העשרת תרביות נוירונים של גרעיני שורש גבי של עכבר בוגר על ידי אימונופנינג

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקול אימונופנינג עבור גרעיני שורש גביים של עכברים בוגרים. על ידי היצמדות נוגדנים לצלחות תרבית, אנו יכולים לבחור ולהסיר באופן שלילי תאים שאינם עצביים. אנו מראים כי התרביות מועשרות עבור תאי עצב באמצעות פרוטוקול זה, המאפשר מחקר מעמיק של תגובות עצביות למניפולציה.

Abstract

גרעיני שורש דורסלי (DRGs) הם מבנים היקפיים הסמוכים לקרן הגבית של חוט השדרה, המאחסנים את גופי התא של נוירונים חושיים, כמו גם סוגים שונים של תאים אחרים. פרוטוקולי תרבית שפורסמו מתייחסים לעתים קרובות לתרביות DRG מנותקות שלמות כנוירונים, למרות נוכחותם של פיברובלסטים, תאי שוואן, מקרופאגים ולימפוציטים. בעוד תרביות DRG שלמות אלה מספיקות ליישומי הדמיה שבהם ניתן להבחין בתאי עצב בהתבסס על מורפולוגיה או צביעה, הומוגנטים של חלבונים או RNA שנאספו מתרביות אלה אינם בעיקר עצביים במקורם. כאן, אנו מתארים רצף אימונופנינג עבור DRG עכברים בתרבית. מטרת שיטה זו היא להעשיר תרביות DRG עבור תאי עצב על ידי הסרת סוגי תאים אחרים. אימונופנינג מתייחס לשיטה להסרת סוגי תאים על ידי היצמדות נוגדנים לצלחות תרבית תאים. באמצעות הכלים האלה אנו יכולים לבחור באופן שלילי ולהפחית את מספר הפיברובלסטים, תאי מערכת החיסון ותאי השוואן בתרבית. שיטה זו מאפשרת לנו להגדיל את אחוז תאי העצב בתרביות.

Introduction

גרעיני השורש הגבי (DRGs) מאכלסים את גופי התאים של נוירוני החישה אשר מעצבבים רקמות היקפיות. חקר תאי העצב האלה מאפשר לנו להבין את היסודות המכניסטיים של כאב ותנאים חושיים. אולם DRGs אינם מורכבים מתאי עצב בלבד, אלא מכילים גם פיברובלסטים, תאי שוואן, מקרופאגים ותאי חיסון אחרים¹. למרות נוכחותם של סוגי תאים שונים אלה, תרביות DRG שלמות מכונות לעתים קרובות בספרות נוירונים ^2,3. תרביות אלה עדיין שימושיות לחקירה עצבית על ידי הדמיה או ציטומטריית זרימה, אשר תאפשר זיהוי עצבי על ידי צביעה, גודל התא ו / או מורפולוגיה. עם זאת, עבור בדיקות כגון תגובת שרשרת פולימראז (PCR) או כתם מערבי, שבו תרביות הומוגניות עבור RNA או איסוף חלבונים, נוכחות של סוגי תאים שאינם עצביים עלולה להפריע לתוצאות. לפיכך, יש צורך להגדיל את חלקם של תאים עצביים בתרביות DRG.

אימונופנינג היא טכניקה המשמשת לטיהור מגוון סוגי תאים, כולל נוירונים בקליפת המוח, אסטרוציטים, תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים ותאי מיקרוגליה. במילים פשוטות, הוא כרוך בהדבקת נוגדן כנגד סמן פני התא לצלוחית פטרי, שנועד לקשור תאים מסוימים (איור 1), וניתן להשתמש בו כדי לבחור בעד או נגד סוגי תאים בעלי עניין ^4,5,6. DRG עוברי חולדה אימונופנינג לבחירה כנגד תאים שאינם עצביים תואר בעבר על ידי Zuchero⁷. עם זאת, לא הצלחנו למצוא פרוטוקול אימונופנינג ספציפי ל- DRG של עכברים. בפרוטוקול הזה אנו מתבססים על הדיירים הבסיסיים של פרוטוקול Zuchero, אולם במקום זאת התאמנו את רצף האימונופנינג כדי להעשיר תרביות DRG של עכברים בוגרים (איור 2). זהו כלי רב עוצמה לחקר נוירונים חושיים מבוססים בתרבית. יש לו יתרון מכיוון שהוא מאפשר שימוש בעכברים בוגרים ממודלים גנטיים, מחלות ופציעות, כך שניתן יהיה לחקור את תאי העצב החושיים שלהם באופן ספציפי יותר.

פרוטוקול זה מועיל לקוראים המעוניינים להגדיל את שיעור תאי העצב בתרביות DRG של עכברים בוגרים. עם זאת, ניתן גם להשמיט את שלבי האימונופנינג, ופרוטוקול זה יכול לשמש גם עבור תרביות DRG שלמות.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו באישור הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת אלברטה (פרוטוקול 0000274).

1. הכנת מגיב

1. ליום הראשון, הכינו את הריאגנטים הבאים: מים בדרגת תרבית תאים; פולי-D-ליזין-להכין מלאי על ידי הרכבה מחדש של הבקבוק כולו ב 50 מ"ל של מים כיתה תרבית לריכוז מלאי של 100 מיקרוגרם / מ"ל, לאחסן ב 4 ° C, ולדלל את המלאי 1: 10 במים כיתה תרבית לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל; tris-HCl-להכין ציר על ידי המסת אבקת tris hydrochloride במים כיתה תרבית לריכוז מלאי של 500 mM (3.94 גרם ב 50 מ"ל), pH 9.5, לסנן לעקר (0.22 מיקרומטר), לאחסן ב 4 °C, ולדלל את המלאי 1:10 במים כיתה תרבית לריכוז סופי של 50 mMM; נוגדנים משניים (עז נגד חולדה, -ארנב ועכבר).
2. ליום השני, הכינו את הריאגנטים הבאים.
   1. הכינו תמיסת מלח מאוזנת ללא תרבית תאים Ca 2+, Mg²⁺ ללא האנק (HBSS; HBSS-/-), ומלח חוצץ D-פוספט בדרגת תרבית תאים (PBS) עם Ca 2+ ו-Mg²⁺. להכין aliquot מלאי למינין ולאחסן ב -80 °C מיד עם קבלתו; לדלל את המלאי HBSS סטרילי -/- לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל עבור מלאי עובד.
   2. הכינו מלאי אלבומין בסרום בקר 4% (BSA) על ידי המסת 400 מ"ג BSA ב-7.5 מ"ל של D-PBS (pH 7.4), הביאו את הנפח ל-10 מ"ל, סננו חיטוי (0.22 מיקרומטר), עלו ואחסנו בטמפרטורה של -20°C. הכן 0.2% BSA על ידי דילול 750 μL של 4% BSA ב 14.25 מ"ל של D-PBS.
   3. הכינו מלאי DNAse של 0.4% על ידי הוספת 1 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת של ארל (EBSS) לכל 12,500 יחידות DNAse, סננו עיקרו (0.22 מיקרומטר), עלו ואחסנו בטמפרטורה של -20°C. הכן מאגר גלילה רציפה (0.02% BSA) על-ידי הוספת 3 מ"ל של 0.2% BSA ו-100 μL של 0.4% DNAse ב-27 מ"ל של D-PBS. הכנת נוגדנים ראשוניים (CD45, PDGRFβ, O4).
      הערה: פרוטוקול זה משתמש ב- O4 hybridoma^8,9, עם זאת^, 10 מיקרוגרם של נוגדן O4 זמין מסחרית יהיה מתאים גם כן.
   4. הכינו את ציר הקולגנאז המשולב על ידי המסת בקבוק של קולגנאז משולב (50 מ"ג) ב-5 מ"ל של HBSS-/-, aliquot, ואחסנו בטמפרטורה של -20°C. הכינו מלאי עבודה לכל שני עכברים על ידי הוספת 500 μL של collagenase משולב מחומם ו-50 μL של 0.4% DNase מחומם ל-4.5 מ"ל של HBSS-/-.
   5. הכן ovomucoid נמוך על ידי הוספת 3 גרם של BSA ל 150 מ"ל של D-PBS, ולאחר מכן להוסיף 3 גרם של מעכב טריפסין ולערבב כדי להמיס. כוונן את ה- pH ל- 7.4 והבא את עוצמת הקול עד 200 מ"ל עם D-PBS. לסנן לעקר, להכין 1 מ"ל aliquots, ולאחסן ב -20 ° C. ביום הדיסקציה, שלב 1 מ"ל של ovomucoid נמוך ב 9 מ"ל של D-PBS לפתרון העבודה.
   6. הכינו 15% BSA על ידי המסת 7.5 גרם BSA ב-50 מ"ל HBSS-/- (הניחו על שייקר להתמוססות מלאה), סננו סטריליזציה ואחסנו בטמפרטורה של 4°C.
   7. להכין 50 מ"ל של מדיה נוירון על ידי הוספת 23.2 מ"ל של DMEM, 23.2 מ"ל של מדיום neurobasal, 500 μL של glutamax, 500 μL של pyruvate נתרן, 500 μL של פניצילין/סטרפטומיצין (aliquot מיד עם ההגעה לאחסן ב -20 ° C), 500 μL של אינסולין (5 מיקרוגרם / מ"ל סופי), 500 μL של SATO, 50 μL של N-אצטיל-L-ציסטאין (NAC; 5 מיקרוגרם / מ"ל סופי), ו-1,000 μL של B27+ (יש לאחסן מיד בטמפרטורה של -20°C עם קבלתו).
      1. הכינו את מלאי האינסולין על ידי המסה במים בדרגת תרבית לריכוז של 0.5 מ"ג/מ"ל (50 מ"ג ב-100 מ"ל), התאימו את ה-pH ל-7.4, סננו סטריליזציה (0.22 מיקרומטר), הכינו אליציטוטים של 500 מיקרוליטר ואחסנו בטמפרטורה של -20°C.
      2. הכן את מלאי SATO על ידי שילוב של 20 μL של פרוגסטרון (2.5 מ"ג ב 100 μL של אתנול), 800 μL של נתרן סלניט (4 מ"ג ב 10 מ"ל של מדיה neurobasal + 10 μL של 1 N NaOH), 800 מ"ג של BSA, 800 מ"ג של transferrin, 128 מ"ג של putrescine dihydrochloride, ו 80 מ"ל של neurobasal. מסננים לעקר (0.22 מיקרומטר), להכין 500 μL aliquots, ולאחסן ב -20 ° C. חיוני להכין פתרונות פרוגסטרון ונתרן סלניט טריים.
      3. הכן 50 μL של ציר N-אצטיל-L-ציסטאין (NAC) על ידי המסה בתווך נוירובזאלי לריכוז מלאי של 5 מ"ג / מ"ל (50 מ"ג ב -10 מ"ל), לעקר (0.22 מיקרומטר), aliquot, ולאחסן ב -20 ° C.
3. עבור יום 4 ו -5, הכינו את הריאגנטים הבאים.
   1. הכן חיץ פוספט 0.2 M (PB) על ידי המסת 21.8 גרם של נתרן פוספט dibasic (Na 2 HPO 4) ו8.34 גרם של נתרן פוספט monobasic dihydrate (NaH₂PO₄) ב 1,000 מ"ל של מים. יש לכוונן את רמת החומציות ל-7.4 ולאחסן בטמפרטורת החדר.
   2. הכינו 8% paraformaldehyde (PFA) כדלקמן: במכסה אדים, חם 50 מ"ל של מים ל 55 ° C, לכבות את החום, ולהוסיף 8 גרם של PRILLS PFA, תוך ערבוב מתמיד. מוסיפים 1 N NaOH טיפה עד שהתמיסה מתחילה להתנקות, ואז מוסיפים 40 מ"ל של 0.2 M PB, וממשיכים לערבב עד נקי. קררו את התמיסה לטמפרטורת החדר, התאימו את ה-pH ל-7.4 והביאו את עוצמת הקול ל-100 מ"ל עם PB של 0.2 M. יש לסנן ולאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.
   3. הכן D-PBS + Triton X-100 (PBS_TX) על ידי הוספת 0.2% Triton X-100 בדירוג תרבית D-PBS (1 מ"ל של Triton + 500 מ"ל של D-PBS). יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. הכינו תמיסת חסימה, שהיא 1% סרום חמור רגיל (NDS) ב- PBS_TX. מראש, 1 מ"ל של _{NDS + 9 מ"ל של PBSTX} ניתן להכין ולאחסן ב -20 °C ב 10 מ"ל aliquots.
   4. הכן תמיסת נוגדנים שהיא 0.2% NDS/0.2% BSA ב- PBS TX: 200 μL של NDS + 200 מ"ג BSA + 9.6 מ"ל של PBS_TX; ניתן להכין מראש ולאחסן ב -20 °C ב 10 מ"ל aliquots.

2. הגדרת ציוד

1. הגדר את הציוד הבא: ארון בטיחות ביולוגית בתרבית תאים סטרילית, סט מיקרופיפטה, פיפטות סרולוגיות ואקדח פיפטה, צלחות פטרי 10 ס"מ, צלחות תרבית תאים רצויות לציפוי (כאן, לוחות זכוכית שחורים 24 באר שימשו להדמיה), צינורות חרוטי 15 מ"ל ו -50 מ"ל, כלי דיסקציה (כלומר: מספריים קפיציים עדינים ללמינקטומיה וחיתוך עצבים, מלקחיים עדינים, וסכין גילוח), אמבט מים המוגדר ל 37 ° C, מסננת תאים 70 מיקרומטר, צנטריפוגה (10 דקות ב 300 x גרם) עם מתאמים עבור צינורות חרוטי 15 מ"ל, כחול טריפאן והמוציטומטר, מכסה אדים ופלטת ערבוב מגנטית.

3. שיטה ניסיונית

1. יום 1: הכנת מנות
   1. בארון בטיחות ביולוגית, צפו את משטח התרבית הרצוי בכמות מספקת של פולי-D-ליזין כדי לכסות את תחתית הבאר. יש לאחסן למשך הלילה ב-4°C. כאן, לוחות זכוכית תחתונים 24 באר שימשו להדמיה, ולכן 300 μL של poly-D-ליזין שימש.
   2. בארון בטיחות ביולוגית, הכינו את הכלים הפנורמיים: עבור צלחת CD45, להוסיף 10 מ"ל של תמיסת tris-HCl עובד ו 30 μL של IgG נגד חולדות עיזים לצלחת פטרי 10 ס"מ; עבור צלחת PDGFRβ, להוסיף 10 מ"ל של פתרון tris-HCl עובד ו 30 μL של עיזים נגד ארנב IgG צלחת פטרי 10 ס"מ; עבור צלחת O4 hybridoma, יש להוסיף 10 מ"ל של תמיסת tris-HCl עובדת ו-30 μL של IgG נגד עכבר עיזים לצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ. ודא שהתמיסה מכסה את כל שטח התבשיל והשאר ב -4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
2. יום 2: דיסקציה, טריטורציה ואימונופנינג
   1. שאפו את הפולי-D-ליזין, שטפו את הצלחות שלוש פעמים במי תרבית רקמות, הטו את המכסה פתוח ואפשרו למשטח להתייבש לחלוטין בארון בטיחות ביולוגית. החל מספיק למינין על הצלחות כדי לצפות את החלק התחתון של כל באר, ומניחים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס. עבור צלחות 24 באר, 200 μL מספיק.
   2. מסיימים להכין את הכלים הגלילה. לשטוף כל צלחת עם D-PBS ולדגור עם 10 מיקרוגרם של נוגדן ראשוני. אפשר לשבת בטמפרטורת החדר לפחות שעתיים.
   3. עבור צלחת CD45, להוסיף 5 מ"ל של 0.2% BSA ו 20 μL של CD45 ראשוני; עבור צלחת PDGFRβ, להוסיף 5 מ"ל של 0.2% BSA ו 15.4 μL של PDGFRβ; עבור צלחת O4, הוסף 3 מ"ל של 0.2% BSA, 2 מ"ל של O4 hybridoma, ועוד 100 μL של 4% BSA (כדי להבטיח את ריכוז BSA הסופי נשאר על 0.2%).
   4. הרדימו עכבר אחד עד ארבעה באמצעות 0.1 מ"ל/ק"ג נתרן פנטוברביטול (לכל צלחת אימונופנינג בקוטר 10 ס"מ). השתמשנו בעכברי C57BL/6 בגיל 8-10 שבועות. שני המינים שימשו ותורבתו בנפרד זה מזה. לערבב את החיה עם 30 מ"ל של קר 0.9% מלוחים.
   5. הצמד את הכפות הקדמיות והאחוריות לשלב קלקר והשתמש בסכין גילוח נקי כדי לחשוף את עמוד השדרה מאחור. בצע כריתת למינקטומיה על ידי ביצוע חתכים בעומק של כמחצית הדרך משני צדי עמוד השדרה הגבי, הסרת החצי הגבי של העמודה, כדי לחשוף את חוט השדרה. או לחתוך בעדינות את העצבים ולהסיר את חוט השדרה, או בעדינות לדחוף את החוט הצידה, שמירה על שלמות העצבים.
   6. השתמש בשורשי עצב עמוד השדרה (קטועים או מחוברים לחוט השדרה) כדי למצוא ולהסיר את כל ה- DRGs משני צדי עמוד השדרה. חתוך את פסולת העצבים מכל DRG כאשר הוא מוסר (יותר פסולת עצבית בתרבית עלולה להוביל להישרדות נמוכה בתרבית). אסוף את DRGs ב 15 מ"ל של HBSS-/- בצינור חרוטי 15 מ"ל על קרח.
      הערה: שים לב שהרקמה מנותחת באוויר הפתוח, אך ברגע שמוסיפים את ה- DRG לצינור יש להתייחס אליהם כסטריליים ולטפל בהם רק בארון בטיחות ביולוגית.
   7. הניחו מלאי קפוא של stemxyme 1 ו-0.4% DNAse באמבט מים, כ-30 דקות לפני סיום הנתיחות (בערך בעת הפעלת העכבר האחרון). אפשר להם לשקוע לתחתית הצינור החרוטי, ולאחר מכן להמשיך את הפרוטוקול בארון בטיחות ביולוגית.
   8. שאפו את רוב HBSS-/- מה- DRGs. השתמשו בפיפטה במקום בשאיבה כדי לקבל <1 מ"ל נוזל, והשאירו ~ 100 μL נוזל כדי לא להסתכן באיבוד רקמות.
   9. יש לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל HBSS-/-. הוסף 5 מ"ל של פתרון stemxyme עובד לרקמה. מכסים את המכסה בסרט שקוף וצפים את הצינור על צדו באמבט מים המוגדר ל -37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
   10. לאחר הדגירה באנזים, הוסף 1 מ"ל של תמיסת מעכבי אובו נמוכה לצינור. שלשו את התאים בעדינות עם פיפטה p1000 10-15 פעמים. הניחו לגושי הרקמה לשקוע.
   11. העבר את 2-3 מ"ל העליון של תמיסה (המכילה תאים מנותקים) לתמיסת אובומוקואיד נמוכה טרייה. חזור על הפעולה עד שהרקמה מנותקת לחלוטין ולא נשארים גושים נראים לעין.
   12. צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 300 x גרם בטמפרטורת החדר. סיפון את supernatant שוב, באמצעות פיפטה במקום יניקה עבור 1 מ"ל האחרון, משאיר ~ 100 μL, ו resuspend את גלולת התא ב 1 מ"ל של חיץ גלילה.
   13. פיפטה עדינה לערבוב. הרטיבו מראש מסננת תאים של 70 מיקרומטר עם 1 מ"ל של חיץ גלילה מעל צינור חרוטי של 50 מ"ל. סנן את תמיסת התא דרך מסננת התא.
   14. לשטוף את הצינור עם 1 מ"ל של חיץ panning, ולאחר מכן לעבור דרך מסננת (3 מ"ל של תסנין). הניחו את תרחיף התא בעדינות (1 מ"ל בכל פעם) על גבי 2 מ"ל של כרית BSA 15% כדי להסיר פסולת מיאלין. כרית של 2 מ"ל יעילה לשני עכברים, ו-3 מ"ל יעילה לארבעה עכברים.
       1. לשכבות, הניחו את 2 מ"ל BSA בצינור, סגרו וציפו בעדינות את דפנות הצינור ב-BSA. לאחר מכן, שכב בעדינות את תרחיף התא של החלק העליון, על ידי pipeting על הצד של הצינור.
   15. צנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב 300 x גרם במשך 10 דקות (האצה והאטה). השתמש פיפטה P1000 כדי להסיר את הנוזל הצלול על גבי, את שלב המיאלין שביניהם, ואת BSA, 1 מ"ל בכל פעם (שינוי קצוות בין כל מ"ל). השאר ~ 100 μL של BSA כדי לא להפריע את הכדור.
   16. הוסף 5 מ"ל של חיץ גלילה ודגר את הצינור ב 37 ° C, 10% CO₂ אינקובטור במשך 30-45 דקות. זה מאפשר שליפת אנטיגן. הקפד לשחרר את המכסה כדי לאפשר החלפת גז.
   17. שטפו את צלחת CD45 שלוש פעמים עם D-PBS. יוצקים את השטיפה הסופית. דקרו את תרחיף התא לתוך צלחת CD45.
   18. לדגור על התאים על צלחת CD45 במשך סך של 20 דקות בטמפרטורת החדר, מערבלים בעדינות בנקודה 10 דקות כדי לאפשר לתאים גישה שווה לנוגדן.
   19. שטפו את תבנית PDGFRβ שלוש פעמים עם D-PBS ושפכו את השטיפה הסופית. העבר את התאים הלא מאוגדים מצלחת CD45 לצלחת PDGFRβ.
   20. נערו בעדינות את צלחת CD45 והעמידו אותה בזווית. פיפטה עדינה 1 מ"ל של התא השעיה מעל צלחת לאסוף תאים לא קשורים. דקקו אותו לתוך צלחת PDGFRβ ופיפטה כדי להעביר את תרחיף התא הנותר לצלחת PDGFRβ.
   21. יש לדגור על צלחת PDGFRβ למשך 20 דקות בסך הכל בטמפרטורת החדר, תוך ערבול עדין בנקודה של 10 דקות כדי לאפשר לתאים גישה שווה לנוגדן.
   22. שטפו את צלחת O4 שלוש פעמים עם D-PBS ושפכו את השטיפה הסופית. העבר את התאים הלא מאוגדים מצלחת PDGFRβ לצלחת O4 באותה שיטה כמו בשלב 3.2.19. יש לדגור על צלחת O4 למשך 20 דקות בסך הכל בטמפרטורת החדר, תוך ערבול עדין בנקודת 10 הדקות כדי לאפשר לתאים גישה שווה לנוגדן.
   23. העבר את מתלה התא לצינור חרוטי 15 מ"ל וצנטריפוגה למשך 10 דקות ב 300 x גרם. השהה מחדש את התאים בנפח הרצוי, ודלל 1:1 עם כחול טריפאן לקיום התא. לספור תאים בינוניים עד גדולים עם המוציטומטר (זה יאפשר את הייצוג הטוב ביותר של מספר נוירונים בתרבית).
   24. מוציאים את הלמינין ולוחצים את התאים בצפיפות הרצויה. אין לאפשר לצלחת להתייבש בין הסרת למינין וציפוי, ומוסיפים את התאים מיד.
   25. תרממו את התאים המכומתים להעשרה עצבית (איור 3) עם 500 תאי עצב ב-25 מיקרוליטר של תווך תרבית (המתואר ב-1.2.7) לכל באר בצלחות של 24 בארות ודגרו בטמפרטורה של 37°C במשך 30 דקות. להציף את הבארות לנפח סופי של 500 μL.
3. יום 4: קיבוע אימונוציטוכימיה (ICC), חסימה וראשוניות
   1. לאחר 48 שעות של גידול, הוסף 500 μL / באר (או נפח שווה ערך למדיה בבאר) של 8% PFA במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי לתקן את התאים. אם רוצים ניתוח מדיה, אפשר לתקן עם 4% PFA ישירות. עם זאת, לא בדקנו זאת.
   2. לשטוף את התאים עם D-PBS שלוש פעמים. שימו לב, שמרנו את התאים האלה בתרבית ללא שינוי מדיה למשך 72 שעות לכל היותר, אך אנו משערים שהם יוכלו לשרוד זמן רב יותר, במיוחד אם המדיה תשרוד למחצה.
   3. הסר את השטיפה הסופית והוסף מספיק פתרון חסימה לכל באר כדי לכסות את התאים לחלוטין. חוסמים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הפתרון החוסם והוסף נוגדן ראשוני בתמיסת נוגדנים: β3-tubulin בדילול של 1:1,000. אוטמים את הצלחת בסרט שקוף ודגרים למשך הלילה ב-4°C.
      הערה: אפשר לשקול צביעה עם PDGFRβ עבור היעדר פיברובלסטים, CD45 עבור היעדר תאים חיסוניים, P0 או PMP22 עבור היעדר מיאלין, או fabp7 עבור גליה בלוויין.
4. יום 5: בית הדין המשני
   1. לשטוף את התאים עם D-PBS שלוש פעמים. מוציאים את השטיפה הסופית ומוסיפים נוגדנים משניים בתמיסת נוגדנים: אנטי ארנב 488 בדילול 1:500 ו- DAPI בדילול 1:2,000. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.
   2. יש לשטוף עם D-PBS שלוש פעמים. הוסף מספיק D-PBS כדי לכסות את תחתית הבאר, ותמונה. ניתן לאטום את הצלחת בסרט שקוף, להגן עליה מפני אור ולאחסן אותה בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.

תוצאות

התאים הקבועים המוכתמים ב- DAPI וב- β3-tubulin צולמו לאחר מכן באמצעות מערכת סינון קונפוקלית בעלת תוכן גבוה. התמונות נותחו באמצעות תוכנה מסחרית מתאימה כדי לקבוע את אחוז התאים החיוביים ל-DAPI שתויגו יחד עם β3-tubulin (איור 3). בתרביות DRG שלמות נמצאו 42.36% ± 6.4% צביעת β3-טובולין, ובתרביות DRG אימונ...

Discussion

פרוטוקול אימונופנינג זה מגדיל את שיעור התאים העצביים בתרביות ראשוניות של DRG. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, דיסקציות צריך להיעשות במועד, DRGs צריך להיות גזוז של עצבים עודפים. שלב הדיסוציאציה צריך להיות מנוטר בקפידה, ולא יעלה על 1 שעות, כדי למנוע את התאים מתח מיותר. לגבי האימונופנינג באופן ספציפי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 um Syringe filters	Fisher	723-2520
100 mm petri dishes	ThermoFisher	FB0875712
24 well black glass-bottom plates	Cellvis	P24-1.5H-N
70 um cell strainer	Cedarlane	15-1070-1(BI)
B27+ supplement	Gibco	A3582801
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A7906	for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction ≥98%)
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A4161	for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, ≥99%)
CD45 antibody	BD Pharmigen	550539
DAPI	Invitrogen	D1306
DMEM	Gibco	11960069
DNAse	Worthington	LS002007	for stemxyme solution and panning buffer
D-PBS	Sigma Aldrich	D8662
EBSS	Sigma Aldrich	E6267	for DNAse solution
Filter paper P8 grade	ThermoFisher	09-795K	for 8% PFA
Glutamax	ThermoFisher	35050061
goat-anti-mouse IgG	Jackson Immunoresearch	115-005-020	for O4 dish
goat-anti-rabbit 488	Invitrogen	A11008
goat-anti-rabbit IgG	Jackson Immunoresearch	115-005-003	for PDGFRB dish
goat-anti-rat IgG	Jackson Immunoresearch	115-005-044	for CD45 dish
HBSS -/-	Sigma Aldrich	14175145
Insulin	Sigma Aldrich	I2643
laminin	Invitrogen	23017-015
N-acetyl cysteine	Sigma Aldrich	A8199
Neurobasal	Gibco	21103049
Normal Donkey Serum	Sigma-Aldrich	D9663
O4 antibody	n/a	n/a	Hybridoma
Ovomucoid trypsin inhibitor	Cedarlane	LS003086	for low ovo
paraformaldehyde prills	Sigma Aldrich	441244	for 8% PFA
PDGFRB antibody	Abcam	AB32570
penicillin/ streptomycin	Gibco	15140-122
Poly-D-Lysine	Sigma Aldrich	P6407
Progesterone	Sigma Aldrich	P8783	for SATO
Putrescine dihydrochrloride	Sigma Aldrich	P5780	for SATO
Sodium phosphate dibasic	Fisher	S374-1	for 0.2 M PB
Sodium Phosphate monobasic dihydrate	Sigma Aldrich	04269	for 0.2 M PB
Sodium Pyruvate	ThermoFisher	11360070
Sodium Selenite	Sigma Aldrich	S5261	for SATO
Stemxyme I	Cedarlane	LS004107	for tissue dissociation; combination collagenase
Transferrin	Sigma Aldrich	T1147	for SATO
Tris-HCl	Millipore Sigma	T5941
trypan blue	Gibco	15250-061
β3-Tubulin	Sigma-Aldrich	T2200