시험관 내 허혈성 뇌졸중 연구를 위한 인간 혈액-뇌 장벽의 삼중 일차 세포 배양 모델

요약

여기에서는 일차 인간 뇌 미세 혈관 내피 세포, 성상 세포 및 혈관 주위 세포를 기반으로 혈액 뇌 장벽의 삼중 세포 배양 모델을 구축하는 방법을 설명합니다. 이 다세포 모델은 시험관 내 허혈성 뇌졸중 중 신경 혈관 단위 기능 장애의 연구 또는 약물 후보의 스크리닝에 적합합니다.

초록

허혈성 뇌졸중은 치료 옵션이 제한된 전 세계적으로 사망 및 장애의 주요 원인입니다. 허혈성 뇌졸중의 신경 병리학은 뇌로의 혈액 공급 중단으로 세포 사멸 및인지 기능 장애를 일으키는 특징이 있습니다. 허혈성 뇌졸중 중 및 후에 혈액-뇌장벽(BBB) 기능 장애는 부상 진행을 촉진하고 환자 회복 불량에 기여합니다. 현재의 BBB 모델은 주로 내피 단일 배양 및 성상 세포 또는 pericytes와의 이중 공동 배양을 포함합니다.

이러한 모델은 세포 간 통신에 필수적인 동적 뇌 미세 환경을 완전히 모방하는 능력이 부족합니다. 또한 일반적으로 사용되는 BBB 모델에는 종종 불멸화 된 인간 내피 세포 또는 번역 제한이 있는 동물 유래(설치류, 돼지 또는 소) 세포 배양이 포함됩니다. 이 논문은 시험관 내에서 허혈성 뇌 손상의 조사를 가능하게 하는 일차 인간 세포(뇌 미세혈관 내피 세포, 성상세포 및 뇌 혈관 혈관주위세포)만 포함하는 새로운 웰 삽입 기반 BBB 모델을 설명합니다.

장벽 무결성에 대한 산소-포도당 박탈(OGD)의 효과는 수동 투과성, 경내피 전기 저항(TEER) 측정 및 저산소 세포의 직접 시각화에 의해 평가되었습니다. 제시된 프로토콜은 생체 내에서 BBB의 세포 간 환경을 모방하는 뚜렷한 이점을 제공하여 허혈성 뇌 손상 설정에서 새로운 치료 전략을 개발하기 위한 보다 현실적인 시험관 내 BBB 모델로서 작용합니다.

서문

뇌졸중은 전 세계적으로 사망 및 장기 장애의 주요 원인 중 하나입니다¹. 뇌졸중 발병률은 나이가 들면서 급격히 증가하여 55 세 이후 10 년마다 두 배로 증가합니다². 허혈성 뇌졸중은 혈전 및 색전성 사건으로 인한 뇌 혈류 장애의 결과로 발생하며, 이는 모든 뇌졸중 사례의 80 % 이상을 포함합니다³. 지금도 허혈성 뇌졸중 후 조직 사망을 최소화 할 수있는 치료 옵션은 상대적으로 적습니다. 존재하는 치료법은 시간에 민감하며 결과적으로 항상 좋은 임상 결과로 이어지는 것은 아닙니다. 따라서 뇌졸중 후 회복에 영향을 미치는 허혈성 뇌졸중의 복잡한 세포 메커니즘에 대한 연구가 시급합니다.

BBB는 혈액과 뇌 실질 사이의 분자 교환을위한 동적 인터페이스입니다. 구조적으로, BBB는 기저막, 혈관주위세포, 및 성상세포 말^단발4에 의해 둘러싸인 접합 복합체에 의해 상호 연결된 뇌 미세혈관 내피 세포로 구성된다. Pericytes 및 성상 세포는 강하고 단단한 접합부 ^5,6의 형성에 필요한 다양한 인자의 분비를 통해 BBB 무결성 유지에 필수적인 역할을합니다. BBB의 고장은 허혈성 뇌졸중의 특징 중 하나입니다. 뇌 허혈과 관련된 급성 염증 반응 및 산화 스트레스는 성상 세포, 혈관주위세포 및 내피 세포 사이의 단단한 접합 단백질 복합체 및 조절 장애 누화의 파괴를 초래하여 BBB⁷에 걸쳐 부세포 용질 투과성을 증가시킵니다. BBB 기능 장애는 뇌부종의 형성을 촉진하고 출혈성 변형의 위험을 증가시킵니다⁸. 위의 모든 것을 고려할 때, 허혈성 뇌졸중 중 및 후에 BBB 수준에서 발생하는 분자 및 세포 변화를 이해하는 데 큰 관심이 있습니다.

많은 시험관 내 BBB 모델이 최근 수십 년 동안 개발되어 다양한 연구에 사용되었지만 그 중 어느 것도 생체 내 조건을 완전히 복제 할 수 없습니다⁹. 일부 모델은 잘 삽입된 투과성 지지체에서 단독으로 또는 혈관주위세포 또는 성상세포와 함께 배양된 내피 세포 단층을 기반으로 하지만, 보다 최근의 연구에서만 삼중 세포 배양 모델 설계를 도입했습니다. 거의 모든 기존 삼중 배양 BBB 모델은 동물 종으로부터 단리된 성상세포 및 혈관주위세포 또는 인간 만능 줄기 세포^10,11,12,13으로부터 유래된 세포와 함께 일차 뇌 내피 세포를 통합한다.

인간 BBB를 시험관 내에서 더 잘 요약할 필요성을 인식하고, 인간 뇌 미세혈관 내피 세포(HBMEC), 일차 인간 성상교세포(HA) 및 일차 인간 뇌 혈관 혈관주위세포(HBVP)로 구성된 삼중 세포 배양 시험 관 내 BBB 모델을 확립했습니다. 이 삼중 배양 BBB 모델은 0.4μm 공극 크기의 6웰 플레이트, 폴리에스테르 멤브레인 삽입물에 설정됩니다. 이 웰 인서트는 세포 부착을 위한 최적의 환경을 제공하며 중간 샘플링 또는 복합 적용을 위해 정점(혈액) 및 기저측(뇌) 구획 모두에 쉽게 접근할 수 있도록 합니다. 이 제안된 삼중 세포 배양 BBB 모델의 특징은 시험 관 내에서 허혈성 뇌졸중을 모방한 TEER 및 역세포 플럭스를 측정하여 평가되며, 가습되고 밀봉된 챔버를 사용하여 달성된 산소(<1%_O2) 및 영양소(무포도당 배지 사용)의 부족이 있습니다. 또한, 이 모델에서 유도된 허혈성 유사 조건은 저산소 세포의 직접적인 시각화에 의해 정확하게 검증된다.

프로토콜

참고: 이 프로토콜에 사용된 모든 셀, 재료, 장비 및 솔루션과 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 삼중 세포 배양 BBB 모델 설정

1. 심기 주위 세포
   1. 합류할 때까지 37°C에서 5%_CO2 인큐베이터 내에서 세포 접착을 위한 활성화된 표면을 가진 T75 배양 플라스크에서 HBVP를 배양합니다. 합류점에 도달하면 오래된 혈관주위세포 배지를 흡인하고 따뜻한 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 5mL로 세포를 세척합니다. DPBS를 흡인하고 4mL의 따뜻한 트립신-EDTA 용액과 1mL의 DPBS를 조합하여 플라스크에서 세포를 분리합니다.
      참고: P7 이후의 구절은 사용하지 마십시오.
   2. 플라스크를_CO2 인큐베이터에서 37°C에서 5분 동안 인큐베이션한다. 현미경으로 보고 세포가 플라스크에서 분리되었는지 확인합니다. 5mL의 따뜻한 혈관주위세포 배지(2% 소 태아 혈청[FBS] 함유)를 플라스크에 추가하고 분리된 세포를 50mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
   3. 세포 현탁액을 200 × g에서 3분 동안 원심분리하여 세포가 튜브 바닥에 펠릿을 형성하도록 합니다. 튜브에서 배지를 흡입하여 세포 펠릿이 손상되지 않았는지 확인합니다.
   4. 세포 펠렛을 혈관주위세포 배지에 재현탁시키고; 세포의 합류점과 필요한 웰 삽입물의 수에 따라 배지의 양을 계산하십시오. 재현탁 세포 10μL를 취하여 세포 계수 슬라이드에 넣고 세포 수를 계산합니다.
   5. 세포 밀도를 결정하고 웰 삽입물의 내강 면에 1mL의 혈관주위세포 배지에 삽입물 300,000개/삽입물을 시드합니다(6웰 형식).
      알림: 인서트 밑면에 HBVP를 파종할 때 먼저 잘 삽입된 플레이트를 거꾸로 뒤집는 것이 매우 중요합니다. 플레이트가 표면에 평평하게 놓인 상태에서 바닥 부분을 제거하여 웰 인서트의 면이 노출되도록 합니다. 측류면에 pericyte 세포 현탁액을 추가 한 후, 증발을 방지하기 위해 뒤집힌 판으로 웰 인서트를 덮으십시오. 모든 플레이트를 뒤집어 37°C의 5%_CO2 인큐베이터에서 밤새 보관한다.
2. 성상 세포 파종
   1. 합류점에 도달 할 때까지 37 ° C의 5 % CO₂ 인큐베이터 내에서 T75 플라스크에서 HA를 배양하십시오. 혈관주위세포 배지 대신 성상세포 배지(2% FBS 포함)를 사용하여 위의 1.1.1-1.1.4단계를 따르십시오.
      참고: P9 이후의 구절은 사용하지 마십시오.
   2. 세포 밀도를 결정하고 조직 배양 6웰 플레이트의 바닥에 300,000개의 세포/웰을 시드합니다. 증발을 방지하기 위해 플레이트를 덮고 모든 플레이트를 37°C에서 밤새 5%_CO2 인큐베이터에 보관한다.
3. 내피 세포 파종
   1. 합류할 때까지 37°C에서 5%_CO2 인큐베이터 내에서 조직 배양 접시에서 HBMEC를 배양합니다. 혈관주위세포 배지 대신 완전한 클래식 배지(10% FBS 포함)를 사용하여 위의 1.1.1-1.1.4단계를 따르십시오.
      참고: P12 이후의 구절은 사용하지 마십시오.
   2. 성상세포를 함유하는 조직 배양 6-웰 플레이트와 혈관주위세포를 함유하는 웰 삽입물(6-웰 포맷)을 37°C에서 5%_CO2 배양기로부터 꺼낸다. 조직 배양 6-웰 플레이트로부터 성상세포 배지를 흡인한다. 각 웰에 1mL의 혈관주위세포 배지와 1mL의 성상세포 배지를 추가합니다.
   3. 웰 삽입물로부터 혈관주위세포 배지를 흡인하고, 이를 파종된 성상교세포가 들어 있는 조직 배양 6-웰 플레이트에 넣는다. HBMEC를 2mL의 완전한 클래식 배지에 300,000 세포/웰 밀도로 동일한 웰 삽입물의 정점 쪽에 시드합니다.
      참고: 내피 세포는 웰 인서트의 내강 쪽에 혈관주위세포를 파종하고 조직 배양 6웰 플레이트에 성상세포를 파종한 후 다음 날 웰 삽입물의 정점 쪽에 파종해야 합니다. 세포는 BBB 유사 특성을 유도하기 위해 6일 동안 삼중 배양에서 유지되어야 합니다. 세포 배양 배지는 실험 24시간 전에 두 웰 삽입 구획 모두에서 교체해야 합니다.

2. 산소-포도당 박탈의 유도

1. DPBS로 세포를 3 배 세척하십시오. OGD를 거친 삼중 세포 배양의 경우 포도당이없는 배지 (L- 글루타민 및 페놀 레드없이)를 정점 및 기저 측 구획 모두에 추가하십시오. 배양 배지를 정상 제어 세포 배양에서 새로운 배지로 교체하십시오. 대조군 삼중 배양물을 37°C의 5%_CO2 배양기에 두었다.
   참고: OGD 유도 전 또는 OGD 직후의 배지 변화는 내피 세포 단층에 더 영향을 미치는 기계적 스트레스를 생성할 수 있습니다. 따라서, 배지 치환을 갖는 단계는 정상 대조 세포 배양을 위해 포함된다.
2. 저산소증 인큐베이터 챔버에 멸균수 20mL가 들어있는 페트리 접시를 놓아 배양 물을 적절하게 가습합니다. 링 클램프를 풀어 챔버를 엽니다. 선반에 세포 배양 물을 배열하십시오. 링 클램프를 고정하여 챔버를 밀봉하십시오.
3. 챔버의 입구 및 출구 포트를 모두 엽니다. 유량계 상단에서 나오는 튜브를 챔버에 부착합니다. 유량계 바닥에서 나오는 튜브를 에어 필터를 통해 95 % N 2 / 5 % CO₂의 가스 혼합물이 들어있는 가스 탱크에 부착하십시오. 
4. 탱크 유량 제어 밸브를 시계 반대 방향으로 돌려 열어 가스 흐름을 최소화하십시오. 시계 방향으로 돌려 압력 조절기 밸브를 천천히 엽니다.
5. 5분 동안 20L/min의 유속으로 가스 혼합물로 챔버를 세척합니다. 가스 공급원에서 챔버를 분리하고 두 흰색 플라스틱 클램프를 단단히 닫습니다.
6. 시계 방향으로 돌려 탱크 유량 제어 밸브를 끕니다. 시계 반대 방향으로 돌려 압력 조절기 밸브를 닫습니다.
7. 저산소증 챔버를 37 ° C의 기존 인큐베이터에 4 시간 동안 놓습니다.
   참고: 후속 재산소화 기간을 추가하려면 DPBS로 세포를 3배 세척하고 모든 삼중 배양에서 신선한 배지를 추가한 다음 37°C의 5%_CO2 인큐베이터에서 추가로 24시간 동안 유지합니다. 제조업체의 지침에 따르면 챔버에 남아있는 산소 농도는 20L/min에서 혐기성 가스 혼합물로 4분 이상 퍼징한 후 0%입니다.

3. 티어 측정

1. 멸균된 TEER 기기를 생물안전 캐비닛에 넣고 전극을 상피 전압저항계에 꽂습니다. 전극을 30mL의 70% 이소프로필 알코올 용액에 최소 30분 동안 소독합니다.
2. TEER 기기를 켜고 기능을 옴으로 설정합니다.
3. 70% 이소프로필 알코올 용액에서 전극을 제거하고 TEER 장치의 디지털 판독값이 0옴이 될 때까지 최소 30분 동안 20mL의 DPBS에 넣습니다.
4. 블랭크 웰 인서트 컨트롤의 웰 인서트 행거에 있는 세 개의 구멍 중 하나를 통해 전극의 긴 갈래를 삽입하고 웰 바닥에 닿을 때까지 내립니다. 짧은 갈래가 웰 인서트 바닥의 정점 배양 물 위에 놓여 있는지 확인하십시오.
   참고: 빈 웰 삽입 대조군은 정점 구획에 2mL의 완전한 클래식 배지와 기저측 구획에 1mL의 혈관주위세포 배지와 1mL의 성상세포 배지의 조합으로 구성됩니다. TEER 측정을 수행하는 동안 전극이 웰 인서트에 대해 90°로 유지되는지 확인합니다. 동일한 웰(개구당)에서 얻은 2개 또는 3개의 판독값의 평균을 사용하면 변동성을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다.
5. 값을 기록하기 전에 TEER 기기의 디지털 판독값이 꺼질 때까지 기다리십시오. 전극을 DPBS에 다시 넣어 측정 사이에 세척하십시오. 두 개의 빈 웰 삽입 컨트롤에 대한 모든 TEER 측정값을 계속 수집합니다.
6. 대조 측정을 위해 취해진 단계 3.4-3.5를 사용하여 샘플 플레이트의 TEER 측정값을 수집합니다. 모든 측정이 완료되면 전극을 70% 이소프로필 알코올 용액에 30분 동안 다시 넣습니다. TEER 기기에서 전극을 분리하고 자연 건조시킵니다.
7. TEER 값을 계산합니다. 식 (1)을 사용하여 샘플의 옴 값에서 블랭크 웰 인서트 대조군의 평균 옴 값을 뺀 다음 이 저항 값에 멤브레인 인서트 면적(cm2)을 곱하여 보고된 TEER 값을 Ω∙^cm2로 제공합니다.
   (1)

4. BBB 초세포 투과성 평가

참고: 조명을 끈 상태에서 세포 배양 생물안전 캐비닛에서 FITC-덱스트란과 관련된 모든 단계를 수행하십시오. FITC-덱스트란 용액을 알루미늄 호일로 덮어 광퇴색을 최소화합니다.

1. 페놀 레드가 없는 내피 세포 성장 배지를 사용하여 20 및 70kDa(0.1mg/mL)의 FITC-덱스트란을 함유한 용액을 준비하고 로킹 플랫폼 쉐이커에서 1시간 동안 교반합니다. 0.22 μm 주사기 필터를 사용하여 용액을 여과합니다.
2. 기저측 구획에서 배지를 흡인하고 삼중 세포 배양 BBB 모델에서 페놀 레드가 없는 내피 세포 성장 배지 2mL로 교체합니다. 정점 구획의 세포를 행크스의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)으로 두 번 씻으십시오.
3. 정점 구획에 FITC- 덱스 트란 용액 1mL를 추가하고 플레이트를 알루미늄 호일로 덮습니다. 플레이트를 37°C에서 1시간 동안 5%_CO2 인큐베이터에 넣습니다.
4. 기저측 구획에서 100μL의 배지를 꺼내 검은색 96웰 플레이트로 옮깁니다. 여기 및 방출 파장이 각각 480nm 및 530nm로 설정된 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 형광을 측정합니다.

5. 살아있는 세포에서 저산소증 검출

1. 200 μL의 HBMEC, HA 및 HBVP를 폴리 -d- 라이신 코팅 된 35mm 유리 바닥 접시의 중앙에 150,000 셀 / 접시의 밀도로 시드합니다. HBMEC를 파종하기 전에 접시 바닥에 부착 계수를 코팅하십시오. 세포를_CO2 인큐베이터에서 37°C에서 밤새 방치함으로써 유리 표면에 부착되도록 한다.
   참고: OGD용 저산소증 챔버에 트리플 웰 삽입 BBB 모델과 동시에 인간 일차 세포와 접시를 놓는 것이 중요합니다.
2. 합류점에 도달하면 배양 배지를 버리고 참조된 Image-iT 녹색 저산소증 시약(최종 농도 1μM)의 1mM Hoechst 33342(최종 농도 0.2μM) 2μL와 5mM 스톡 용액 0.5μL를 포함하는 예열된 포도당이 없는 배지(OGD용) 또는 정상 배지(대조군용) 2mL를 추가합니다. OGD 처리 후 모든 접시에서 배지를 이미징 최적화 배지로 교체하십시오.
3. 앞서 설명한 대로 GFP 필터와 최상위 컨포칼 현미경 인큐베이터를 사용하여 형광 라이브 셀 이미징을 수행합니다^14,15.

결과

HBMEC의 장벽 기능에 대한 성상 세포 및 주변 세포의 영향을 조사하기 위해 HBMEC 단일 배양 및 대조군으로 두 개의 이중 공동 배양 모델 (그림 1B)과 함께 세포 배양 삽입물 (그림 1A)에 대한 삼중 세포 배양 BBB 모델을 구성했습니다. 이중 공동 배양 통제에는 HBMEC와 HA의 비접촉 공동 배양 및 HBMEC와 HBVP의 접촉 공동 배양이 포함되었습니다. 공동 배양에서 6일 ...

토론

이 프로토콜에서, 우리는 시험관 내 허혈성 뇌졸중의 설정에서 BBB 기능 장애를 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 삼중 내피 세포-pericyte-성상세포 배양 BBB 모델을 설정하는 방법을 설명합니다. 혈관주위세포가 생체내에서 내피 세포의 가장 가까운 이웃이라는 것을 고려 하면, HBVP는 이 모델¹⁶에서 웰 삽입물의 밑면에 도금된다. 이러한 구성은 성상 세포와 내피 세포 사?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert	Corning	3450
35 mm Glass Bottom Dishes	MatTek Life Sciences (FISHERSCI)	P35GC-1.5-14-C
Astrocyte Medium	Science Cell	1801
Attachment Factor	Cell Systems (Fisher Scientific)	4Z0-201
BD 60 mL Syringe	BD	309653
BrainPhys Imaging Optimized Medium	STEMCELL Technologies	5791
Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost	4Z0-500	Cell Systems
Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap	VWR	430829
Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask	Corning	431464U
Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates	Corning	3340
Countes Cell Counting Chamber Slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
Countess II FL Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	ZGEXSCCOUNTESS2FL
Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution	Fisher Scientific	04-355-71
Disposable Petri Dishes	VWR	25384-088
DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red)	ThermoFisher	A14430-01	Glucose-free medium
DPBS (No Calcium, No Magnesium)	ThermoFisher	14190250
EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL	Lonza	CC-3129
EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes	World Precison Instruments	NC9792051	Epithelial voltohmmeter
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000)	Millipore Sigma	FD20-250MG
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000)	Millipore Sigma	FD70S-250MG
Fluorview FV3000 Confocal Microscope	Olympus	FV3000
Gas Tank (95% N2, 5% CO2)	Airgas	X02NI95C2003071
HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red)	Thermofisher	14025092
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher	H3570
Human Astrocytes	Science Cell	1800
Human Brain Vascular Pericytes	Science Cell	1200
Hypoxia Incubator Chamber	STEMCELL Technologies	27310
Image-iT Green Hypoxia Reagent	ThermoFisher	I14834
Pericyte Medium	Science Cell	1201
Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells	ACBRI 376	Cell Systems
Rocking Platform Shaker, Double	VWR	10860-658
Single Flow Meter	STEMCELL Technologies	27311
SpectraMax iD3 Microplate Reader	Molecular Devices	75886-128
Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile	NEST Scientific	380121
TPP Mutli-well Plates (6 wells)	MidSci	TP92406
TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks	MidSci	TP90075	Flasks with activated surface for cell adhesion
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFisher	25200056
UltraPure Distilled Water	Invitrogen (Life Technologies)	10977-015
Uno Stage Top Incubator-	Oko Lab	UNO-T-H-CO2-TTL