虚血性脳卒中をin vitroで研究するためのヒト血液脳関門のトリプル初代細胞培養モデル

要約

ここでは、初代ヒト脳微小血管内皮細胞、アストロサイト、周皮細胞に基づく血液脳関門のトリプルセル培養モデルの確立方法について述べる。この多細胞モデルは、 in vitro での虚血性脳卒中中の神経血管ユニット機能障害の研究や薬剤候補のスクリーニングに適しています。

要約

虚血性脳卒中は、世界中の主要な死因および障害であり、治療の選択肢は限られています。虚血性脳卒中の神経病理学は、細胞死および認知機能障害につながる脳への血液供給の中断によって特徴付けられる。虚血性脳卒中中および脳卒中後、血液脳関門(BBB)機能障害は傷害の進行を促進し、患者の回復不良の一因となります。現在のBBBモデルには、主に内皮単培養と、星状細胞または周皮細胞のいずれかとの二重共培養が含まれます。

このようなモデルは、細胞間コミュニケーションに不可欠な動的な脳微小環境を完全に模倣する能力を欠いています。さらに、一般的に使用されるBBBモデルには、翻訳制限をもたらす不死化ヒトリンパ管内皮細胞または動物由来(げっ歯類、ブタ、またはウシ)細胞培養物が含まれていることがよくあります。この論文では、初代ヒト細胞(脳微小血管内皮細胞、星状細胞、および脳血管周皮細胞)のみを含む新しいウェルインサートベースのBBBモデルについて説明し、 in vitroで虚血性脳損傷の調査を可能にします。

バリアの完全性に対する酸素-グルコース欠乏(OGD)の影響は、受動的透過性、経内皮電気抵抗(TEER)測定、および低酸素細胞の直接視覚化によって評価されました。提示されたプロトコルは、 インビボでのBBBの細胞間環境を模倣する明確な利点を提供し、虚血性脳損傷の設定における新しい治療戦略を開発するためのより現実的な インビトロ BBBモデルとして機能します。

概要

脳卒中は、世界中の主要な死因および長期障害の1つです¹。脳卒中の発生率は年齢とともに急速に増加し、55歳以降10年ごとに倍増します^2。虚血性脳卒中は、血栓性および塞栓性イベントによる脳血流障害の結果として発生し、これはすべての脳卒中症例の80%以上を網羅しています³。現在でも、虚血性脳卒中後の組織死を最小限に抑えるために利用できる治療選択肢は比較的少ない。存在する治療法は時間に敏感であり、その結果、必ずしも良好な臨床転帰につながるとは限りません。したがって、脳卒中後の回復に影響を与える虚血性脳卒中の複雑な細胞メカニズムの研究が急務です。

BBBは、血液と脳実質の間の分子交換のための動的インターフェースです。構造的には、BBBは、基底膜に囲まれた接合複合体によって相互接続された脳微小血管内皮細胞、周皮細胞、および星状細胞端部4で構成されています^。周皮細胞および星状細胞は、強力でタイトな接合部の形成に必要な様々な因子の分泌を通じて、BBBの完全性の維持に不可欠な役割を果たす^5,6。BBBの内訳は、虚血性脳卒中の特徴の1つです。脳虚血に関連する急性炎症反応および酸化ストレスは、タイトジャンクションタンパク質複合体の破壊および星状細胞、周皮細胞、および内皮細胞間の調節不全のクロストークをもたらし、BBB⁷全体の傍細胞溶質透過性の増加をもたらす。BBB機能障害は、脳浮腫の形成をさらに促進し、出血性変換のリスクを高めます⁸。上記のすべてを考慮すると、虚血性脳卒中中および脳卒中後にBBBレベルで発生する分子および細胞の変化を理解することに大きな関心があります。

多くのin vitro BBBモデルがここ数十年にわたって開発され、さまざまな研究で使用されてきましたが、それらのどれもin vivo条件を完全に複製することはできません⁹。一部のモデルは、ウェルインサート透過性支持体上で単独で、または周皮細胞または星状細胞と組み合わせて培養された内皮細胞単層に基づいていますが、トリプルセル培養モデル設計を導入しているのは最近の研究だけです。ほとんどすべての既存の三重培養BBBモデルは、動物種またはヒト多能性幹細胞に由来する細胞から単離された星状細胞および周皮細胞と共に初代脳内皮細胞を組み込んでいる^10、11、^12、13。

ヒトBBBをin vitroでよりよく再現する必要性を認識し、ヒト脳微小血管内皮細胞(HBMEC)、初代ヒトアストロサイト(HA)、および初代ヒト脳血管周皮細胞(HBVP)で構成されるトリプルセル培養in vitroBBBモデルを確立しました。このトリプルカルチャーBBBモデルは、孔径0.4 μmの6ウェルプレートポリエステルメンブレンインサート上にセットアップされます。これらのウェルインサートは、細胞接着に最適な環境を提供し、培地サンプリングまたは化合物塗布のために頂端(血液)コンパートメントと基底外側(脳)コンパートメントの両方に簡単にアクセスできます。この提案されたトリプルセル培養BBBモデルの特徴は、酸素(<1%_O2)と栄養素の不足(グルコースフリー培地を使用)が加湿された密閉チャンバーを使用して達成された、虚血性脳卒中を模倣したOGD後のTEERおよび傍細胞フラックスを測定することによって評価されます。さらに、このモデルで誘導された虚血様条件は、低酸素細胞を直接可視化することによって正確に検証されます。

プロトコル

注意: このプロトコルで使用されるすべてのセル、材料、機器、およびソリューションに関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。

1. トリプルセル培養BBBモデル設定

1. 周皮細胞の播種
   1. 細胞接着のために活性化された表面を有するT75培養フラスコ内でHBVPを、5%_CO2 インキュベーター内で、コンフルエントになるまで37°Cで培養する。コンフルエントに達したら、古い周皮細胞培地を吸引し、5 mLの温かいダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で細胞を洗浄します。DPBSを吸引し、4 mLの温かいトリプシン-EDTA溶液と1 mLのDPBSの組み合わせを使用して、フラスコから細胞を剥離します。
      注: P7 より後のパッセージは使用しないでください。
   2. フラスコを_CO2 インキュベーター内で37°Cで5分間インキュベートする。細胞がフラスコから剥離しているかどうかを確認するために顕微鏡で観察する。5 mLの温かい周皮細胞培地(2%ウシ胎児血清[FBS]を含む)をフラスコに加え、剥離した細胞を50 mLの遠沈管に移します。
   3. 細胞懸濁液を200 × gで3分間遠心分離し、細胞がチューブの底にペレットを形成できるようにします。チューブから培地を吸引し、細胞ペレットが無傷のままであることを確認します。
   4. 細胞ペレットを周皮細胞培地に再懸濁する;細胞の合流点と必要なウェルインサートの数に応じて培地の量を計算します。再懸濁した細胞を10 μL取り、細胞カウントスライドに入れ、細胞数をカウントします。
   5. 細胞密度を決定し、1 mLの周皮細胞培地に300,000細胞/インサートをウェルインサート(6ウェルフォーマット)の腺側に播種します。
      注:インサートの下側にHBVPをシードする場合は、最初にウェルインサートプレートを逆さまに裏返すことが非常に重要です。プレートを表面に平らに置いた状態で、底部を取り外してウェルインサートのアブミナル側を露出させます。果皮細胞懸濁液をアブミナル側に加えた後、蒸発を防ぐためにウェルインサートを反転プレートで覆います。すべてのプレートを逆さまにして、37°Cの5%_CO2 インキュベーターで一晩保持します。
2. アストロサイトの播種
   1. コンフルエントに達するまで、5%_CO2 インキュベーター内のT75フラスコでHAを37°Cで培養します。周皮細胞培地の代わりに星状細胞培地(2%FBSも含む)を使用して、上記の手順1.1.1-1.1.4に従います。
      注: P9 より後のパッセージは使用しないでください。
   2. 細胞密度を決定し、300,000細胞/ウェルを組織培養6ウェルプレートの底に播種します。蒸発を防ぐためにプレートを覆い、すべてのプレートを5%_CO2 インキュベーターに37°Cで一晩保管します。
3. 内皮細胞の播種
   1. 組織培養皿中のHBMECを5%_CO2 インキュベーター内で、コンフルエントになるまで37°Cで培養します。周皮細胞培地の代わりに完全なクラシック培地(10%FBSを含む)を使用して、上記の手順1.1.1〜1.1.4に従います。
      注意: P12より後のパッセージは使用しないでください。
   2. アストロサイトを含む組織培養6ウェルプレートと周皮細胞を含むウェルインサート(6ウェルフォーマット)を5%_CO2 インキュベーターから37°Cで取り出します。 組織培養6ウェルプレートからアストロサイト培地を吸引する。1 mLの周皮細胞培地と1 mLの星状細胞培地を各ウェルに加えます。
   3. ウェルインサートから周皮細胞培地を吸引し、播種したアストロサイトを含む組織培養6ウェルプレートに入れます。HBMECを2 mLの完全クラシック培地に300,000細胞/ウェルの密度で、同じウェルインサートの頂端側に播種します。
      注:内皮細胞は、ウェルインサートの腺側に周皮細胞を播種し、組織培養6ウェルプレートにアストロサイトを播種した後、翌日にウェルインサートの頂端側に播種する必要があります。細胞は、BBB様特性を誘導するために、3回培養で6日間維持する必要があります。細胞培養培地は、実験の24時間前に両方のウェルインサートコンパートメントで交換する必要があります。

2.酸素-グルコース欠乏の誘導

1. 細胞をDPBSで3回洗浄します。OGDに供するトリプルセル培養の場合は、グルコースフリー培地(L-グルタミンとフェノールレッドを含まない)を頂端コンパートメントと基底外側コンパートメントの両方に追加します。正常酸素コントロール細胞培養では、培養液を新しい培地と交換します。対照三重培養物を37°Cの5%_CO2 インキュベーターに入れる。
   注:OGDの誘導前またはOGD直後の培地の変化は、内皮細胞の単層にさらに影響を与える機械的ストレスを引き起こす可能性があります。したがって、培地交換を伴うステップは、正常酸素制御細胞培養のために含まれる。
2. 20 mLの滅菌水を含むペトリ皿を低酸素インキュベーターチャンバーに入れて、培養物の適切な加湿を提供します。リングクランプを解除してチャンバーを開きます。細胞培養物を棚に配置します。リングクランプを固定してチャンバーを密閉します。
3. チャンバーの入口ポートと出口ポートの両方を開きます。流量計の上部から来るチューブをチャンバーに取り付けます。流量計の底部から来るチューブを、エアフィルターを介して95%N₂/5%_CO2の混合ガスを含むガスタンクに取り付けます。 
4. タンク流量制御バルブを反時計回りに回して開き、ガスの流れを最小限に抑えます。時計回りに回して、圧力調整バルブをゆっくりと開きます。
5. チャンバーをガス混合物で20 L / minの流量で5分間洗い流します。チャンバーをガス源から外し、両方の白いプラスチッククランプをしっかりと閉じます。
6. 時計回りに回してタンク流量制御バルブをオフにします。反時計回りに回して圧力調整弁を閉じます。
7. 低酸素チャンバーを従来のインキュベーターに入れ、37°Cで4時間待ちます。
   注:その後の再酸素化期間を追加するには、細胞をDPBSで3回洗浄し、すべてのトリプルカルチャーで新鮮な培地を追加し、37°Cの5%_CO2 インキュベーターでさらに24時間保持します。 製造元の説明書によると、チャンバー内に残っている酸素濃度は、20 L / minで嫌気性ガス混合物で4分以上パージした後、0%になります。

3. TEER測定

1. 滅菌したTEER機器をバイオセーフティキャビネットに入れ、電極を上皮ボルトームメーターに差し込みます。電極を30 mLの70%イソプロピルアルコール溶液で最低30分間滅菌します。
2. TEER機器の電源を入れ、機能をオームに設定します。
3. 電極を70%イソプロピルアルコール溶液から取り外し、TEERデバイスのデジタル読み出しが 0オームを示すまで、20mLのDPBSに最低30分間入れます。
4. ブランクウェルインサートコントロールのウェルインサートハンガーの3つの開口部の1つから電極の長いプロングを挿入し、ウェルの底に触れるまで下げます。短いプロングがウェルインサートの下部にある頂端培養物の上に置かれていることを確認します。
   注:ブランクウェルインサートコントロールは、頂端コンパートメント内の2 mLの完全なクラシック培地と、基底外側コンパートメント内の1 mLの周皮細胞培地と1 mLの星状細胞培地の組み合わせで構成されています。TEER測定を行っている間、電極がウェルインサートに対して90°に保持されていることを確認します。同じウェルで得られた2つまたは3つの読み取り値の平均(開口部あたり)を使用すると、変動性を減らすのに役立ちます。
5. TEER機器のデジタル読み出し値が水平になるまで待ってから、値を記録してください。電極をDPBSに戻し、測定の合間に洗浄します。さらに2つのブランクウェルインサートコントロールのすべてのTEER測定値を引き続き収集します。
6. コントロール測定のために取られたステップ3.4-3.5を使用して、サンプルプレートのTEER測定値を収集します。すべての測定が完了したら、電極を70%イソプロピルアルコール溶液に30分間戻します。電極をTEER機器から外し、風乾させます。
7. TEER 値を計算します。式(1)を使用して、サンプルのオーム値からブランクウェルインサートコントロールの平均オーム値を減算し、この抵抗値にメンブレンインサートの面積(cm²)を掛けて、報告されたTEER値をΩ∙^cm2で求めます。
   (1)

4. BBB傍細胞透過性の評価

注意: FITC-デキストランを含むすべての手順を、ライトをオフにして細胞培養バイオセーフティキャビネットで実行します。FITCデキストラン溶液をアルミホイルで覆い、光退色を最小限に抑えます。

1. フェノールレッドフリー内皮細胞増殖培地を使用して、20および70 kDa(0.1 mg/mL)のFITCデキストランを含む溶液を調製し、揺動プラットフォームシェーカーで1時間攪拌します。0.22 μmシリンジフィルターを使用して溶液をろ過します。
2. 基底外側コンパートメントから培地を吸引し、トリプルセル培養BBBモデルで2 mLのフェノールレッドフリー内皮細胞増殖培地と交換します。頂端コンパートメント内の細胞をハンクス平衡塩溶液(HBSS)で2回洗浄します。
3. 先端コンパートメントに1 mLのFITCデキストラン溶液を加え、プレートをアルミホイルで覆います。プレートを5%_CO2 インキュベーターに入れ、37°Cで1時間入れます。
4. 基底外側コンパートメントから100 μLの培地を取り出し、黒色の96ウェルプレートに移します。励起波長と発光波長をそれぞれ480 nmと530 nmに設定してマイクロプレートリーダーを使用して蛍光を測定します。

5.生細胞における低酸素の検出

1. 200 μLのHBMEC、HA、およびHBVPを、ポリd-リジンコーティングされた35 mmガラスボトムディッシュの中央に150,000細胞/皿の密度で播種します。HBMECを播種する前に、皿の底に付着係数を塗ります。細胞を_CO2インキュベーター内で37°Cで一晩放置することにより、細胞をガラス表面に付着させます。
   注:OGD用の低酸素チャンバーにトリプルウェルインサートBBBモデルと同時にヒト初代細胞を含む皿を置くことが重要です。
2. コンフルエントに達したら、培養液を廃棄し、2 μLの1 mM Hoechst 33342(最終濃度0.2 μM)と0.5 μLの5 mMストック溶液を含む2 mLの予温したグルコースフリー培地(OGD用)または通常の培地(コントロール用)を追加します。OGD処理後、すべてのディッシュで培地をイメージングに最適化された培地と交換します。
3. 前述のように、GFPフィルターおよび最上段共焦点顕微鏡インキュベーターを用いて蛍光生細胞イメージングを行う^14、15。

結果

HBMECのバリア機能に対するアストロサイトと周皮細胞の影響を調べるために、細胞培養インサート上のトリプルセル培養BBBモデル(図1A)と、HBMEC単培養および2つの二重共培養モデルをコントロールとして構築しました(図1B)。二重共培養コントロールには、HBMECとHAの非接触共培養およびHBMECとHBVPの接触共培養が含まれていました。共培養で6日後、す?...

ディスカッション

このプロトコールでは、イン ビトロで虚血性脳卒中の設定におけるBBB機能障害を研究するための信頼性の高い三重内皮細胞・周皮・アストロサイト培養BBBモデルをセットアップする方法を記載する。周皮細胞が インビボで 内皮細胞の最も近い隣接であることを考慮すると、HBVPは、このモデル¹⁶においてウェルインサートの下側に播種されている。この配置は?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert	Corning	3450
35 mm Glass Bottom Dishes	MatTek Life Sciences (FISHERSCI)	P35GC-1.5-14-C
Astrocyte Medium	Science Cell	1801
Attachment Factor	Cell Systems (Fisher Scientific)	4Z0-201
BD 60 mL Syringe	BD	309653
BrainPhys Imaging Optimized Medium	STEMCELL Technologies	5791
Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost	4Z0-500	Cell Systems
Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap	VWR	430829
Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask	Corning	431464U
Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates	Corning	3340
Countes Cell Counting Chamber Slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
Countess II FL Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	ZGEXSCCOUNTESS2FL
Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution	Fisher Scientific	04-355-71
Disposable Petri Dishes	VWR	25384-088
DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red)	ThermoFisher	A14430-01	Glucose-free medium
DPBS (No Calcium, No Magnesium)	ThermoFisher	14190250
EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL	Lonza	CC-3129
EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes	World Precison Instruments	NC9792051	Epithelial voltohmmeter
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000)	Millipore Sigma	FD20-250MG
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000)	Millipore Sigma	FD70S-250MG
Fluorview FV3000 Confocal Microscope	Olympus	FV3000
Gas Tank (95% N2, 5% CO2)	Airgas	X02NI95C2003071
HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red)	Thermofisher	14025092
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher	H3570
Human Astrocytes	Science Cell	1800
Human Brain Vascular Pericytes	Science Cell	1200
Hypoxia Incubator Chamber	STEMCELL Technologies	27310
Image-iT Green Hypoxia Reagent	ThermoFisher	I14834
Pericyte Medium	Science Cell	1201
Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells	ACBRI 376	Cell Systems
Rocking Platform Shaker, Double	VWR	10860-658
Single Flow Meter	STEMCELL Technologies	27311
SpectraMax iD3 Microplate Reader	Molecular Devices	75886-128
Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile	NEST Scientific	380121
TPP Mutli-well Plates (6 wells)	MidSci	TP92406
TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks	MidSci	TP90075	Flasks with activated surface for cell adhesion
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFisher	25200056
UltraPure Distilled Water	Invitrogen (Life Technologies)	10977-015
Uno Stage Top Incubator-	Oko Lab	UNO-T-H-CO2-TTL