Un triplo modello di coltura cellulare primaria della barriera emato-encefalica umana per lo studio dell'ictus ischemico in vitro

Riepilogo

Qui, descriviamo il metodo per stabilire un modello di coltura cellulare tripla della barriera emato-encefalica basato su cellule endoteliali microvascolari primarie del cervello umano, astrociti e periciti. Questo modello multicellulare è adatto per studi di disfunzione delle unità neurovascolari durante l'ictus ischemico in vitro o per lo screening di farmaci candidati.

Abstract

L'ictus ischemico è una delle principali cause di morte e disabilità in tutto il mondo con opzioni terapeutiche limitate. La neuropatologia dell'ictus ischemico è caratterizzata da un'interruzione dell'afflusso di sangue al cervello che porta alla morte cellulare e alla disfunzione cognitiva. Durante e dopo l'ictus ischemico, la disfunzione della barriera emato-encefalica (BBB) facilita la progressione della lesione e contribuisce a uno scarso recupero del paziente. Gli attuali modelli di BBB includono principalmente monocolture endoteliali e doppie co-colture con astrociti o periciti.

Tali modelli non hanno la capacità di imitare completamente un microambiente cerebrale dinamico, che è essenziale per la comunicazione cellula-cellula. Inoltre, i modelli BBB comunemente usati contengono spesso cellule endoteliali umane immortalizzate o colture cellulari di derivazione animale (roditori, suini o bovini) che pongono limitazioni traslazionali. Questo articolo descrive un nuovo modello di BBB basato su inserti contenenti solo cellule umane primarie (cellule endoteliali microvascolari cerebrali, astrociti e periciti vascolari cerebrali) che consente lo studio del danno cerebrale ischemico in vitro.

Gli effetti della deprivazione di ossigeno-glucosio (OGD) sull'integrità della barriera sono stati valutati mediante misurazioni di permeabilità passiva, resistenza elettrica transendoteliale (TEER) e visualizzazione diretta delle cellule ipossiche. Il protocollo presentato offre un netto vantaggio nell'imitare l'ambiente intercellulare della BBB in vivo, fungendo da modello di BBB in vitro più realistico per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche nel contesto della lesione cerebrale ischemica.

Introduzione

L'ictus è una delle principali cause di morte e disabilità a lungo termine in tutto il mondo¹. L'incidenza dell'ictus aumenta rapidamente con l'età, raddoppiando ogni 10 anni dopo i 55 anni². L'ictus ischemico si verifica a seguito di un'interruzione del flusso sanguigno cerebrale dovuta a eventi trombotici ed embolici, che comprende oltre l'80% di tutti i casi di ictus³. Anche ora, ci sono relativamente poche opzioni di trattamento disponibili per ridurre al minimo la morte dei tessuti dopo l'ictus ischemico. I trattamenti esistenti sono sensibili al tempo e di conseguenza non sempre portano a buoni risultati clinici. Pertanto, è urgentemente necessaria la ricerca sui complessi meccanismi cellulari dell'ictus ischemico che influenzano il recupero post-ictus.

La BBB è un'interfaccia dinamica per lo scambio di molecole tra il sangue e il parenchima cerebrale. Strutturalmente, la BBB è composta da cellule endoteliali microvascolari cerebrali interconnesse da complessi giunzionali circondati da una membrana basale, periciti e estremità astrocitiche⁴. Periti e astrociti svolgono un ruolo essenziale nel mantenimento dell'integrità della BEE attraverso la secrezione di vari fattori necessari per la formazione di giunzioni forti e strette ^5,6. La rottura della BBB è uno dei tratti distintivi dell'ictus ischemico. La risposta infiammatoria acuta e lo stress ossidativo associati all'ischemia cerebrale provocano la rottura dei complessi proteici a giunzione stretta e la diafonia disregolata tra astrociti, periciti e cellule endoteliali, che porta ad un aumento della permeabilità del soluto paracellulare attraverso la BBB⁷. La disfunzione della BEE promuove ulteriormente la formazione di edema cerebrale e aumenta il rischio di trasformazione emorragica⁸. Considerando tutto quanto sopra, c'è un grande interesse nella comprensione dei cambiamenti molecolari e cellulari che si verificano a livello di BBB durante e dopo l'ictus ischemico.

Sebbene molti modelli di BBB in vitro siano stati sviluppati negli ultimi decenni e utilizzati in una varietà di studi, nessuno di essi può replicare completamente le condizioni in vivo ⁹. Mentre alcuni modelli sono basati su monostrati di cellule endoteliali coltivati su supporti permeabili ben inseriti da soli o in combinazione con periciti o astrociti, solo studi più recenti hanno introdotto progetti di modelli di coltura cellulare tripla. Quasi tutti i modelli esistenti di tripla coltura BBB incorporano cellule endoteliali cerebrali primarie insieme ad astrociti e periciti isolati da specie animali o cellule derivate da cellule staminali pluripotenti umane^10,11,12,13.

Riconoscendo la necessità di ricapitolare meglio la BBB umana in vitro, abbiamo stabilito un modello di BBB in vitro con tripla coltura cellulare composto da cellule endoteliali microvascolari del cervello umano (HBMEC), astrociti umani primari (HA) e periciti vascolari primari del cervello umano (HBVP). Questo modello BBB a tripla coltura è impostato su inserti in membrana di poliestere a 6 pozzetti con dimensioni dei pori di 0,4 μm. Questi inserti forniscono un ambiente ottimale per l'attacco cellulare e consentono un facile accesso ai compartimenti apicali (sangue) e basolaterale (cervello) per il campionamento medio o l'applicazione di composti. Le caratteristiche di questo modello di BBB di coltura a tripla cellula proposto sono valutate misurando TEER e flusso paracellulare post OGD che imita l'ictus ischemico in vitro, con una carenza di ossigeno (<1% O₂) e nutrienti (utilizzando terreno privo di glucosio) ottenuta utilizzando una camera umidificata e sigillata. Inoltre, le condizioni ischemiche-simili indotte in questo modello sono accuratamente verificate mediante visualizzazione diretta delle cellule ipossiche.

Protocollo

NOTA: vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutte le celle, i materiali, le apparecchiature e le soluzioni utilizzate in questo protocollo.

1. Impostazione del modello BBB a tripla coltura cellulare

1. Semina dei periciti
   1. Coltivare HBVP in palloni di coltura T75 con una superficie attivata per l'adesione cellulare all'interno di un incubatore al 5% di CO₂ a 37 °C fino alla conflusività. Una volta raggiunta la confluenza, aspirare il vecchio mezzo pericitario e lavare le cellule con 5 ml di soluzione salina tamponata fosfato caldo di Dulbecco (DPBS). Aspirare il DPBS e staccare le cellule dal matraccio utilizzando una combinazione di 4 mL di soluzione calda di tripsina-EDTA e 1 mL di DPBS.
      NOTA: evitare di utilizzare passaggi successivi a P7.
   2. Incubare il matraccio per 5 minuti a 37 °C in un incubatore a CO₂ . Visualizza al microscopio per confermare se le cellule sono staccate dal pallone. Aggiungere 5 mL di terreno caldo per periciti (contenente il 2% di siero fetale bovino [FBS]) al matraccio e trasferire le cellule staccate in una provetta da centrifuga da 50 ml.
   3. Centrifugare la sospensione cellulare per 3 minuti a 200 × g, consentendo alle cellule di formare un pellet sul fondo del tubo. Aspirare il mezzo dal tubo, assicurandosi che il pellet cellulare rimanga intatto.
   4. Risospendere il pellet cellulare nel mezzo pericitario; Calcola la quantità di mezzo in base alla confluenza delle celle e al numero di inserti necessari. Prendi 10 μL delle cellule risospese, mettile in un vetrino per il conteggio delle cellule e conta il numero di cellule.
   5. Determinare la densità cellulare e seminare 300.000 cellule/inserire 1 mL di terreno pericitario sul lato abluminale degli inserti del pozzetto (formato 6 pozzetti).
      NOTA: Quando si semina HBVP sul lato inferiore degli inserti, è molto importante capovolgere prima le piastre del pozzo capovolte. Mentre la piastra è appoggiata su una superficie, rimuovere la sezione inferiore per esporre il lato abluminale degli inserti del pozzo. Dopo aver aggiunto la sospensione delle cellule pericitarie sul lato abluminale, coprire gli inserti del pozzetto con la piastra capovolta per evitare l'evaporazione. Tenere tutte le piastre capovolte in un incubatore al 5% di CO₂ a 37 °C durante la notte.
2. Seminare astrociti
   1. Coltivare l'HA in matraccio T75 all'interno di un incubatore al 5% di CO₂ a 37 °C fino al raggiungimento della confluenza. Seguire i passaggi precedenti 1.1.1-1.1.4 utilizzando il mezzo astrocitario (contenente anche il 2% di FBS) invece del mezzo pericitario.
      NOTA: evitare di utilizzare passaggi successivi a P9.
   2. Determinare la densità cellulare e seminare 300.000 cellule / pozzetto sul fondo delle piastre a 6 pozzetti della coltura tissutale. Coprire la piastra per evitare l'evaporazione e conservare tutte le piastre in un incubatore al 5% di CO₂ a 37 °C durante la notte.
3. Semina di cellule endoteliali
   1. Coltivare HBMEC in piatti di coltura tissutale all'interno di un incubatore al 5% di CO₂ a 37 °C fino alla confluenza. Seguire i passaggi precedenti 1.1.1-1.1.4 utilizzando il mezzo classico completo (contenente il 10% di FBS) invece del mezzo pericitario.
      NOTA: evitare di utilizzare passaggi successivi a P12.
   2. Estrarre le piastre di coltura tissutale a 6 pozzetti contenenti astrociti e gli inserti a pozzetto (formato 6 pozzetti) contenenti periciti dall'incubatore al 5% di CO₂ a 37 °C. Aspirare il mezzo astrocitario dalle piastre di coltura tissutale a 6 pozzetti. Aggiungere 1 mL di terreno pericitario e 1 mL di terreno astrocitario a ciascun pozzetto.
   3. Aspirare il mezzo pericitario dagli inserti del pozzetto e inserirli nelle piastre a 6 pozzetti di coltura tissutale contenenti gli astrociti seminati. Seminare HBMEC ad una densità di 300.000 cellule/pozzetto in 2 ml di terreno classico completo sul lato apicale degli stessi inserti del pozzetto.
      NOTA: Le cellule endoteliali devono essere seminate sul lato apicale degli inserti del pozzetto il giorno successivo dopo aver seminato periciti sul lato abluminale degli inserti del pozzo e astrociti su piastre di coltura tissutale a 6 pozzetti. Le cellule devono essere mantenute in tripla coltura per 6 giorni per indurre proprietà simili alla BBB. Il terreno di coltura cellulare deve essere cambiato in entrambi i compartimenti ben inseriti 24 ore prima degli esperimenti.

2. Induzione della privazione di ossigeno-glucosio

1. Lavare le celle 3 volte con DPBS. Per le colture cellulari triple sottoposte a OGD, aggiungere terreno privo di glucosio (senza L-glutammina e rosso fenolo) sia al compartimento apicale che basolaterale. Sostituire il terreno di coltura con terreno fresco nelle colture cellulari di controllo normossiche. Posizionare le colture triple di controllo nell'incubatore al 5% di CO₂ a 37 °C.
   NOTA: Cambiamenti del mezzo prima dell'induzione di OGD o immediatamente dopo OGD potrebbero creare stress meccanico che avrebbe un ulteriore impatto sui monostrati delle cellule endoteliali. Pertanto, i passaggi con sostituzione media sono inclusi per colture cellulari di controllo normossiche.
2. Posizionare una capsula di Petri contenente 20 ml di acqua sterile nella camera dell'incubatore per ipossia per fornire un'adeguata umidificazione delle colture. Aprire la camera rilasciando il morsetto ad anello. Disporre le colture cellulari sugli scaffali. Sigillare la camera fissando il morsetto ad anello.
3. Aprire sia le porte di ingresso che quelle di uscita della camera. Collegare il tubo proveniente dalla parte superiore del flussometro alla camera. Fissare il tubo proveniente dal fondo del flussometro al serbatoio del gas contenente la miscela di gas di 95% N 2/5% CO₂tramite un filtro dell'aria. 
4. Aprire la valvola di controllo del flusso del serbatoio ruotandola in senso antiorario per consentire il flusso minimo di gas. Aprire lentamente la valvola del regolatore di pressione ruotando in senso orario.
5. Lavare la camera con la miscela di gas ad una portata di 20 L/min per 5 min. Scollegare la camera dalla fonte di gas e chiudere saldamente entrambi i morsetti di plastica bianca.
6. Spegnere la valvola di controllo del flusso del serbatoio ruotando in senso orario. Chiudere la valvola del regolatore di pressione ruotando in senso antiorario.
7. Posizionare la camera di ipossia in un'incubatrice convenzionale a 37 °C per 4 ore.
   NOTA: Per aggiungere un successivo periodo di riossigenazione, lavare le cellule 3 volte con DPBS, aggiungere terreno fresco in tutte le colture triple e conservare per altre 24 ore nell'incubatore al 5% di CO₂ a 37°C. Secondo le istruzioni del produttore, la concentrazione di ossigeno rimanente nella camera è dello 0% dopo non meno di 4 minuti di spurgo con miscela di gas anaerobico a 20 L / min.

3. Misurazioni TEER

1. Inserire lo strumento TEER sterilizzato nell'armadio di biosicurezza e collegare gli elettrodi al voltohmmetro epiteliale. Sterilizzare gli elettrodi in 30 ml di soluzione di alcool isopropilico al 70% per un minimo di 30 minuti.
2. Accendere lo strumento TEER e impostare la funzione su ohm.
3. Rimuovere gli elettrodi dalla soluzione di alcool isopropilico al 70% e metterli in 20 ml di DPBS per un minimo di 30 minuti fino a quando la lettura digitale sul dispositivo TEER non legge 0 ohm.
4. Inserire la punta lunga dell'elettrodo attraverso una delle tre aperture nel gancio del pozzo del controllo dell'inserimento del pozzo vuoto, abbassandolo fino a toccare il fondo del pozzetto. Assicurarsi che la punta corta sia appoggiata sopra la coltura apicale sul fondo dell'inserto del pozzo.
   NOTA: Il controllo dell'inserto del pozzetto bianco è composto da 2 ml di terreno classico completo nel compartimento apicale e una combinazione di 1 mL di mezzo pericitario e 1 mL di terreno astrocitario nel compartimento basolaterale. Assicurarsi che gli elettrodi siano mantenuti a 90° rispetto all'inserto del pozzetto durante la misurazione TEER. Utilizzare la media di due o tre letture ottenute nello stesso pozzetto (per apertura) può aiutare a diminuire la variabilità.
5. Attendere che i valori di lettura digitale sullo strumento TEER si stabilizzino prima di registrare il valore. Posizionare nuovamente gli elettrodi in DPBS per lavarli tra una misurazione e l'altra. Continuare a raccogliere tutte le misurazioni TEER per altri due controlli di inserimento del pozzo vuoti.
6. Raccogliere le misure TEER delle piastre campione utilizzando i passaggi 3.4-3.5 presi per le misurazioni di controllo. Una volta effettuate tutte le misurazioni, riposizionare l'elettrodo nella soluzione di alcol isopropilico al 70% per 30 minuti. Scollegare gli elettrodi dallo strumento TEER e lasciarli asciugare all'aria.
7. Calcolare i valori TEER. Utilizzare l'equazione (1) per sottrarre il valore ohm medio del controllo dell'inserto del pozzo bianco dal valore ohm del campione, quindi moltiplicare questo valore di resistenza per l'area dell'inserto della membrana (cm 2) per ottenere il valore TEER riportato in Ω∙cm².
   (1)

4. Valutazione della permeabilità paracellulare della BEE

NOTA: Eseguire tutti i passaggi che coinvolgono FITC-destrano in un armadio di biosicurezza per colture cellulari con le luci spente. Coprire le soluzioni FITC-destrano con un foglio di alluminio per ridurre al minimo il fotosbiancamento.

1. Preparare soluzioni contenenti FITC-destrani di 20 e 70 kDa (0,1 mg/ml) utilizzando un mezzo di crescita delle cellule endoteliali privo di rosso fenolo e lasciare agitare su uno shaker a piattaforma oscillante per 1 ora. Filtrare le soluzioni utilizzando un filtro a siringa da 0,22 μm.
2. Aspirare il mezzo dal compartimento basolaterale e sostituirlo con 2 ml di terreno di crescita delle cellule endoteliali prive di rosso fenolo nel modello BBB a tripla coltura cellulare. Lavare le cellule nel compartimento apicale due volte con la soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS).
3. Aggiungere 1 mL della soluzione di destrano FITC nello scomparto apicale e coprire la piastra con un foglio di alluminio. Posizionare la piastra in un incubatore al 5% di CO₂ a 37 °C per 1 ora.
4. Prendi 100 μL di terreno dai compartimenti basolaterali e trasferiscilo in una piastra nera da 96 pozzetti. Misurare la fluorescenza utilizzando un lettore di micropiastre con le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione impostate rispettivamente a 480 nm e 530 nm.

5. Rilevamento di ipossia in cellule vive

1. Seme 200 μL di HBMEC, HA e HBVP al centro di piatti con fondo di vetro rivestiti di poli-d-lisina, con fondo di 35 mm ad una densità di 150.000 cellule/piatto. Prima di seminare HBMEC, rivestire il fondo dei piatti con il fattore di attacco. Lasciare che le celle si attacchino alla superficie del vetro lasciandole per una notte a 37 °C in un incubatore a CO₂ .
   NOTA: È importante posizionare i piatti con cellule primarie umane allo stesso tempo con un modello di BBB a triplo pozzo in una camera di ipossia per OGD.
2. Una volta raggiunta la confluenza, eliminare il terreno di coltura e aggiungere 2 ml di terreno privo di glucosio preriscaldato (per OGD) o terreno normale (per controlli) contenente 2 μL di 1 mM Hoechst 33342 (concentrazione finale 0,2 μM) e 0,5 μL di soluzione madre 5 mM del reagente di ipossia verde Image-iT di riferimento (concentrazione finale 1 μM). Dopo il trattamento con OGD, sostituire il mezzo con un mezzo ottimizzato per l'imaging in tutti i piatti.
3. Eseguire l'imaging a fluorescenza con cellule vive con il filtro GFP e l'incubatore al microscopio confocale top-stage come descritto in precedenza^14,15.

Risultati

Per esaminare gli effetti di astrociti e periciti sulla funzione barriera di HBMEC, abbiamo costruito il modello BBB di coltura cellulare tripla su inserti di coltura cellulare (Figura 1A) insieme alla monocoltura HBMEC e due modelli di doppia co-coltura come controlli (Figura 1B). I doppi controlli di co-coltura includevano una co-coltura senza contatto di HBMEC con HA e una co-coltura di contatto di HBMEC con HBVP. Dopo 6 giorni di co-coltura, tutti i setup sp...

Discussione

In questo protocollo, descriviamo un metodo per impostare un modello affidabile di coltura di cellule tripli endoteliali-periciti-astrociti per lo studio della disfunzione della BEE nel contesto dell'ictus ischemico in vitro. Considerando che i periciti sono i vicini più prossimi delle cellule endoteliali in vivo, gli HBVP sono placcati sul lato inferiore degli inserti del pozzo in questo modello¹⁶. Sebbene questa configurazione manchi della comunicazione diretta cellula-cellula...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert	Corning	3450
35 mm Glass Bottom Dishes	MatTek Life Sciences (FISHERSCI)	P35GC-1.5-14-C
Astrocyte Medium	Science Cell	1801
Attachment Factor	Cell Systems (Fisher Scientific)	4Z0-201
BD 60 mL Syringe	BD	309653
BrainPhys Imaging Optimized Medium	STEMCELL Technologies	5791
Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost	4Z0-500	Cell Systems
Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap	VWR	430829
Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask	Corning	431464U
Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates	Corning	3340
Countes Cell Counting Chamber Slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
Countess II FL Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	ZGEXSCCOUNTESS2FL
Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution	Fisher Scientific	04-355-71
Disposable Petri Dishes	VWR	25384-088
DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red)	ThermoFisher	A14430-01	Glucose-free medium
DPBS (No Calcium, No Magnesium)	ThermoFisher	14190250
EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL	Lonza	CC-3129
EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes	World Precison Instruments	NC9792051	Epithelial voltohmmeter
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000)	Millipore Sigma	FD20-250MG
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000)	Millipore Sigma	FD70S-250MG
Fluorview FV3000 Confocal Microscope	Olympus	FV3000
Gas Tank (95% N2, 5% CO2)	Airgas	X02NI95C2003071
HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red)	Thermofisher	14025092
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher	H3570
Human Astrocytes	Science Cell	1800
Human Brain Vascular Pericytes	Science Cell	1200
Hypoxia Incubator Chamber	STEMCELL Technologies	27310
Image-iT Green Hypoxia Reagent	ThermoFisher	I14834
Pericyte Medium	Science Cell	1201
Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells	ACBRI 376	Cell Systems
Rocking Platform Shaker, Double	VWR	10860-658
Single Flow Meter	STEMCELL Technologies	27311
SpectraMax iD3 Microplate Reader	Molecular Devices	75886-128
Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile	NEST Scientific	380121
TPP Mutli-well Plates (6 wells)	MidSci	TP92406
TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks	MidSci	TP90075	Flasks with activated surface for cell adhesion
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFisher	25200056
UltraPure Distilled Water	Invitrogen (Life Technologies)	10977-015
Uno Stage Top Incubator-	Oko Lab	UNO-T-H-CO2-TTL