מודל תלת-תאי ראשוני של מחסום הדם-מוח האנושי לחקר שבץ איסכמי במבחנה

Summary

במאמר זה נתאר את השיטה לביסוס מודל של תרבית תאים משולשת של מחסום הדם-מוח המבוסס על תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים במוח האנושי, אסטרוציטים ופריציטים. מודל רב-תאי זה מתאים למחקרים על תפקוד לקוי של יחידות נוירו-וסקולריות במהלך שבץ איסכמי במבחנה או לסינון מועמדים לתרופות.

Abstract

שבץ איסכמי הוא גורם מרכזי למוות ולנכות ברחבי העולם עם אפשרויות טיפוליות מוגבלות. הנוירופתולוגיה של שבץ איסכמי מאופיינת על ידי הפרעה באספקת הדם למוח המובילה למוות תאי ותפקוד קוגניטיבי. במהלך ואחרי שבץ איסכמי, תפקוד לקוי של מחסום דם-מוח (BBB) מקל על התקדמות הפציעה ותורם להחלמה לקויה של המטופל. המודלים הנוכחיים של BBB כוללים בעיקר מונוקולטורות אנדותל ותרביות כפולות עם אסטרוציטים או פריציטים.

מודלים כאלה חסרים את היכולת לחקות באופן מלא מיקרו-סביבה מוחית דינמית, החיונית לתקשורת בין תאים. בנוסף, מודלים נפוצים של BBB מכילים לעתים קרובות תאי אנדותל אנושיים מונצחים או תרביות תאים שמקורן בבעלי חיים (מכרסם, חזיר או בקר) המציבות מגבלות תרגום. מאמר זה מתאר מודל BBB חדשני המבוסס על הכנסה טובה המכיל רק תאים אנושיים ראשוניים (תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח, אסטרוציטים ופריסיטים של כלי דם במוח) המאפשרים לחקור פגיעה מוחית איסכמית במבחנה.

ההשפעות של מחסור בחמצן-גלוקוז (OGD) על שלמות המחסום הוערכו על ידי חדירות פסיבית, מדידות התנגדות חשמלית טרנסאנדותליאלית (TEER) והדמיה ישירה של תאים היפוקסיים. הפרוטוקול המוצג מציע יתרון מובהק בחיקוי הסביבה הבין-תאית של ה-BBB in vivo, ומשמש כמודל BBB מציאותי יותר במבחנה לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות במסגרת פגיעה מוחית איסכמית.

Introduction

שבץ מוחי הוא אחד הגורמים המובילים למוות ולנכות ארוכת טווח ברחבי העולם¹. שכיחות השבץ עולה במהירות עם הגיל, ומכפילה את עצמה כל 10 שנים לאחר גיל 55². שבץ איסכמי מתרחש כתוצאה מהפרעה בזרימת הדם במוח עקב אירועים טרומבוטיים ותסחיפיים, המקיפים יותר מ -80% מכלל מקרי השבץ³. גם כיום, קיימות אפשרויות טיפול מעטות יחסית למזעור מוות של רקמות בעקבות שבץ איסכמי. הטיפולים שכן קיימים הם תלויי זמן וכתוצאה מכך לא תמיד מובילים לתוצאות קליניות טובות. לכן, מחקר על מנגנונים תאיים מורכבים של שבץ איסכמי המשפיעים על התאוששות לאחר שבץ הוא נחוץ בדחיפות.

ה-BBB הוא ממשק דינמי להחלפת מולקולות בין הדם לפרנכימה של המוח. מבחינה מבנית, ה-BBB מורכב מתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח המחוברים ביניהם על ידי קומפלקסים צומתיים המוקפים בקרום מרתף, פריציטים ואנדפיטים אסטרוציטיים⁴. פריסיטים ואסטרוציטים ממלאים תפקיד חיוני בשמירה על שלמות BBB באמצעות הפרשת גורמים שונים הדרושים להיווצרות צמתים חזקים והדוקים ^5,6. התמוטטות ה- BBB היא אחד מסימני ההיכר של שבץ איסכמי. תגובה דלקתית חריפה ועקה חמצונית הקשורה לאיסכמיה מוחית גורמת לשיבוש של קומפלקסים של חלבונים בצמתים הדוקים ולהצלבה לא מווסתת בין אסטרוציטים, פריציטים ותאי אנדותל, מה שמוביל לחדירות מוגברת של מומסים פרא-תאיים ברחבי BBB⁷. תפקוד לקוי של BBB מקדם עוד יותר את היווצרות בצקת המוח ומגביר את הסיכון לטרנספורמציה דימומית⁸. בהתחשב בכל האמור לעיל, יש עניין רב בהבנת השינויים המולקולריים והתאיים המתרחשים ברמת BBB במהלך ואחרי שבץ איסכמי.

למרות שמודלים רבים של BBB במבחנה פותחו בעשורים האחרונים ומשמשים במגוון מחקרים, אף אחד מהם לא יכול לשכפל באופן מלא בתנאי in vivo ⁹. בעוד שחלק מהמודלים מבוססים על מונולרים של תאי אנדותל שגודלו בתרבית על תמיכות חדירות היטב לבדן או בשילוב עם פריסיטים או אסטרוציטים, רק מחקרים עדכניים יותר הציגו עיצובים של מודלים של תרביות תאים משולשות. כמעט כל המודלים הקיימים של BBB בתרבית משולשת משלבים תאי אנדותל ראשוניים במוח יחד עם אסטרוציטים ופריסיטים שבודדו ממיני בעלי חיים או תאים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים^10,11,12,13.

מתוך הכרה בצורך לשחזר טוב יותר את ה-BBB במבחנה האנושית, הקמנו תרבית תאים משולשת במבחנה מודל BBB המורכב מתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח האנושי (HBMEC), אסטרוציטים אנושיים ראשוניים (HA) ופריסיטים וסקולריים ראשוניים במוח האנושי (HBVP). דגם BBB תלת-תרבותי זה ממוקם על צלחת 6 בארות, תוספות קרום פוליאסטר בגודל נקבוביות של 0.4 מיקרומטר. תוספות טובות אלה מספקות סביבה אופטימלית לחיבור תאים ומאפשרות גישה נוחה הן לתאים אפיקליים (דם) והן לתאים בזולטרליים (מוח) לדגימה בינונית או ליישום מורכב. התכונות של מודל BBB מוצע זה של תרבית תאים משולשת מוערכות על ידי מדידת TEER ושטף על-תאי לאחר OGD המחקה שבץ איסכמי במבחנה, עם מחסור בחמצן (<1% O₂) וחומרים מזינים (על ידי שימוש במדיום נטול גלוקוז) המושג באמצעות תא לח ואטום. בנוסף, תנאים דמויי איסכמיה המושרים במודל זה מאומתים במדויק על ידי הדמיה ישירה של תאים היפוקסיים.

Protocol

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל התאים, החומרים, הציוד והפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הגדרת מודל BBB של תרבית תאים משולשת

1. זריעת פריציטים
   1. טפחו HBVP בבקבוקי תרבית T75 עם משטח פעיל להידבקות תאים בתוך אינקובטור 5% CO₂ בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד למפגש. לאחר ההגעה למפגש, שאפו את מדיום הפריסיטים הישן ושטפו את התאים עם 5 מ"ל של תמיסת מלח חמה של דולבקו (DPBS). שאפו את ה- DPBS ונתקו את התאים מהבקבוקון באמצעות שילוב של 4 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA חמה ו-1 מ"ל של DPBS.
      הערה: הימנע משימוש בקטעים מאוחרים יותר מ- P7.
   2. לדגום את הבקבוקון במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחממת CO₂ . מבט תחת מיקרוסקופ כדי לוודא אם התאים מנותקים מהבקבוקון. הוסיפו 5 מ"ל של סרום פריציטים חם (המכיל 2% סרום בקר עוברי [FBS]) והעבירו את התאים המנותקים לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
   3. צנטריפוגה של מתלה התא במשך 3 דקות ב 200 × גרם, המאפשר לתאים ליצור גלולה בתחתית הצינור. שאפו את המדיום מהצינור, כדי להבטיח שכדור התא יישאר שלם.
   4. להשעות את כדור התא במדיום פריציטים; חשב את כמות המדיום בהתאם למפגש התאים ולמספר התוספות הדרושות. קח 10 μL של התאים המחודשים, הנח אותם לתוך שקופית ספירת תאים, וספור את מספר התאים.
   5. לקבוע את צפיפות התאים ואת זרע 300,000 תאים / להכניס 1 מ"ל של מדיום pericyte על הצד abluminal של מוסיף היטב (פורמט 6-טוב).
      הערה: בעת זריעת HBVP על החלק התחתון של התוספות, חשוב מאוד להפוך תחילה את הצלחות המוכנסות היטב במהופך. בזמן שהצלחת מונחת שטוחה על משטח, הסר את החלק התחתון כדי לחשוף את הצד האבלומי של הבאר. לאחר הוספת תרחיף תאי פריציט על הצד האבומי, כסו את התוספות היטב עם הלוח ההפוך כדי למנוע אידוי. שמור את כל הצלחות הפוכות באינקובטור 5% CO₂ בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
2. זריעת אסטרוציטים
   1. טפחו HA בצלוחיות T75 בתוך חממה של 5% CO₂ בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד להגעה למפגש. בצע את השלבים לעיל 1.1.1-1.1.4 באמצעות מדיום אסטרוציטים (המכיל גם 2% FBS) במקום מדיום פריציטים.
      הערה: הימנע משימוש בקטעים מאוחרים יותר מ- P9.
   2. קבע את צפיפות התאים ואת זרע 300,000 תאים / באר על החלק התחתון של תרבית הרקמה 6-בארות לוחות. מכסים את הצלחת כדי למנוע אידוי ושומרים את כל הצלחות באינקובטור 5% CO₂ בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
3. זריעת תאי אנדותל
   1. טפחו HBMEC במנות תרבית רקמה בתוך אינקובטור 5% CO₂ בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד למפגש. בצע את השלבים לעיל 1.1.1-1.1.4 באמצעות מדיום קלאסי שלם (המכיל 10% FBS) במקום מדיום פריציטים.
      הערה: יש להימנע משימוש בקטעים מאוחרים יותר מ-P12.
   2. הוציאו את תרבית הרקמה צלחות 6-באר המכילות אסטרוציטים ואת הבאר-תוספות (בפורמט 6-well) המכילות פריסיטים מהאינקובטור 5% CO₂ ב-37 מעלות צלזיוס. שאפו את מדיום האסטרוציטים מתרביית הרקמה צלחות 6 בארות. הוסף 1 מ"ל של בינוני פריציטים ו 1 מ"ל של מדיום אסטרוציטים לכל באר.
   3. שאפו את מדיום הפריציטים מהבאר והכניסו אותם לתרבית הרקמה צלחות 6 בארות המכילות את האסטרוציטים שנזרעו. זרע HBMEC בצפיפות של 300,000 תאים/באר ב-2 מ"ל של מדיום קלאסי שלם על הצד האפי של אותה באר.
      הערה: יש לזרוע את תאי האנדותל בצד האפיקלי של הבאר ביום המחרת לאחר זריעת הפריציטים בצד האבמינלי של הבאר ואסטרוציטים על צלחות תרבית רקמה 6 בארות. התאים צריכים להישמר בתרבית משולשת במשך 6 ימים כדי לגרום לתכונות דמויות BBB. יש להחליף את מדיום תרבית התאים בשני התאים המוכנסים היטב 24 שעות לפני הניסויים.

2. אינדוקציה של מחסור חמצן-גלוקוז

1. לשטוף את התאים 3x עם DPBS. עבור תרביות תאים משולשות הנתונות ל-OGD, יש להוסיף מדיום נטול גלוקוז (ללא L-גלוטמין ופנול אדום) הן לתאים האפיקליים והן לתאים הבזולטרליים. החלף את מדיום התרבית במדיום טרי בתרביות תאי בקרה נורמוקסיות. בקרת תרביות משולשות בחממה 5% CO₂ ב 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: שינויים בינוניים לפני השראת OGD או מיד לאחר OGD עשויים ליצור לחץ מכני שישפיע עוד יותר על המונדלרים של תאי האנדותל. לפיכך, השלבים עם תחליף בינוני כלולים עבור תרביות תא בקרה נורמוקסיות.
2. הניחו צלחת פטרי המכילה 20 מ"ל מים סטריליים בתא האינקובטור של היפוקסיה כדי לספק לחות מספקת של התרביות. פתח את התא על ידי שחרור מהדק הטבעת. סדרו את תרביות התאים על המדפים. אטמו את החדר על ידי אבטחת מהדק הטבעת.
3. פתח את יציאות הכניסה והיציאה של החדר. חברו את הצינורות המגיעים מראש מד הזרימה לתא. חברו את הצינורות המגיעים מתחתית מד הזרימה למיכל הגז המכיל את תערובת הגז של 95% N 2/5% CO₂ באמצעות מסנן אוויר. 
4. פתח את שסתום בקרת זרימת המיכל על ידי סיבובו נגד כיוון השעון כדי לאפשר זרימת גז מינימלית. פתח באיטיות את שסתום ווסת הלחץ על ידי סיבוב בכיוון השעון.
5. יש לשטוף את התא עם תערובת הגזים בקצב זרימה של 20 ליטר/דקה למשך 5 דקות. נתקו את התא ממקור הגז וסגרו היטב את שני מלחציי הפלסטיק הלבנים.
6. כבה את שסתום בקרת זרימת המיכל על ידי סיבוב בכיוון השעון. סגור את שסתום וסת הלחץ על ידי סיבוב נגד כיוון השעון.
7. מניחים את תא היפוקסיה באינקובטור קונבנציונלי ב 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
   הערה: להוספת תקופת חמצון חוזרת לאחר מכן, שטפו את התאים פי 3 עם DPBS, הוסיפו מדיום טרי בכל התרביות המשולשות, ושמרו למשך 24 שעות נוספות באינקובטור 5% CO₂ בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. על פי הוראות היצרן, ריכוז החמצן שנותר בתא הוא 0% לאחר לא פחות מ-4 דקות של טיהור עם תערובת גזים אנאירובית ב-20 ליטר לדקה.

3. מדידות TEER

1. הכנס את מכשיר ה- TEER המעוקר לארון הביו-בטיחותי וחבר את האלקטרודות לוולטוהמטר האפיתליאלי. לעקר את האלקטרודות ב 30 מ"ל של 70% איזופרופיל אלכוהול פתרון למשך מינימום של 30 דקות.
2. הפעל את מכשיר ה- TEER והגדר את הפונקציה לאוהם.
3. הסר את האלקטרודות מתמיסת 70% איזופרופיל אלכוהול והנח אותן ב-20 מ"ל של DPBS למשך 30 דקות לפחות עד שהקריאה הדיגיטלית במכשיר TEER תקרא 0 אוהם.
4. הכנס את החלק הארוך של האלקטרודה דרך אחד משלושת הפתחים במתלה הבאר של פקד הבאר הריקה, והנמיך אותו עד שהוא נוגע בתחתית הבאר. ודא כי הפתח הקצר מונח מעל התרבות apical בתחתית הבאר.
   הערה: בקרת הבאר הריקה מורכבת מ-2 מ"ל של מדיום קלאסי שלם בתא האפיקלי ושילוב של 1 מ"ל של מדיום פריציטים ו-1 מ"ל של מדיום אסטרוציטים בתא הבזולטרלי. ודא שהאלקטרודות מוחזקות בזווית של 90° לבאר תוך כדי ביצוע מדידת ה- TEER. שימוש בממוצע של שתיים או שלוש קריאות המתקבלות באותה באר (לכל פתיחה) יכול לעזור להקטין את השונות.
5. המתן עד לביטול ערכי הקריאה הדיגיטלית במכשיר TEER לפני הקלטת הערך. החזירו את האלקטרודות ל-DPBS כדי לשטוף אותן בין המדידות. המשך לאסוף את כל מדידות ה- TEER עבור שני פקדים ריקים נוספים שהוכנסו היטב.
6. אסוף את מדידות ה- TEER של לוחות הדגימה באמצעות שלבים 3.4-3.5 שנלקחו עבור מדידות הבקרה. לאחר ביצוע כל המדידות, החזירו את האלקטרודה לתמיסת 70% איזופרופיל אלכוהול למשך 30 דקות. נתקו את האלקטרודות ממכשיר ה-TEER ואפשרו להן להתייבש באוויר.
7. חישוב ערכי TEER. השתמש במשוואה (1) כדי להחסיר את ערך ה-ohm הממוצע של פקד ההוספה הריקה מערך ה-ohm של הדגימה, ולאחר מכן הכפל ערך התנגדות זה באזור של תוספת הממברנה (ס"מ 2) כדי לתת את ערך ה- TEER המדווח ב- Ω∙cm².
   (1)

4. הערכת החדירות הפרה-תאית BBB

הערה: בצע את כל השלבים הכוללים FITC-dextran בארון בטיחות ביולוגית של תרבית תאים כאשר האורות כבויים. כסו את תמיסות FITC-dextran ברדיד אלומיניום כדי למזער את ההלבנת הפוטו.

1. הכינו תמיסות המכילות FITC-dextrans של 20 ו-70 kDa (0.1 מ"ג/מ"ל) באמצעות מדיום צמיחת תאי אנדותל ללא אדום פנול ואפשרו לערבב על שייקר פלטפורמת נדנדה למשך שעה אחת. סנן את הפתרונות באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.
2. שאפו את המדיום מהתא הבזולטרלי והחליפו אותו ב-2 מ"ל של מדיום צמיחת תאי אנדותל ללא אדום פנול במודל BBB של תרבית תאים משולשת. שטפו את התאים בתא האפיקלי פעמיים עם תמיסת המלח המאוזנת של הנקס (HBSS).
3. הוסף 1 מ"ל של תמיסת FITC-dextran בתא האפיקלי וכסה את הצלחת ברדיד אלומיניום. הכניסו את הצלחת לחממה של 5% CO₂ בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
4. קח 100 μL של בינוני מן התאים basolateral ולהעביר אותו לתוך צלחת שחורה 96 באר. מדוד את הפלואורסצנציה באמצעות קורא microplate כאשר אורכי הגל של העירור והפליטה מוגדרים ל-480 ננומטר ו-530 ננומטר, בהתאמה.

5. זיהוי היפוקסיה בתאים חיים

1. זרעים של 200 μL של HBMEC, HA ו-HBVP במרכז כלים מצופים פולי-די-ליזין, תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ בצפיפות של 150,000 תאים/צלחת. לפני זריעת HBMEC, מצפים את תחתית הכלים עם גורם ההצמדה. אפשרו לתאים להתחבר למשטח הזכוכית על ידי השארתם למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור CO₂ .
   הערה: חשוב למקם צלחות עם תאים ראשוניים אנושיים בו זמנית עם מודל BBB משולש שהוכנס היטב בתא היפוקסיה עבור OGD.
2. לאחר ההגעה למפגש, יש להשליך את מדיום התרבית ולהוסיף 2 מ"ל של מדיום נטול גלוקוז שחומם מראש (עבור OGD) או מדיום רגיל (עבור בקרות) המכיל 2 μL של 1 mM Hoechst 33342 (ריכוז סופי 0.2 μM) ו- 0.5 μL של 5 mM פתרון מלאי של מגיב היפוקסיה ירוקה Image-iT הפניה (ריכוז סופי 1 μM). לאחר טיפול OGD, יש להחליף את המדיום במדיום מותאם להדמיה בכל המנות.
3. בצע הדמיה פלואורסצנטית של תאים חיים באמצעות מסנן GFP וחממה מיקרוסקופית קונפוקלית בשלב העליון כפי שתואר קודם^{לכן 14,15.}

תוצאות

כדי לבחון את ההשפעות של אסטרוציטים ופריסיטים על תפקוד המחסום של HBMEC, בנינו את מודל ה-BBB של תרבית תאים משולשת על תוספות תרביות תאים (איור 1A) יחד עם מונוקולטורה של HBMEC ושני מודלים של תרביות משותפות כפולות כבקרות (איור 1B). בקרות כפולות של תרבית משותפת כללו תרבית מ?...

Discussion

בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטה להקמת מודל BBB אמין של תרבית תאי אנדותל-פריציטים-אסטרוציטים לחקר תפקוד לקוי של BBB בהגדרה של שבץ איסכמי במבחנה. בהתחשב בכך pericytes הם השכנים הקרובים ביותר של תאי אנדותל in vivo, HBVP מצופים על החלק התחתון של מוסיף היטב מודל^{זה 16}. למרות שתצורה זו חסרה ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert	Corning	3450
35 mm Glass Bottom Dishes	MatTek Life Sciences (FISHERSCI)	P35GC-1.5-14-C
Astrocyte Medium	Science Cell	1801
Attachment Factor	Cell Systems (Fisher Scientific)	4Z0-201
BD 60 mL Syringe	BD	309653
BrainPhys Imaging Optimized Medium	STEMCELL Technologies	5791
Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost	4Z0-500	Cell Systems
Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap	VWR	430829
Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask	Corning	431464U
Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates	Corning	3340
Countes Cell Counting Chamber Slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
Countess II FL Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	ZGEXSCCOUNTESS2FL
Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution	Fisher Scientific	04-355-71
Disposable Petri Dishes	VWR	25384-088
DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red)	ThermoFisher	A14430-01	Glucose-free medium
DPBS (No Calcium, No Magnesium)	ThermoFisher	14190250
EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL	Lonza	CC-3129
EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes	World Precison Instruments	NC9792051	Epithelial voltohmmeter
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000)	Millipore Sigma	FD20-250MG
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000)	Millipore Sigma	FD70S-250MG
Fluorview FV3000 Confocal Microscope	Olympus	FV3000
Gas Tank (95% N2, 5% CO2)	Airgas	X02NI95C2003071
HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red)	Thermofisher	14025092
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher	H3570
Human Astrocytes	Science Cell	1800
Human Brain Vascular Pericytes	Science Cell	1200
Hypoxia Incubator Chamber	STEMCELL Technologies	27310
Image-iT Green Hypoxia Reagent	ThermoFisher	I14834
Pericyte Medium	Science Cell	1201
Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells	ACBRI 376	Cell Systems
Rocking Platform Shaker, Double	VWR	10860-658
Single Flow Meter	STEMCELL Technologies	27311
SpectraMax iD3 Microplate Reader	Molecular Devices	75886-128
Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile	NEST Scientific	380121
TPP Mutli-well Plates (6 wells)	MidSci	TP92406
TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks	MidSci	TP90075	Flasks with activated surface for cell adhesion
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFisher	25200056
UltraPure Distilled Water	Invitrogen (Life Technologies)	10977-015
Uno Stage Top Incubator-	Oko Lab	UNO-T-H-CO2-TTL