Un modèle de culture cellulaire primaire triple de la barrière hémato-encéphalique humaine pour l’étude de l’AVC ischémique in vitro

Résumé

Ici, nous décrivons la méthode pour établir un modèle de culture triple cellulaire de la barrière hémato-encéphalique basé sur les cellules endothéliales microvasculaires primaires du cerveau humain, les astrocytes et les péricytes. Ce modèle multicellulaire est adapté aux études de dysfonctionnement de l’unité neurovasculaire lors d’un AVC ischémique in vitro ou au criblage de candidats médicaments.

Résumé

L’AVC ischémique est une cause majeure de décès et d’invalidité dans le monde entier avec des options thérapeutiques limitées. La neuropathologie de l’AVC ischémique se caractérise par une interruption de l’apport sanguin au cerveau entraînant la mort cellulaire et un dysfonctionnement cognitif. Pendant et après un AVC ischémique, le dysfonctionnement de la barrière hémato-encéphalique (BHE) facilite la progression des blessures et contribue à une mauvaise récupération du patient. Les modèles actuels de BHE comprennent principalement des monocultures endothéliales et des co-cultures doubles avec des astrocytes ou des péricytes.

De tels modèles n’ont pas la capacité d’imiter pleinement un microenvironnement cérébral dynamique, ce qui est essentiel pour la communication de cellule à cellule. De plus, les modèles de BHE couramment utilisés contiennent souvent des cellules endothéliales humaines immortalisées ou des cultures cellulaires d’origine animale (rongeurs, porcins ou bovins) qui posent des limites translationnelles. Cet article décrit un nouveau modèle de BHE bien inséré contenant uniquement des cellules humaines primaires (cellules endothéliales microvasculaires cérébrales, astrocytes et péricytes vasculaires cérébraux) permettant d’étudier les lésions cérébrales ischémiques in vitro.

Les effets de la privation d’oxygène-glucose (OGD) sur l’intégrité de la barrière ont été évalués par perméabilité passive, mesures de résistance électrique transendothéliale (TEER) et visualisation directe des cellules hypoxiques. Le protocole présenté offre un avantage distinct en imitant l’environnement intercellulaire de la BHE in vivo, servant de modèle de BHE in vitro plus réaliste pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le cadre d’une lésion cérébrale ischémique.

Introduction

L’AVC est l’une des principales causes de décès et d’invalidité de longue durée dans le monde¹. L’incidence des accidents vasculaires cérébraux augmente rapidement avec l’âge, doublant tous les 10 ans après l’âge de 55 ans². L’AVC ischémique survient à la suite d’une perturbation du flux sanguin cérébral due à des événements thrombotiques et emboliques, qui englobe plus de 80% de tous les cas d’AVC³. Même maintenant, il existe relativement peu d’options de traitement disponibles pour minimiser la mort tissulaire après un AVC ischémique. Les traitements existants sont sensibles au facteur temps et, par conséquent, ne conduisent pas toujours à de bons résultats cliniques. Par conséquent, il est urgent de mener des recherches sur les mécanismes cellulaires complexes de l’AVC ischémique qui affectent la récupération après un AVC.

La BHE est une interface dynamique pour l’échange de molécules entre le sang et le parenchyme cérébral. Structurellement, la BHE est composée de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales interconnectées par des complexes jonctionnels entourés d’une membrane basale, de péricytes et d’extrémités astrocytaires⁴. Les péricytes et les astrocytes jouent un rôle essentiel dans le maintien de l’intégrité de la BHE par la sécrétion de divers facteurs nécessaires à la formation de jonctions fortes et serrées ^5,6. La dégradation de la BHE est l’une des caractéristiques de l’AVC ischémique. La réponse inflammatoire aiguë et le stress oxydatif associés à l’ischémie cérébrale entraînent la perturbation des complexes protéiques de jonction serrée et une diaphonie dérégulée entre les astrocytes, les péricytes et les cellules endothéliales, ce qui entraîne une augmentation de la perméabilité du soluté paracellulaire à travers la BHE⁷. Le dysfonctionnement de la BHE favorise davantage la formation d’œdème cérébral et augmente le risque de transformation hémorragique⁸. Compte tenu de tout ce qui précède, il y a un grand intérêt à comprendre les changements moléculaires et cellulaires qui se produisent au niveau de la BHE pendant et après un AVC ischémique.

Bien que de nombreux modèles de BHE in vitro aient été développés au cours des dernières décennies et utilisés dans diverses études, aucun d’entre eux ne peut reproduire pleinement les conditions in vivo ⁹. Alors que certains modèles sont basés sur des monocouches de cellules endothéliales cultivées sur des supports perméables bien insérés seuls ou en combinaison avec des péricytes ou des astrocytes, seules des études plus récentes ont introduit des modèles de culture triple cellulaire. Presque tous les modèles de BHE à triple culture existants incorporent des cellules endothéliales cérébrales primaires ainsi que des astrocytes et des péricytes isolés d’espèces animales ou des cellules dérivées de cellules souches pluripotentes humaines^10,11,12,13.

Reconnaissant la nécessité de mieux récapituler la BHE humaine in vitro, nous avons établi un modèle de culture de cellules triples in vitro composé de cellules endothéliales microvasculaires du cerveau humain (HBMEC), d’astrocytes humains primaires (HA) et de péricytes vasculaires cérébraux humains primaires (HBVP). Ce modèle BBB à triple culture est installé sur des plaquettes à 6 puits, des inserts de membrane en polyester avec une taille de pores de 0,4 μm. Ces inserts de puits fournissent un environnement optimal pour la fixation des cellules et permettent un accès facile aux compartiments apical (sang) et basolatéral (cerveau) pour un échantillonnage moyen ou une application composée. Les caractéristiques de ce modèle de triple culture de cellules BBB proposé sont évaluées en mesurant le TEER et le flux paracellulaire post-OGD imitant l’AVC ischémique in vitro, avec une pénurie d’oxygène (<1% O₂) et de nutriments (en utilisant un milieu sans glucose) obtenue en utilisant une chambre humidifiée et scellée. De plus, les conditions induites de type ischémique dans ce modèle sont vérifiées avec précision par visualisation directe des cellules hypoxiques.

Protocole

REMARQUE : Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur toutes les cellules, matériaux, équipements et solutions utilisés dans ce protocole.

1. Réglage du modèle BBB à triple culture cellulaire

1. Ensemencement des péricytes
   1. Cultiver le HBVP dans des flacons de culture T75 avec une surface activée pour l’adhésion cellulaire dans un incubateur à 5% de CO₂ à 37 °C jusqu’à confluent. Une fois la confluence atteinte, aspirer l’ancien milieu péricytaire et laver les cellules avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) chaude. Aspirer le DPBS et détacher les cellules du ballon en combinant 4 mL de solution tiède trypsine-EDTA et 1 mL de DPBS.
      REMARQUE: Évitez d’utiliser des passages postérieurs à P7.
   2. Incuber la fiole pendant 5 min à 37 °C dans un incubateur à CO₂ . Observez au microscope si les cellules sont détachées du ballon. Ajouter 5 mL de milieu péricytaire chaud (contenant 2 % de sérum fœtal bovin [FBS]) dans le ballon et transférer les cellules détachées dans un tube à centrifuger de 50 mL.
   3. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 3 min à 200 × g, permettant aux cellules de former une pastille dans le fond du tube. Aspirez le milieu du tube, en vous assurant que la pastille de la cellule reste intacte.
   4. Resuspendre la pastille cellulaire dans un milieu péricytaire; Calculer la quantité de milieu en fonction de la confluence des cellules et du nombre d’inserts de puits nécessaires. Prenez 10 μL des cellules en repos, placez-les dans une lame de comptage de cellules et comptez le nombre de cellules.
   5. Déterminer la densité cellulaire et ensemencer 300 000 cellules/insert dans 1 mL de milieu péricytaire sur le côté abluminal des inserts de puits (format 6 puits).
      REMARQUE: Lors de l’ensemencement de HBVP sur la face inférieure des inserts, il est très important de retourner d’abord les plaques bien insérées. Pendant que la plaque est posée à plat sur une surface, retirez la partie inférieure pour exposer le côté abluminal des inserts de puits. Après avoir ajouté la suspension de cellules péricytaires sur le côté aluminal, couvrir les inserts de puits avec la plaque retournée pour empêcher l’évaporation. Gardez toutes les plaques retournées dans un incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C pendant la nuit.
2. Ensemencement des astrocytes
   1. Cultiver l’HA dans des flacons T75 dans un incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C jusqu’à ce que la confluence soit atteinte. Suivez les étapes ci-dessus 1.1.1-1.1.4 en utilisant un milieu astrocytaire (contenant également 2% de FBS) au lieu du milieu péricytaire.
      REMARQUE : Évitez d’utiliser des passages postérieurs à P9.
   2. Déterminer la densité cellulaire et ensemencer 300 000 cellules/puits au fond des plaques de culture tissulaire à 6 puits. Couvrir la plaque pour éviter l’évaporation et conserver toutes les plaques dans un incubateur à 5% de CO₂ à 37 °C pendant la nuit.
3. Ensemencement des cellules endothéliales
   1. Cultiver l’HBMEC dans des boîtes de culture tissulaire dans un incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C jusqu’à confluence. Suivez les étapes ci-dessus 1.1.1-1.1.4 en utilisant un milieu classique complet (contenant 10% FBS) au lieu d’un milieu péricytaire.
      REMARQUE : Évitez d’utiliser des passages postérieurs à P12.
   2. Retirer les plaques de culture tissulaire à 6 puits contenant les astrocytes et les inserts de puits (format 6 puits) contenant les péricytes de l’incubateur à 5% de CO₂ à 37 °C. Aspirer le milieu astrocytaire des plaques de culture tissulaire à 6 puits. Ajouter 1 mL de milieu péricytaire et 1 mL de milieu astrocytaire à chaque puits.
   3. Aspirer le milieu péricytaire des inserts de puits et les placer dans les plaques de culture tissulaire à 6 puits contenant les astrocytes ensemencés. Ensemencer HBMEC à une densité de 300 000 cellules/puits dans 2 mL de milieu classique complet sur la face apicale des mêmes inserts de puits.
      NOTE: Les cellules endothéliales doivent être ensemencées du côté apical des inserts de puits le lendemain après l’ensemencement des péricytes du côté abluminal des inserts de puits et des astrocytes sur des plaques de culture tissulaire à 6 puits. Les cellules doivent être maintenues en triple culture pendant 6 jours pour induire des propriétés semblables à celles de la BHE. Le milieu de culture cellulaire doit être changé dans les deux compartiments bien insérés 24 heures avant les expériences.

2. Induction de la privation oxygène-glucose

1. Lavez les cellules 3x avec DPBS. Pour les cultures de cellules triples soumises à l’OGD, ajouter un milieu sans glucose (sans L-glutamine et rouge de phénol) aux compartiments apical et basolatéral. Remplacer le milieu de culture par un milieu frais dans des cultures cellulaires témoins normoxiques. Placer les cultures triples témoins dans l’incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C.
   REMARQUE : Les changements du milieu avant l’induction de l’OGD ou immédiatement après l’OGD peuvent créer un stress mécanique qui aurait un impact supplémentaire sur les monocouches de cellules endothéliales. Ainsi, les étapes avec remplacement du milieu sont incluses pour les cultures cellulaires témoins normoxiques.
2. Placez une boîte de Petri contenant 20 ml d’eau stérile dans la chambre de l’incubateur d’hypoxie pour assurer une humidification adéquate des cultures. Ouvrez la chambre en relâchant la pince annulaire. Disposez les cultures cellulaires sur les étagères. Scellez la chambre en fixant la pince annulaire.
3. Ouvrez les orifices d’entrée et de sortie de la chambre. Fixez le tube provenant du haut du débitmètre à la chambre. Fixer le tube provenant du bas du débitmètre au réservoir de gaz contenant le mélange gazeux de 95% N 2/5% CO₂ via un filtreà air. 
4. Ouvrez la vanne de régulation du débit du réservoir en la tournant dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour permettre un débit de gaz minimal. Ouvrez lentement la vanne du régulateur de pression en tournant dans le sens des aiguilles d’une montre.
5. Rincer la chambre avec le mélange gazeux à un débit de 20 L/min pendant 5 min. Déconnectez la chambre de la source de gaz et fermez fermement les deux pinces en plastique blanc.
6. Fermez la vanne de régulation du débit du réservoir en tournant dans le sens des aiguilles d’une montre. Fermez la vanne du régulateur de pression en tournant dans le sens inverse des aiguilles d’une montre.
7. Placer la chambre d’hypoxie dans un incubateur conventionnel à 37 °C pendant 4 h.
   NOTE: Pour ajouter la période de réoxygénation ultérieure, laver les cellules 3x avec DPBS, ajouter un milieu frais dans toutes les cultures triples et conserver pendant 24 heures supplémentaires dans l’incubateur à 5% de CO₂ à 37 ° C. Selon les instructions du fabricant, la concentration d’oxygène restant dans la chambre est de 0% après pas moins de 4 minutes de purge avec un mélange gazeux anaérobie à 20 L / min.

3. Mesures TEER

1. Placez l’instrument TEER stérilisé dans l’enceinte de biosécurité et branchez les électrodes dans le voltohmmètre épithélial. Stériliser les électrodes dans 30 mL de solution d’alcool isopropylique à 70 % pendant au moins 30 min.
2. Allumez l’instrument TEER et réglez la fonction sur ohms.
3. Retirez les électrodes de la solution d’alcool isopropylique à 70 % et placez-les dans 20 mL de DPBS pendant au moins 30 minutes jusqu’à ce que la lecture numérique sur l’appareil TEER indique 0 ohms.
4. Insérez la longue broche de l’électrode à travers l’une des trois ouvertures du cintre de puits de la commande d’insertion de puits vierge, en l’abaissant jusqu’à ce qu’elle touche le fond du puits. Assurez-vous que la broche courte repose au-dessus de la culture apicale au fond de l’insert de puits.
   REMARQUE : Le témoin de puits blanc est composé de 2 mL de milieu classique complet dans le compartiment apical et d’une combinaison de 1 mL de milieu péricytaire et de 1 mL de milieu astrocytaire dans le compartiment basolatéral. S’assurer que les électrodes sont maintenues à 90° par rapport à l’insert du puits pendant la prise de la mesure TEER. L’utilisation de la moyenne de deux ou trois lectures obtenues dans le même puits (par ouverture) peut aider à réduire la variabilité.
5. Attendez que les valeurs de lecture numérique sur l’instrument TEER se stabilisent avant d’enregistrer la valeur. Replacez les électrodes dans DPBS pour les laver entre les mesures. Continuer à collecter toutes les mesures TEER pour deux autres commandes d’insertion de puits vierges.
6. Recueillir les mesures TEER des plaques d’échantillonnage en utilisant les étapes 3.4 à 3.5 prises pour les mesures de contrôle. Une fois toutes les mesures prises, replacez l’électrode dans la solution d’alcool isopropylique à 70% pendant 30 min. Déconnectez les électrodes de l’instrument TEER et laissez-les sécher à l’air.
7. Calculez les valeurs TEER. Utilisez l’équation (1) pour soustraire la valeur moyenne en ohms du témoin d’insertion de puits blanc de la valeur en ohm de l’échantillon, puis multipliez cette valeur de résistance par la surface de l’insert membranaire (cm 2) pour obtenir la valeur TEER rapportée en Ω∙cm².
   (1)

4. Évaluation de la perméabilité paracellulaire de la BHE

REMARQUE: Effectuez toutes les étapes impliquant FITC-dextran dans une enceinte de biosécurité de culture cellulaire avec les lumières éteintes. Couvrir les solutions FITC-dextran avec du papier d’aluminium pour minimiser le photoblanchiment.

1. Préparer des solutions contenant des FITC-dextrans de 20 et 70 kDa (0,1 mg/mL) en utilisant un milieu de croissance des cellules endothéliales sans rouge de phénol et laisser agiter sur une plate-forme vibrante pendant 1 h. Filtrer les solutions à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 μm.
2. Aspirer le milieu du compartiment basolatéral et le remplacer par 2 mL de milieu de croissance des cellules endothéliales sans rouge phénol dans le modèle de culture triple cellulaire BBB. Lavez deux fois les cellules du compartiment apical avec la solution saline équilibrée de Hanks (HBSS).
3. Ajouter 1 mL de la solution FITC-dextran dans le compartiment apical et couvrir la plaque de papier d’aluminium. Placer la plaque dans un incubateur à 5% de CO₂ à 37 °C pendant 1 h.
4. Prélevez 100 μL de milieu dans les compartiments basolatéraux et transférez-les dans une plaque noire de 96 puits. Mesurer la fluorescence à l’aide d’un lecteur de microplaques avec les longueurs d’onde d’excitation et d’émission réglées sur 480 nm et 530 nm, respectivement.

5. Détection de l’hypoxie dans les cellules vivantes

1. Ensemencez 200 μL d’HBMEC, d’HA et de HBVP au centre de plats à fond en verre de 35 mm enrobés de poly-d-lysine à une densité de 150 000 cellules/plat. Avant d’ensemencer HBMEC, enduire le fond de la vaisselle avec le facteur d’attachement. Laisser les cellules se fixer à la surface du verre en les laissant toute la nuit à 37 °C dans un incubateur de CO₂.
   REMARQUE: Il est important de placer des plats avec des cellules primaires humaines en même temps avec un modèle de BHE à triple puits inséré dans une chambre d’hypoxie pour OGD.
2. Une fois la confluence atteinte, jeter le milieu de culture et ajouter 2 mL de milieu sans glucose préchauffé (pour les autres ministères) ou de milieu normal (pour les témoins) contenant 2 μL de 1 mM de Hoechst 33342 (concentration finale de 0,2 μM) et 0,5 μL de solution mère de 5 mM du réactif d’hypoxie verte Image-iT référencé (concentration finale de 1 μM). Après le traitement OGD, remplacer le milieu par un milieu optimisé pour l’imagerie dans tous les plats.
3. Effectuer l’imagerie de cellules vivantes en fluorescence avec le filtre GFP et l’incubateur de microscope confocale de stade supérieur comme décrit précédemment^14,15.

Résultats

Pour examiner les effets des astrocytes et des péricytes sur la fonction barrière de HBMEC, nous avons construit le modèle de culture triple cellule BBB sur des inserts de culture cellulaire (Figure 1A) avec la monoculture HBMEC et deux modèles de double co-culture comme témoins (Figure 1B). Les contrôles de co-culture double comprenaient une co-culture sans contact de HBMEC avec HA et une co-culture de contact de HBMEC avec HBVP. Après 6 jours en co-cult...

Discussion

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour mettre en place un modèle fiable de culture BBB à triple cellule endothéliale-péricyte-astrocyte pour étudier le dysfonctionnement de la BHE dans le cadre d’un AVC ischémique in vitro. Considérant que les péricytes sont les plus proches voisins des cellules endothéliales in vivo, les HBVP sont plaqués sur la face inférieure des inserts de puits dans ce modèle¹⁶. Bien que cette configuration n’ait pas la communic...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert	Corning	3450
35 mm Glass Bottom Dishes	MatTek Life Sciences (FISHERSCI)	P35GC-1.5-14-C
Astrocyte Medium	Science Cell	1801
Attachment Factor	Cell Systems (Fisher Scientific)	4Z0-201
BD 60 mL Syringe	BD	309653
BrainPhys Imaging Optimized Medium	STEMCELL Technologies	5791
Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost	4Z0-500	Cell Systems
Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap	VWR	430829
Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask	Corning	431464U
Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates	Corning	3340
Countes Cell Counting Chamber Slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
Countess II FL Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	ZGEXSCCOUNTESS2FL
Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution	Fisher Scientific	04-355-71
Disposable Petri Dishes	VWR	25384-088
DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red)	ThermoFisher	A14430-01	Glucose-free medium
DPBS (No Calcium, No Magnesium)	ThermoFisher	14190250
EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL	Lonza	CC-3129
EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes	World Precison Instruments	NC9792051	Epithelial voltohmmeter
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000)	Millipore Sigma	FD20-250MG
Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000)	Millipore Sigma	FD70S-250MG
Fluorview FV3000 Confocal Microscope	Olympus	FV3000
Gas Tank (95% N2, 5% CO2)	Airgas	X02NI95C2003071
HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red)	Thermofisher	14025092
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher	H3570
Human Astrocytes	Science Cell	1800
Human Brain Vascular Pericytes	Science Cell	1200
Hypoxia Incubator Chamber	STEMCELL Technologies	27310
Image-iT Green Hypoxia Reagent	ThermoFisher	I14834
Pericyte Medium	Science Cell	1201
Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells	ACBRI 376	Cell Systems
Rocking Platform Shaker, Double	VWR	10860-658
Single Flow Meter	STEMCELL Technologies	27311
SpectraMax iD3 Microplate Reader	Molecular Devices	75886-128
Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile	NEST Scientific	380121
TPP Mutli-well Plates (6 wells)	MidSci	TP92406
TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks	MidSci	TP90075	Flasks with activated surface for cell adhesion
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFisher	25200056
UltraPure Distilled Water	Invitrogen (Life Technologies)	10977-015
Uno Stage Top Incubator-	Oko Lab	UNO-T-H-CO2-TTL