4BV).
    3. אם hECT נופל במהלך הסרת לוחית הבסיס אך נשאר בלוח הבסיס, השתמש במלקחיים עדינים מעוקלים סטריליים כדי להעביר את hECT מלוח הבסיס לצלחת 60 מ"מ. השתמש במלקחיים כדי להנחות את קצה hECT למוצבו. השתמש בזוג מלקחיים שני כדי להחזיק את העמוד יציב, והשחיל אותו דרך החור ב- hECT. חזור על הפעולה עבור ההודעה השנייה במידת הצורך.
    4. כאשר כל ה-hECTs מחוברים לעמודים, העבירו את המסגרת עם ה-hECTs לצלחת החדשה בקוטר 60 מ"מ, ומקמו את המסגרת כשהעמודים מצביעים כלפי מטה (איור 4BVI). בדוק את הביוריאקטור כדי לוודא שה- hECTs נשארים בעמדות שלהם רק קרוב ל- SPoTs.
    5. אם hECT נדחף על ידי מתח פני השטח לבסיס העמודים שלו, ייצב את המסגרת עם זוג מלקחיים מעוקלים סטריליים. הכנס את זוג המלקחיים השני דרך החריץ במסגרת, והשאר אותו סגור. לאחר שקצה המלקחיים הורד מעבר למתלים של PDMS, סובב אותו כך שיגיע לעמוד, והשתמש בקצוות הסגורים כדי לדחוף בעדינות את hECT לכיוון סוף העמוד עד שהוא מונח על ה- SPoT (איור 4BVI, כניסה).
  4. תחזוקת hECT
    1. בצע שינויים בינוניים בחצי נפח עם מדיום תחזוקת קרדיומיוציטים כל 24-48 שעות (לאחר שבועיים של תרבית, ניתן להפחית את התדירות לפעמיים בשבוע).
    2. כאשר ה-hECTs מציגים אשכולות של פעימות ספונטניות, בדרך כלל עד יום 3, ומכות מתואמות עם סטייה גלויה ביום 5, התחילו את המדידות הפונקציונליות, וחזרו על הפעולה בתדירות הרצויה.
      הערה: סביר להניח ש-hECTs שלא התחילו מכות מתואמות עד היום השביעי לא יעשו זאת כלל.
רכיבנפח (μL)
H2O מזוקק13.4422.9 מ"ג/מ"ל תמיסת קולגן"תערובת ECM"תערובת תאי hECT סופית
NaOH 1N0.638
PBS 10x4.4
5 מ"ג/מ"ל מלאי קולגן25.52
0.2 N pH 9 HEPES5.5
10x MEM5.5
נפח תערובת ECM להעברה לכדורית התא35.2
נפח המטריגל4.4

טבלה 2: ריאגנטים hECT. יש להוסיף את הרכיבים בסדר הרשום ולשמור על קרח.

figure-protocol-23063
איור 4: הרכבת ביוריאקטורים וייצור hECT. (A) (I) שני ארונות תקשורת PDMS (משמאל, תכלת) המותקנים על מסגרת פוליסולפון (מימין, שיזוף). (II) לוח הבסיס מסוג PTFE (שחור, משמאל) מתאים למסגרת (מימין) כך שכל זוג עמודים נכנס לבאר של לוח הבסיס. (B) (I) ארבעים וארבעה מיקרוליטרים של תרחיף קרדיומיוציטים במטריצה חוץ-תאית מבוססת קולגן מתווספים לכל אחת משש בארות פלטת הבסיס. (II,III) המסגרת עם ארונות תקשורת PDMS מותאמת ללחיצה על לוח הבסיס. לאחר 1-4 ימים, hECTs ניתן להסיר את צלחת הבסיס. (IV) ראשית, הביוריאקטור הפוך לפני (V) לוחית הבסיס מורמת מהמסגרת. (VI) מבט מהצד על הביוריאקטור עם שישה hECTs. כניסה: תצוגה מוגדלת המציגה את מיקום hECT בהודעות ביחס ל- SPoTs (כניסה). (C) עיבוד CAD המציג שלוש רמות של דחיסת hECT ([I] נמוך, [II] בינוני ו- [III] גבוה) כפי שניתן לראות דרך המרווח במסגרת פוליסולפון (polysulfone). נתון זה שונה מוואן נסטה27. קיצורים: CAD = תכנון בעזרת מחשב; PDMS = polydimethylsiloxane; PTFE = polytetrafluoroethylene; SPoT = מעקב פוסט יציב; hECT = רקמת לב מהונדסת אנושית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

4. ציוד קצב hECT

  1. ז'קט לבמה המחוממת
    1. השתמשו במכונת חיתוך בלייזר כדי לחתוך את רכיבי מעיל הבידוד האקרילי מתוך יריעת אקריליק שקופה בעובי 0.635 ס"מ (קובץ משלים 3), אחת כל אחת מאיור 5A-D, ושתיים כל אחת מאיור 5E, F.
    2. הרכיבו חלקים (B), (C), (D) ואחד מ-(E) מאיור 5, וחברו יחד באמצעות דבק אקרילי כפי שמוצג באיור 5GI. חברו את הפאנל העליון (איור 5GII), המתינו מספר שעות לשקיעת הדבק, ולאחר מכן החליקו את הבמה המחוממת לצד הז'קט (איור 5GIII).
    3. ברגע שהז'קט נמצא במקומו, השתמשו בנייר דבק כדי לאבטח את התוספות בין רגלי הבמה המחוממת, והוסיפו את הלוח הקדמי (איור 5GIV) כדי לסיים את ההרכבה (איור 5GV).
  2. ייצור אלקטרודות גרפיט
    1. חתכו מוטות גרפיט בעובי 6.25 מ"מ, ברוחב 25 מ"מ באמצעות מסור רצועה לבלוקים באורך 35 מ"מ; לאחר מכן, חתכו כל בלוק לאורכו בקו מעוקל, כך שכל אלקטרודה תהיה בגובה 13-16 מ"מ בקצה אחד ובגובה 8-10 מ"מ בקצה השני. קדח שני חורים בקוטר 0.7 מ"מ בפינה העליונה (איור 6AI). לטש את החתיכות עם מגבות נייר, ו sonicate במים במשך 20 דקות כדי להסיר אבק גרפיט. ודא שהאלקטרודות תוקעות טריז בין דפנות הצלחת לבין הביוריאקטור ברוחב 25 מ"מ כדי להבטיח מרחק עקבי בין האלקטרודות (איור 6AII).
    2. השחילו חוט פלדה באורך 150 מ"מ x בקוטר 0.25 מ"מ דרך חורי האלקטרודות, וכופפו אותו כך שיתאים מעל שפת צלחת 60 מ"מ וסביב דפנות צלחת 100 מ"מ כך שניתן יהיה לסגור את המכסה (איור 6AII).
    3. נקו את האלקטרודות על ידי השריה במים מזוקקים למשך 1-2 שעות לאחר כל שימוש כדי להסיר את כל התווך שנספג, הניחו לייבוש למשך הלילה, ולאחר מכן השרו בטמפרטורה של 132°C למשך 30 דקות. לפני תחילת המדידות, הניחו אלקטרודה אחת משני צדי הביוריאקטור (איור 6AII). מקמו את החוטים כך שניתן יהיה לסגור את מכסה הצלוחית בקוטר 100 מ"מ, והחזירו את הביוריאקטור לאינקובטור כדי להתאזן.

figure-protocol-26867
איור 5: מעיל אקרילי לבידוד שלב הזכוכית המחוממת. תמונות CAD המציגות את מידות המפתח של חלקי מעיל האקריליק המיועד לשולחן הזכוכית. (A) בלוח העליון יש מגרעת חור בגודל 27 ס"מ x 18.5 ס"מ כדי לאפשר לצלחת הביוריאקטור לשבת על גוף החימום. המלבנים הכתומים בפינות מציינים את המיקום המוצע של חתיכות ספייסר קטנות כדי לספק רווח בין החלק העליון של הז'קט לבין גוף החימום. (B) בחלק התחתון של הז'קט יש שני גזרות כדי לאפשר לרגלי הבמה המחוממת להחליק פנימה (כוכביות ירוקות). (ג&ד) שני פנלים צדדיים נכנסים מתחת לחלק העליון. (D) הלוח השמאלי כולל מגרעת (כניסה) בגודל 3 ס"מ x 0.3 ס"מ לכבל החשמל של הבמה. (E) לוחות ארוכים מתאימים מלפנים ומאחור. (F) תוספות מתווספות כדי למלא את הרווחים ברגע שהטבלה נמצאת בפנים. (G) (I) הלוח הצדדי והלוח האחורי מחוברים לחלק התחתון, ולאחר מכן (II) נוסף הלוח העליון. (III) שולחן הזכוכית מחליק לתוך הז'קט (חיצי מגנטה). (IV) התוספות מחוברות בין רגלי השולחן, והגב מתאים לפתח כדי לסגור את הקופסה. (V) הרכבת הז'קט שהושלמה. נתון זה שונה מוואן נסטה27. קיצורים: CAD = תכנון בעזרת מחשב; R = רדיוס; Ø = קוטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-28442
איור 6: איסוף נתונים של התכווצות hect. (A) (I) תמונות של אלקטרודות שנחתכו ממוטות גרפיט. חיצי המג'נטה מציינים חורים לחיבור חוטי הנירוסטה. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. (II) מבט אלכסוני (משמאל) ומבט עליון (מימין) המציג את מיקום אלקטרודות הגרפיט בביוריאקטור. האלקטרודות תופסות את המרווח בין הביוריאקטור ברוחב 25 מ"מ לבין דופן הצלחת כדי להבטיח מרחק עקבי בין האלקטרודות. החוטים מכופפים כדי לאפשר סגירה של מכסה המנה. (B) תמונה של מערך הקצב של hECT בתוך הספסל הנקי של הזרימה הלמינרית - כל הציוד מונח על שולחן בידוד הרטט כדי להפחית את רעש הרטט מהספסל הנקי. הביוריאקטור (ראש חץ מג'נטה) יושב על הבמה המחוממת, מואר על ידי מקור אור LED מלמעלה. המיקרוסקופ המנתח מכוון אופקית לעבר מראה ישרת זווית (כוכבית כתומה) כדי לצפות בביוריאקטור מלמטה ומצויד במצלמת CCD (משמאל). תושבת הטורקיז מציינת אמבט מים לניטור טמפרטורה רציף כדי לספק משוב לבקר הבמה המחומם בלולאה סגורה. נתון זה שונה מוואן נסטה27. קיצורים: hECT = רקמת לב מהונדסת אנושית; LED = דיודה פולטת אור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

5. מדידות פונקציונליות hECT

  1. הגדרת סביבת העבודה של הקצב
    1. הפעילו את הבמה המחוממת ל-39.5°C, והציבו את ציוד הקצב על שולחן בידוד רטט בתוך ספסל נקי של זרימה למינרית לפי איור 6B. הרכיבו את המיקרוסקופ המנתח על מעמד בום, וכוונו אותו אל מראה ישרת זווית (איור 6B, כוכבית כתומה) הממוקמת על שקע מעבדה מתחת לשולחן הזכוכית כדי לצפות בביוריאקטור מלמטה. הצמידו מצלמת CCD מהירה למיקרוסקופ, והתחברו למחשב. הקרינו את ההתקנה באור UV למשך 15 דקות כדי לעקר את סביבת העבודה.
    2. הניחו את הביוריאקטור (איור 6B, ראש חץ מג'נטה) על הבמה המחוממת המוארת על-ידי מקור אור LED בעל צוואר אווז כפול מלמעלה (ניתן לחבר את צוואר מנורות ה-LED בצורה בטוחה יותר ליחידה הראשית בהשוואה לנורות הסיבים האופטיים). צמצם רעשים נוספים על ידי וידוא שציוד הקצב על שולחן הרטט (והשולחן עצמו) אינו נוגע בחלק כלשהו של הספסל הנקי של הזרימה הלמינרית.
    3. הוסיפו צלחת שנייה בקוטר 60 מ"מ מלאה במים שחוממו מראש בתוך צלחת בקוטר 100 מ"מ על השולחן המחומם (איור 6B, תושבת בצבע טורקיז), והצטיידו בבדיקת טמפרטורה לניטור טמפרטורה רציף. התאם את הגדרת הטמפרטורה של השלב המחומם לפי הצורך כדי לשמור על הטמפרטורה של צלחת הייחוס ב 36-37 מעלות צלזיוס.
    4. הגדר את הגדלת המיקרוסקופ ל -1.5x (או הגדלה רצויה אחרת שבה ניתן לדמיין hECT בשלמותו ברזולוציה נאותה).
  2. כוונון הגדרות המצלמה
    1. פתח את תוכנת המצלמה. שנה את גודל הזנת הווידאו כדי לחתוך את שדה הראייה ככל האפשר תוך כדי הדמיה של hECT שלם. זה ממקסם את מהירות המצלמה.
    2. הגדר את קצב הלכידה ל- 90 מסגרות לשנייה. התאם את זמן החשיפה ואת מיקום מקור האור כדי למטב את אחידות תנאי התאורה בשדה הראייה ולמקסם את הניגודיות של SPoTs.
  3. הגדרת תוכנת רכישה
    1. הפעל את מגרה הדופק המרובע וחבר אותו למחשב. התאם את ההגדרות כדי לספק פולסים דו-פאזיים עם משרעת של 12 V ומשך זמן של 5 אלפיות השנייה.
    2. פתח את תוכנת רכישת הנתונים ולאחר מכן פתח את הקובץ "AutomatedPostTracking3.vi" (קובץ משלים 4). לאחר הטעינה, לחצו על החץ הלבן בצד שמאל של סרגל הכלים כדי לאתחל את התוכנית (איור 7A).
    3. כיול התוכנה באמצעות המוציטומטר זכוכית על הבמה המחוממת. בסרגל הכלים (איור 7B), לחץ על הכלי קו כדי לצייר קו לאורך 1 מ"מ של סימוני ההמוציטומטר (לא מוצג). בתיבה כיול מרחק (פיקסלים/מ"מ) (איור 7C), הגדר את אורך הייחוס (מ"מ) ל - 1 ולאחר מכן לחץ על הלחצן חישוב .
    4. מדוד את אזור חתך hECT באמצעות כלי הקו כדי לצייר קו לרוחב הרקמה. לחץ על 1 בתיבה שטח חתך (mm^2) (איור 7D) כדי לחשב את השטח (בהנחה שגיאומטריה גלילית של רצועות הרקמה הליניארית, כפי שנקבע בספרות 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,15,16,18,19,20,
      21,22,23,24,25,26,37,38). חזור על הפעולה לאורך חלקים שונים של hECT, ורשום את הערכים מתחת לשני הלחצנים האחרים בתיבה. קובץ טבלת נתוני הפלט מדווח על הממוצע של שלושת ערכים אלה כדי לחשב את קוטר הרקמה.
  4. אפיון פונקציונאלי hECT
    1. ודא שהטיפים לפוסטים ממוקדים. הפעל את מתג הסף (איור 7E), וכוונן את המחוון (איור 7F) עד שה- SPoTs (איור 7G) יסומן יפה ולא ישנה את צורתו כאשר ה- hECT מתכווץ.
    2. השתמשו בכלי המלבן כדי לצייר מלבן סביב אחד ה-SpoTs (איור 7, מלבן ירוק), ולחצו על הלחצן Set 1 בתוך התיבה Post boundaries (איור 7H) כדי לקבוע את מיקום המלבן סביב ה-SPoT, ולהבטיח שה-SPoT יישאר בתוך גבולות המלבן בכל עת. חזור על הפעולה עבור ההודעה השנייה, והקלט אותה תחת סט 2.
    3. התאם את הגדרות גודל האובייקט (איור 7I) כדי למנוע מהתוכנית לעקוב אחר אובייקטים קטנים יותר. ודא שמספר העצמים שמתבצע אחריהם מעקב בכל מלבן נשאר קבוע. הממשק (איור 7J) מראה את המרחק שנמדד בין האובייקטים שאחריהם עוקבים בזמן אמת. השתמש בגרף זה כדי לפקח על הרעש.
    4. בחר ספרייה לשמירת הקבצים (איור 7K). אחסן נתונים מימים שונים בתיקיות נפרדות. בחר את מספר הרקמה הנוכחי וכתוב את כל ההערות הרצויות בתיבה הערות .
    5. תחת הכותרת Pacing Frequency (Hz) (איור 7L), ציין את טווח התדרים הרצוי (Min ו - Max), ואת המרווח הרצוי למעבר מ- Min ל- Max. אם אתה פוסע את hECTs על פני כל טווח הלכידה שלהם, בדוק תדרי קצב שונים כדי למצוא את התדר הנמוך ביותר שבו מתקבל יחס גירוי:שיא של 1:1 , והמשך להגדיל את התדר עד שיחס זה אובד. מדוד את הפונקציה הספונטנית על ידי בחירת תחום תדרים שרירותי (למשל, 0.01 הרץ עד 0.01 הרץ) ושמירה על פלט ממריץ הפולס הריבועי כבוי.
    6. בתיבות מימין, בחר את זמן ההגדרה הרצוי (מרווח זמן לאחר הגדרת התדר אך הנתונים אינם נרשמים) כדי לאפשר ל- hECT להסתגל לתדר הקצב החדש. ציין את זמן ההקלטה ואת מתח הקצב (V). התחל את התוכנית על-ידי לחיצה על לחצן התחל תוכנית (איור 7M).
      הערה: התוצאות נשמרות אוטומטית בספריה שנבחרה. לאחר כל הקלטה, שימו לב שהתסריט מציג את טרנספורמציית פורייה של הנתונים (איור 7N), כאשר הפסגות תואמות לתדירות הפעימות שזוהתה.
    7. אם תרצה, הפעל את התוכנית "Excitation Threshold Finding" כדי למצוא את המתח המינימלי הדרוש כדי לעורר את ה-hECT (איור 7O). אם תרצה, חשב את הסטיות המקסימליות והמינימליות של הפוסטים (איור 7P).

figure-protocol-36768
איור 7: ממשק רכישת נתונים לאחר הטיה. (A) לחצן להפעלת התוכנה. (B) סרגל כלים הכולל את כלי הקו והמלבן למדידות האורך ולבחירת העצמים, בהתאמה. (C) בקרות כיול מרחק. (D) כלים למדידת שטח חתך hECT בשלוש נקודות שונות. (E) מתג סף ומחוון (F) להמרת הזנת הווידאו לתמונות בעלות ניגודיות גבוהה בזמן אמת. (G) SPoT גלוי בחלון התצוגה המקדימה. (H) כלים לבחירת SPoTs. (I) מחוון לסינון העצמים לפי גודל. (J) גרף המציג את המרחק הנמדד בין העצמים המסומנים בזמן אמת. (K) אפשרויות לבחירת הספרייה לשמירת קובצי הפלט. (L) אפשרויות להגדרת טווח התדרים, מרווח התדרים, זמן ההקלטה והגדרת הזמן בין הקלטות עבור תוכנית המעקב לאחר מכן (M). (N) פלט גרף של טרנספורמציית פורייה של עקומת הסטייה של ההקלטה האחרונה שנשמרה. (O) תוכנית למציאת המתח המינימלי הדרוש כדי לעורר את hECTs. (P) תוכנית לחישוב הסטיות המקסימליות והמינימליות של הפוסטים. קיצורים: hECT = רקמת לב מהונדסת אנושית; SPoT = מעקב פוסט יציב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

6. מדידות בארון תקשורת PDMS

  1. מרחקים שנפרקו
    1. לפני ייצור hECT, הרכיבו את זוג ארונות התקשורת PDMS הרצויים על מסגרת. השתמש בהגדרת הקצב ובתוכנה המתוארות בשלב 5.1 עבור המדידות הפונקציונליות. בחר את ה- SPoTs הנייח בקצות הפוסטים.
    2. כוונן את מקור האור ו/או סף האור במידת הצורך כדי להפחית את הרעש ל- <2 מיקרומטר. רשום את ערך y החי הממוצע המצוין בגרף בגיליון אלקטרוני.
  2. גובה פוסט וגבהי hECT
    1. מהגדרת הקצב המתוארת בשלב 5.2, הסר את המראה הזוויתית ואת הבמה המחוממת. הניחו את הביוריאקטור ישירות על שקע המעבדה למבט צדדי על הביוריאקטור.
    2. פתח את תוכנת המצלמה. התאם את זמן החשיפה ואת מיקום מקור האור כדי למטב את אחידות תנאי התאורה בשדה הראייה ולמקסם את נראות העמודים.
    3. פתח את תוכנת רכישת הנתונים ולאחר מכן פתח את הקובץ "PostMeasurement_PB3.vi" (קובץ משלים 5). לאחר הטעינה, לחץ על החץ הלבן בצד שמאל של סרגל הכלים כדי לאתחל את התוכנית.
    4. כיול התוכנה באמצעות hemocytometer זכוכית. לחץ על כלי הקו בסרגל הכלים האנכי משמאל לחלון הצפייה, וצייר קו על פני 1 מ"מ של סימוני ההמוציטומטר. בתיבה כיול מרחק (פיקסלים/מ"מ) בפינה השמאלית התחתונה של המסך, הגדר את אורך הייחוס (מ"מ) ל- 1 ולאחר מכן לחץ על הלחצן חישוב.
    5. מתחת לשדות הכיול, הגדר את מספר הרקמה הרצוי (לזיהוי) בשדה מספר רקמה . מקד את המצלמה בעמדה השמאלית של hECT ובחר שמאל בתיבה צד הפוסט .
    6. השתמש בכלי הקו כדי לצייר קו מבסיס הפוסט (למעלה) לקצה ה- SPoTs (למטה), והקלט על ידי לחיצה על Measure Post Ht.
    7. צייר קו מבסיס הפוסט לקצה הרחוק של hECT, והקלט על ידי לחיצה על Measure Tissue Top Ht. צייר קו מבסיס הפוסט לקצה הקרוב של hECT, והקלט על-ידי לחיצה על Measure Tissue Base Ht.
    8. בשלב זה, סובבו את הביוריאקטור כדי למדוד את גובה הפוסט הנכון. בחר באפשרות הפוסט המתאימה כדי להקליט את אותן מדידות. לחץ על כפתור הוסף כדי לאכלס את הגיליון האלקטרוני בערכים הנמדדים ולחשב באופן אוטומטי את הגובה הממוצע של hECT, אשר ישמש בשלב 7.
    9. לאחר שתסיים להקליט את גובה הרקמות, לחץ על להציל כפתור לשמירת הערכים בקובץ טקסט.

7. עיבוד נתונים פונקציונלי באמצעות סקריפטים מותאמים אישית לניתוח

  1. בעורך גיליונות אלקטרוניים, מלא את קובץ הסיכום באמצעות התבנית (קובץ משלים 6). השתמש בערכי אורך הפוסט וגובה הרקמה הממוצע שהושגו בשלבים 6.2. ודא שכל hECTs שיש להם נתונים בתיקיה מיוצגים בקובץ הסיכום. תן לקובץ את השם "סיכום #.csv", כאשר # מתייחס למספר הימים לתוך הניסוי.
    הערה: הנתונים הפונקציונליים של hECT חייבים להיות בתיקיות נפרדות בהתאם ליום הניסוי.
  2. ודא שהתיקייה המכילה את קבצי ה- script של AnalyzeLogsGUI (קובץ משלים 7) והתיקייה עם הקלטות hECT מתווספות שתיהן לנתיב.
  3. פתח את תוכנת ניתוח הנתונים. משמאל לסרגל הספריות, לחץ על חפש תיקיה כפתור כדי לנווט לתיקיית האב המכילה הן את התיקיה AnalyzeLogsGUI והן את הנתונים הפונקציונליים של hECT. בסרגל הצד ״ חלון נוכחי ״, לחץ/י באמצעות לחצן העכבר הימני על תיקיות אלה כדי ״הוסף לנתיב״ | הוסף תיקיות ותיקיות משנה שנבחרו.
  4. פתח את הקובץ "AnalyzeLogsGui_SC.m". בכרטיסיה עורך, לחץ על לחצן הפעל והמתן עד שממשק המשתמש הגרפי (GUI) יופיע בחלון חדש.
    1. בתיבה בחירת יומן רישום (איור 8AI), לחץ על לחצן בחר ספריה ונווט אל התיקיה הכוללת את הנתונים הפונקציונליים של hECT. בחר את hECT הרצוי לעיבוד מהתפריט הנפתח רקמות .
    2. בתיבה קלט נתונים (איור 8AII), הזן את המרחק הפרוק בין הפוסטים שתועד משלבים 6.1 בשדה מרחק דיאסטולי. הזן 0.25 בשדה Post Radius (mm).
    3. בתיבה Analysis Constraints (איור 8AIII), בחר את התדרים להשמטה מהניתוח, או בחר תדרים ספציפיים שיש לכלול (מופרדים באמצעות פסיקים). שעת ההתחלה ושעת הסיום מוגדרות ל- 0 ו- -1, בהתאמה, כברירת מחדל כדי לעבד את כל אורך ההקלטות. שנה ערכים אלה כדי לחתוך את ההקלטות במידת הצורך.
    4. שנה את פרמטרי המסנן (איור 8AIV) של סדר פולינומי וגודל מסגרת כדי לשנות את רמת ההחלקה במהלך תהליך הסינון, ואת מחוון סף זיהוי שיא כדי להגדיר את גודל השיא המינימלי שיזוהה על-ידי הסקריפטים.
      הערה: הסקריפט מכיל את האפשרות 'הסרת ספייק', שחותכת פסגות גבוהות שנגרמות על-ידי חפצים; עם זאת, זה לא מומלץ מכיוון שהוא משנה את צורת העוויתות. הסר חפצים באמצעות חיתוך ההקלטה במקום זאת (איור 8AIII).
    5. השתמש באפשרויות נוספות (איור 8AV) לפלט ניתוח נתונים נוסף: ניתוח לאחר סטייה כדי להפעיל אלגוריתם זיהוי שיא נוסף, ציר y בקנה מידה אוטומטי בתרשימי זום כדי להתאים אוטומטית את הצירים בעקומת כוח העווית (איור 8B), שמור עקומות מעקב כוח כדי לשמור כל דמות כוח עווית בקובץ .fig, ושמור נתוני זמן כוח כדי לשמור את קואורדינטות X ו- Y של הנתונים המסוננים שהותוו באיור עקומת כוח העווית.
    6. לחץ על הפעל ניתוח כדי ליצור קובץ .txt המכיל את התכונות של עקומת כוח העווית (קובץ משלים 8) בממוצע על פני הקלטה שלמה.

figure-protocol-43969
איור 8: חישובי עקומת כוח Twitch. (A) הפעלת הקובץ "AnalyzeLogsGUI.m" בתוכנת עיבוד הנתונים פותחת את חלון ממשק המשתמש הגרפי. (I) התיבה בחירת יומן רישום מאפשרת למשתמש לבחור את הספרייה עבור התיקיה המכילה את הנתונים הפונקציונליים של hECT. השדה Day Num מאוכלס באופן אוטומטי מהכותרת של קובץ הסיכום שנוצר בשלב 7.1 של הפרוטוקול. hECT שיעובד נבחר באמצעות התפריט הנפתח רקמות . (II) התיבה קלט נתונים מכילה מידע אודות זוג הודעות PDMS התומכות ב- hECT, כגון המרחק שנטען (שהתקבל בשלב 6.1 של הפרוטוקול) ורדיוס הפוסט (0.25 מ"מ). (III) התיבה אילוצי ניתוח מאפשרת למשתמש לבחור את התדרים להשמיט או לכלול ולחתוך את ההקלטות. (IV) תיבת פרמטרי המסנן כוללת את האפשרויות לבחירת אופן סינון עקומת כוח העווית הגולמית. סדר פולינומי וגודל מסגרת משנים את רמת ההחלקה בתהליך הסינון. המחוון Peak Detection Threshold קובע את גודל השיא המינימלי שיזוהה על-ידי קבצי ה- Script. האפשרות 'הסרת ספייק ' חותכת פסגות גבוהות הנגרמות על-ידי חפצים. (V) אפשרויות נוספות כוללות ניתוח הסטה לאחר מכן, המריץ אלגוריתם זיהוי שיא נוסף, ציר y בקנה מידה אוטומטי בתרשימי זום, הפועל על עקומת כוח העווית, שמירת עקומות מעקב כוח, השומר את נתוני כוח העווית, ושמירת נתוני זמן כוח, השומר את נתוני כוח העווית. (B) דוגמה לעקומת כוח העווית של הקלטה של 30 שניות של hECT בקצב של 1 הרץ שהופקה על ידי צילום המסך של ממשק המשתמש הגרפי מלוח A. עקומת כוח העווית האדומה מציגה את הכוח המסונן המיוצר על-ידי הפרמטרים ב - AIV, על גבי עקומת כוח העווית הגולמית (עקומה כחולה כהה, מופיעה כשבוחרים באפשרות הצג נתונים לא מסוננים ב - AV ). קיצורים: hECT = רקמת לב מהונדסת אנושית; GUI = ממשק משתמש גרפי; PDMS = polydimethylsiloxane. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

בעקבות הפרוטוקול לעיל, קרדיומיוציטים נוצרו מקו iPSC בריא ששימש בעבר את הקבוצה שלנו 9,15 ופורק ל- hECTs לאחר 8-61 ימים בתרבית. איור 9A מציג תמונות מייצגות של hECTs כפי שהם נראים מלמטה, שנוצרו ללא SPoTs (למעלה) ועם SPoTs (למטה). מדידות פונקציונליות נלקחו בטמפרטור...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ישנם מודלים רבים של רקמת לב מהונדסת ליניארית שפורסמו בספרות, חלקם מתוארים בטבלה 1. מודלים מסוימים כוללים מדידה ישירה של כוח הרקמה, אך אלה בדרך כלל דורשים העברת המבנה לאמבט שרירים נפרד38. רוב הדגמים מתוכננים כאשר הרקמות מעוגנות באופן קבוע בשני הקצוות, לרוב לעמדות PDMS

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

קיי.די.סי היא מייסדת שותפה ומדענית ראשית של נובוהארט ומחזיקה בבעלות על חברת האחזקות Medera Biopharmaceutical. נובוהארט לא תרמה למימון, לתכנון או לביצוע של מחקר זה; עם זאת, לתוצאות המחקר עשויה להיות השפעה פיננסית על נובוהארט ומדרה. המחברים האחרים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

המחברים מודים לד"ר טימותי קשמן על עבודתו הקודמת בשיטה זו. מחקר זה נתמך על ידי מימון מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH) (R01-HL132226 ו- K01 HL133424) ותוכנית רשתות מצוינות בינלאומיות של קרן לדוק (CURE-PLaN).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25 mm diamete 304 Stainless Steel WireMcMaster Carr6517K61 
0.25% trypsin-EDTAGibco25200056
1.7 mL MicrotubesAxygenMCT-175-C
10 cm dishes (20 mm tall)Corning353003
10 mL Serological PipetteDrummond6-000-010
10 N NaOHFisher ScientificSS225-1dilute 1:10 in sterile distilled water
10X Modified Eagle MediumSigma AldrichM0275
20 - 200 μL MicropipetteEppendorf3123000055
200 μL MicroPipette TipsVWR76322-150
5 mL Serological PipetteDrummond6-000-005
50 mL Conical Centrifuge TubesFalcon352070
6 cm Petri DishCorning353002
6 Watt LED Dual Gooseneck IlluminatorAmScope LED-6W 
6-Well PlatesCorning353046
90 degree angle mirrorEdmund Optics45-594
Acrylic bonding glueSCIGRIP#4
Adjustable 10 cm x 10 cm jackFisher Scientific14-673-50
Aluminum 6061McMaster Carr9008K82
A-Plan 10X Objective LensZEISS1020-863
Autoclave BagsPropper21002
B-27 supplementThermoFisher17504044
B-27 supplement (without insulin)ThermoFisherA1895601
Benchtop CentrifugeEppendorf5810 R
Black ABSUltimaker2.85 mm wide
Bovine Collagen IGibcoA1064401
CHIR99021Tocris4423
Class II Biosafety CabinetLabconco3430009
Clear Acrylic Sheetingestreetplastics10025024366.25 mm thick
CNC Vertical MillHaasVF-1
Conductive Graphite BarsMcMaster Carr1763T33
Dissection microscopeOlympusSZ61
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient MixThermoFisher11330032
EthanolFisher ScientificA4094Dilute to 70% in water
EVE Automated Cell counterNanoEntekE1000
EVE Cell Counting SlideNanoEntekEVS-050
Fetal Bovine SerumLife Technologies10438026
Fine Curved ForcepsFine Science Tools11253-25
Forma Series II Water Jacketed CO2 IncubatorThermo Electron Corporation3110AKA "incubator". With HEPA class 100 filter
Fusion360 softwareAutodeskAKA "CAD software"
Glass HemocytometerReichert14750.1 mm deep
HEPESSigma AldrichH3784
hESC qualified matrigelCorning354277AKA "basement membrane matrix". Store in frozen aliquots
High Speed CCD CameraPixelLINKP7410
Inverted MicroscopeCarl Zeiss WerkAxiovert 40 CFL10X phase contrast objective
IWR-1Selleck ChemS7086
LabView SoftwareNational Instruments2016
Laminar flow clean benchNuAireNU-201-330necessary for hECT functional analysis
LaptopAsusTekStrixIntel Core i& processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM
Laser Cutting MachineEpilogHelix 24
Magnification headsetExcelBlades70020Recommended for steps requiring fine manipulations
MatlabMathworksVersion 2019b or laterAKA "data analysis software"
Micro Vannas Scissors, 3 mm bladeWPI Instruments501839
Microscope Boom StandOlympusSZ2-STU1
Penicillin-Streptomycin stock solutionThermoFisher1514012210,000 IU/ml penicillin; 10,000 μg/ml streptomycin
Phosphate-buffered saline without divalent cationsSigma AldrichP3813Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations
Pipette ControllerDrummond4-000-100
PixelLINK Capture OEMPixelLINK10.2.1.6AKA "Camera Software"
PolysulfoneMcMaster Carr86735K73translucent amber color
Polytetrafluoroethylene (PTFE)McMaster Carr8545K176 Black, molded
ReLeSRStem Cell Technologies5872AKA "iPSC dissociation media"
Rosewell Park Memorial Institute 1640 MediaThermoFisher11875135
Silicone SheetingSMI manufacturingglossy, 0.02 in thickness, durometer 40
Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed BeadsMichael'scolor should withstand autoclaving
SpatulaFisher Scientific14-373used for mixing PDMS
Square Pulse Stimulator Astro-Med / Grass TechnologiesS88X
Stainless Steel RazobladesGEM62-0179-CTNpreferred over non-stainless steel due to lower hardness
StemflexThermoFisherA3349401AKA "iPSC culture media"
Sterile distilled waterThermoFisher5230
Sylgard 170 -  Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg KitDowDOWSIL 170 2LB KITAKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS)
Sylgard 184 - Silicone Elastomer Clear 1 lb KitDowDC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KITAKA Polydimethylsiloxane (PDMS)
Temperature-controlled heated stageOkolabH401-HG-SMUSet height to 10 cm
Thermoplastic 3D printerUltimakerUltimaker 3
ThiazovivinSelleck ChemS1459
Trypan BlueNanoEntekEBT-001
Vacuum ChamberBel-Art PartsF42027-0000
Variable Speed Mini Band SawMicro-Mark82203
Variable Speed Miniature Drill PressMicro-Mark82959
Vibration Isolation TableLabconco3618000
Weighing BoatsVWR10803-140
Talon Cylinder Bench ClampVWR97035-528AKA screw clamp

References

  1. Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Engineering. Part A. 18 (13-14), 1322-1333 (2012).
  2. Turnbull, I. C., et al. Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium. FASEB Journal. 28 (2), 644-654 (2014).
  3. Cashman, T. J., et al. Construction of defined human engineered cardiac tissues to study mechanisms of cardiac cell therapy. Journal of Visualized Experiments. (109), e53447(2016).
  4. Stillitano, F., et al. Genomic correction of familial cardiomyopathy in human engineered cardiac tissues. European Heart Journal. 37 (43), 3282-3284 (2016).
  5. Mayourian, J., et al. Experimental and computational insight into human mesenchymal stem cell paracrine signaling and heterocellular coupling effects on cardiac contractility and arrhythmogenicity. Circulation Research. 121 (4), 411-423 (2017).
  6. Mayourian, J., et al. therapeutic paracrine modulation of cardiac excitation-contraction coupling. Circulation Research. 122 (1), 167-183 (2018).
  7. Mayourian, J., et al. Exosomal microRNA-21-5p mediates mesenchymal stem cell paracrine effects on human cardiac tissue contractility. Circulation Research. 7 (122), 933-944 (2018).
  8. Turnbull, I. C., et al. Cardiac tissue engineering models of inherited and acquired cardiomyopathies. Methods in Molecular Biology. 1816, 145-159 (2018).
  9. Murphy, J. F., et al. Adult human cardiac stem cell supplementation effectively increases contractile function and maturation in human engineered cardiac tissues. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 373(2019).
  10. Breckwoldt, K., et al. Differentiation of cardiomyocytes and generation of human engineered heart tissue. Nature Protocols. 12 (6), 1177-1197 (2017).
  11. Huang, C. Y., et al. Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).
  12. Ramade, A., Legant, W. R., Picart, C., Chen, C. S., Boudou, T. Microfabrication of a platform to measure and manipulate the mechanics of engineered microtissues. Methods in Cell Biology. 121, 191-211 (2014).
  13. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Engineering of human cardiac muscle electromechanically matured to an adult-like phenotype. Nature Protocols. 14 (10), 2781-2817 (2019).
  14. Tamargo, M. A., et al. milliPillar: A platform for the generation and real-time assessment of human engineered cardiac tissues. ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (11), 5215-5229 (2021).
  15. Ceholski, D. K., et al. CXCR4 and CXCR7 play distinct roles in cardiac lineage specification and pharmacologic β-adrenergic response. Stem Cell Research. 23, 77-86 (2017).
  16. Bliley, J. M., et al. Dynamic loading of human engineered heart tissue enhances contractile function and drives a desmosome-linked disease phenotype. Science Translational Medicine. 13 (603), (2021).
  17. Ribeiro, M. C., et al. A new versatile platform for assessment of improved cardiac performance in human-engineered heart tissues. Journal of Personalized Medicine. 12 (2), 214(2022).
  18. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  19. Mannhardt, I., et al. Human engineered heart tissue: Analysis of contractile force. Stem Cell Reports. 7 (1), 29-42 (2016).
  20. Mannhardt, I., et al. Blinded contractility analysis in hiPSC-cardiomyocytes in engineered heart tissue format: Comparison with human atrial trabeculae. Toxicological Sciences. 158 (1), 164-175 (2017).
  21. Saleem, U., et al. Force and calcium transients analysis in human engineered heart tissues reveals positive force-frequency relation at physiological frequency. Stem Cell Reports. 14 (2), 312-324 (2020).
  22. Thavandiran, N., et al. Functional arrays of human pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Scientific Reports. 10 (1), 6919(2020).
  23. Bielawski, K. S., Leonard, A., Bhandari, S., Murry, C. E., Sniadecki, N. J. Real-time force and frequency analysis of engineered human heart tissue derived from induced pluripotent stem cells using magnetic sensing. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (10), 932-940 (2016).
  24. Leonard, A., et al. Afterload promotes maturation of human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes in engineered heart tissues. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 118, 147-158 (2018).
  25. Bose, P., Huang, C. Y., Eyckmans, J., Chen, C. S., Reich, D. H. Fabrication and mechanical properties measurements of 3D microtissues for the study of cell-matrix interactions. Methods in Molecular Biology. 1722, 303-328 (2018).
  26. Zhang, W., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes (hESC-CMs) in 3D collagen matrix: Effects of niche cell supplementation and mechanical stimulation. Acta Biomaterialia. 49, 204-217 (2017).
  27. van Neste, C. Advances in bioreactor design and multi-dimensional analysis for assessing maturation phenotype of human engineered cardiac tissues. PhD thesis. Icahn School of Medicine at Mount Sinai. , New York. https://www.prouest.com/docview/2722362863 (2022).
  28. Sala, L., et al. MUSCLEMOTION: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), e5-e16 (2018).
  29. Salazar, B. H., Cashion, A. T., Dennis, R. G., Birla, R. K. Development of a cyclic strain bioreactor for mechanical enhancement and assessment of bioengineered myocardial constructs. Cardiovascular Engineering and Technology. 6 (4), 533-545 (2015).
  30. Putame, G., et al. Application of 3D printing technology for design and manufacturing of customized components for a mechanical stretching bioreactor. Journal of Healthcare Engineering. 2019, 3957931(2019).
  31. Akintewe, O. O., Roberts, E. G., Rim, N. -G., Ferguson, M. A. H., Wong, J. Y. Design approaches to myocardial and vascular tissue engineering. Annual Review of Biomedical Engineering. 19, 389-414 (2017).
  32. Chen, G., et al. Phospholamban as a crucial determinant of the inotropic response of human pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes and engineered 3-dimensional tissue constructs. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 8 (1), 193-202 (2015).
  33. Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3D cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
  34. Beauchamp, P., et al. 3D co-culture of hiPSC-derived cardiomyocytes with cardiac fibroblasts improves tissue-like features of cardiac spheroids. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 14(2020).
  35. Campostrini, G., et al. functional analysis and applications of isogenic three-dimensional self-aggregating cardiac microtissues from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 16 (4), 2213-2256 (2021).
  36. Swiatlowska, P., Iskratsch, T. Tools for studying and modulating (cardiac muscle) cell mechanics and mechanosensing across the scales. Biophysical Reviews. 13 (5), 611-623 (2021).
  37. Zhao, Y., et al. Engineering microenvironment for human cardiac tissue assembly in heart-on-a-chip platform. Matrix Biology. 85-86, 189-204 (2020).
  38. Fujiwara, Y., Deguchi, K., Miki, K., Nishimoto, T., Yoshida, Y. A method for contraction force measurement of hiPSC-derived engineered cardiac tissues. Methods in Molecular Biology. 2320, 171-180 (2021).
  39. Wang, E. Y., et al. Biowire model of interstitial and focal cardiac fibrosis. ACS Central Science. 5 (7), 1146-1158 (2019).
  40. Zhao, Y., et al. A platform for generation of chamber-specific cardiac tissues and disease modeling. Cell. 176 (4), 913-927 (2019).
  41. Lee, E. K., et al. Machine learning of human pluripotent stem cell-derived engineered cardiac tissue contractility for automated drug classification. Stem Cell Reports. 9 (5), 1560-1572 (2017).
  42. Batalov, I., Feinberg, A. W. Differentiation of cardiomyocytes from human pluripotent stem cells using monolayer culture. Biomarker Insights. 10, 71-76 (2015).
  43. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  44. Penefsky, Z. J., Buckley, N. M., Litwak, R. S. Effect of temperature and calcium on force-frequency relationships in mammalian ventricular myocardium. Pflugers Archiv. 332 (4), 271-282 (1972).
  45. Bers, D. M. Excitation-Contraction Coupling and Cardiac Contractile Force. , Springer. Dordrecht, the Netherlands. (2001).
  46. Kanaya, N., Gable, B., Wickley, P. J., Murray, P. A., Damron, D. S. Experimental conditions are important determinants of cardiac inotropic effects of propofol. Anesthesiology. 103 (5), 1026-1034 (2005).
  47. Galende, E., et al. Amniotic fluid cells are more efficiently reprogrammed to pluripotency than adult cells. Cellular Reprogramming. 12 (2), 117-125 (2010).
  48. Wacker-Gussmann, A., Strasburger, J. F., Cuneo, B. F., Wakai, R. T. Diagnosis and treatment of fetal arrhythmia. American Journal of Perinatology. 31 (7), 617-628 (2014).
  49. Federmann, M., Hess, O. M. Differentiation between systolic and diastolic dysfunction. European Heart Journal. 15, 2-6 (1994).
  50. Knight, W. E., et al. Maturation of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes enables modeling of human hypertrophic cardiomyopathy. Stem Cell Reports. 16 (3), 519-533 (2021).
  51. Ma, Z., et al. Contractile deficits in engineered cardiac microtissues as a result of MYBPC3 deficiency and mechanical overload. Nature Biomedical Engineering. 2 (12), 955-967 (2018).
  52. de Lange, W. J., et al. Human iPSC-engineered cardiac tissue platform faithfully models important cardiac physiology. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 320 (4), H1670-H1686 (2021).
  53. Hiranandani, N., Varian, K. D., Monasky, M. M., Janssen, P. M. L. Frequency-dependent contractile response of isolated cardiac trabeculae under hypo-, normo-, and hyperthermic conditions. Journal of Applied Physiology. 100 (5), 1727-1732 (2006).
  54. Puglisi, J. L., Bassani, R. A., Bassani, J. W., Amin, J. N., Bers, D. M. Temperature and relative contributions of Ca transport systems in cardiac myocyte relaxation. The American Journal of Physiology. 270 (5), H1772-H1778 (1996).
  55. Puglisi, J. L., Yuan, W., Bassani, J. W., Bers, D. M. Ca(2+) influx through Ca(2+) channels in rabbit ventricular myocytes during action potential clamp: Influence of temperature. Circulation Research. 85 (6), e7-e16 (1999).
  56. Li, R. A., et al. Bioengineering an electro-mechanically functional miniature ventricular heart chamber from human pluripotent stem cells. Biomaterials. 163, 116-127 (2018).
  57. Sharma, A., et al. Biomanufacturing in low Earth orbit for regenerative medicine. Stem Cell Reports. 17 (1), 1-13 (2022).
  58. Strauss, D. G., Wu, W. W., Li, Z., Koerner, J., Garnett, C. Translational models and tools to reduce clinical trials and improve regulatory decision making for QTc and proarrhythmia risk (ICH E14/S7B updates). Clinical Pharmacology & Therapeutics. 109 (2), 319-333 (2021).
  59. Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Erratum


Formal Correction: Erratum: Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues
Posted by JoVE Editors on 1/10/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues. The title was corrected from:

Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues

to:

Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

hECTPDMSSPoT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved