Wzbogacanie kultur neuronów zwojów zwojów korzenia grzbietowego dorosłych myszy za pomocą immunopanningu

Summary

Ten artykuł opisuje protokół immunopaningu dla zwojów korzenia grzbietowego dorosłej myszy. Przylegając przeciwciała do płytek hodowlanych, możemy negatywnie selekcjonować i usuwać komórki nieneuronalne. Pokazujemy, że kultury są wzbogacone o neurony przy użyciu tego protokołu, co pozwala na dogłębne badanie reakcji neuronów na manipulację.

Abstract

Zwoje korzenia grzbietowego (DRG) to struktury obwodowe przylegające do grzbietowego rogu rdzenia kręgowego, w których znajdują się ciała komórkowe neuronów czuciowych, jak również różne inne typy komórek. Opublikowane protokoły hodowli często odnoszą się do całych zdysocjowanych kultur DRG jako neuronalnych, pomimo obecności fibroblastów, komórek Schwanna, makrofagów i limfocytów. Podczas gdy te całe kultury DRG są wystarczające do zastosowań obrazowych, w których neurony można rozpoznać na podstawie morfologii lub barwienia, homogenaty białek lub RNA zebrane z tych kultur nie są pierwotnie pochodzenia neuronalnego. Tutaj opisujemy sekwencję immunosanitarną dla hodowanych mysich DRG. Celem tej metody jest wzbogacenie kultur DRG dla neuronów poprzez usunięcie innych typów komórek. Immunopanning odnosi się do metody usuwania typów komórek poprzez przyleganie przeciwciał do szalek z kulturą komórkową. Korzystając z tych szalek, możemy negatywnie selekcjonować i zmniejszać liczbę fibroblastów, komórek odpornościowych i komórek Schwanna w hodowli. Ta metoda pozwala nam zwiększyć odsetek neuronów w kulturach.

Introduction

Zwoje korzenia grzbietowego (DRG) mieszczą ciała komórkowe neuronów czuciowych, które unerwiają tkanki obwodowe. Badanie tych neuronów pozwala nam zrozumieć mechanistyczne podstawy bólu i stanów czuciowych. Jednak DRG nie składają się z samych neuronów, ale zawierają również fibroblasty, komórki Schwanna, makrofagi i inne komórki odpornościowe¹. Pomimo obecności tych różnych typów komórek, całe kultury DRG są często określane w literaturze jako neuronalal^2,3. Kultury te są nadal przydatne do badania neuronów za pomocą obrazowania lub cytometrii przepływowej, co pozwoliłoby na identyfikację neuronów na podstawie barwienia, wielkości komórki i/lub morfologii. Jednak w przypadku testów, takich jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) lub western blotting, w których hodowle są homogenizowane w celu zebrania RNA lub białka, obecność nieneuronalnych typów komórek może zakłócać wyniki. W związku z tym istnieje potrzeba zwiększenia udziału komórek nerwowych w hodowlach DRG.

Immunopanning to technika używana do oczyszczania różnych typów komórek, w tym neuronów korowych, astrocytów, komórek prekursorowych oligodendrocytów i mikrogleju. Mówiąc prościej, polega na przyklejeniu przeciwciała przeciwko markerowi powierzchni komórki do szalki Petriego, przeznaczonej do wiązania określonych komórek (Rysunek 1) i może być używana do wybierania za lub przeciw typom komórek będących przedmiotem zainteresowania^4,5,6. Immunopanujące embrionalne DRG szczurów w celu selekcji komórek nieneuronalnych zostały wcześniej opisane przez Zuchero⁷. Nie udało nam się jednak znaleźć protokołu immunopanningu specyficznego dla mysich DRG. W tym protokole opieramy się na podstawowych lokatorach protokołu Zuchero, ale zamiast tego dostosowaliśmy sekwencję immunopanningu, aby wzbogacić hodowle DRG dorosłych myszy (Rysunek 2). Jest to potężne narzędzie do badania ustalonych neuronów czuciowych w kulturze. Jest to korzystne, ponieważ pozwala na wykorzystanie dorosłych myszy z modeli genetycznych, chorobowych i urazowych, dzięki czemu ich neurony czuciowe mogą być badane z większą szczegółowością.

Ten protokół jest korzystny dla czytelników chcących zwiększyć udział neuronów w hodowlach DRG dorosłych myszy. Można jednak również pominąć etapy immunopanningu, a protokół ten można również stosować do całych kultur DRG.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Alberty (protokół 0000274).

1. Przygotowanie odczynnika

1. Na dzień 1 należy przygotować następujące odczynniki: woda klasy do hodowli komórkowych; poli-D-lizyna – przygotować bulion, rozpuszczając całą butelkę w 50 ml wody klasy hodowlanej do stężenia podstawowego 100 μg/ml, przechowywać w temperaturze 4 °C i rozcieńczyć podstawowy stosunek 1:10 w wodzie o czystości hodowlanej do końcowego stężenia 10 μg/ml; tris-HCl – przygotować bulion przez rozpuszczenie sproszkowanego chlorowodorku tris w wodzie o jakości hodowlanej do stężenia podstawowego 500 mM (3,94 g w 50 ml), pH 9,5, sterylizować filtrem (0,22 μm), przechowywać w temperaturze 4 °C i rozcieńczyć wywar w stosunku 1:10 w wodzie o jakości hodowlanej do końcowego stężenia 50 mM; przeciwciała drugorzędowe (koza anty-szczur, -królik i -mysz).
2. Na dzień 2 przygotuj następujące odczynniki.
   1. Przygotować zbilansowany roztwór soli Hanka o klasie Ca²⁺, Mg²⁺ wolny od kultur komórkowych (HBSS; HBSS-/-) oraz sól fizjologiczna buforowana D-fosforanem klasy hodowli komórkowej (PBS) z Ca²⁺ i Mg²⁺. Przygotować porcję wywaru z lamininą i przechowywać w temperaturze -80 °C natychmiast po otrzymaniu; rozcieńczyć materiał w sterylnym HBSS-/- do końcowego stężenia 10 μg/ml dla materiału roboczego.
   2. Przygotować 4% bulion z albuminy surowicy bydlęcej (BSA) rozpuszczając 400 mg BSA w 7,5 ml D-PBS (pH 7,4), doprowadzić objętość do 10 ml, wysterylizować filtrem (0,22 μm), podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przygotować 0,2% BSA, rozcieńczając 750 μl 4% BSA w 14,25 ml D-PBS.
   3. Przygotować 0,4% wywaru DNAzy, dodając 1 ml zbilansowanego roztworu soli Earle'a (EBSS) na 12 500 jednostek DNAse, wysterylizować filtrem (0,22 μm), podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przygotować bufor do płukania (0,02% BSA), dodając 3 ml 0,2% BSA i 100 μl 0,4% DNAzy w 27 ml D-PBS. Przygotować przeciwciała pierwszorzędowe (CD45, PDGRFβ, O4).
      UWAGA: Ten protokół wykorzystuje hybrydomę O4 < sup class="xref">8^,9, jednak 10 μg komercyjnie dostępnego przeciwciała O4 byłoby również odpowiednie.
   4. Przygotować wywar z kolagenazy złożonej, rozpuszczając butelkę kolagenazy złożonej (50 mg) w 5 ml HBSS-/-, podwielokrotności, i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przygotować zapas roboczy na dwie myszy, dodając 500 μl podgrzanej kolagenazy złożonej i 50 μl podgrzanej 0,4% DNazy do 4,5 ml HBSS-/-.
   5. Przygotować low ovomukoid, dodając 3 g BSA do 150 ml D-PBS, następnie dodać 3 g inhibitora trypsyny i wymieszać do rozpuszczenia. Dostosuj pH do 7,4 i zwiększ objętość do 200 ml za pomocą D-PBS. Przefiltrować, wysterylizować, przygotować 1 ml porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C. W dniu rozbioru połączyć 1 ml nisko umieszczonego owomukoidu w 9 ml D-PBS w roztworze roboczym.
   6. Przygotować 15% BSA, rozpuszczając 7,5 g BSA w 50 ml HBSS-/- (umieścić na shakerze do całkowitego rozpuszczenia), przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   7. Przygotować 50 ml pożywki neuronalnej, dodając 23,2 ml DMEM, 23,2 ml pożywki neurobazalnej, 500 μl glutamaxu, 500 μl pirogronianu sodu, 500 μl penicyliny/streptomycyny (podwielokrotność natychmiast po przybyciu i przechowywać w temperaturze -20 °C), 500 μl insuliny (5 μg/ml ostatecznie), 500 μl SATO, 50 μl N-acetylo-L-cysteiny (NAC; 5 μg/ml final) i 1 000 μl witaminy B27+ (natychmiast podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C po otrzymaniu).
      1. Przygotować wywar insuliny, rozpuszczając się w wodzie o czystości hodowlanej do stężenia 0,5 mg/ml (50 mg w 100 ml), dostosować pH do 7,4, wysterylizować filtrem (0,22 μm), przygotować 500 μl podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -20 °C.
      2. Przygotuj wywar SATO, łącząc 20 μl progesteronu (2,5 mg w 100 μl etanolu), 800 μl seleninu sodu (4 mg w 10 ml podłoża neurobazalnego + 10 μl 1 N NaOH), 800 mg BSA, 800 mg transferyny, 128 mg dichlorowodorku putrescyny i 80 ml neurobazalu. Filtrować sterylizować (0,22 μm), przygotować 500 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C. Niezbędne jest przygotowanie świeżych roztworów progesteronu i seleninu sodu.
      3. Przygotować 50 μl wywaru N-acetylo-L-cysteiny (NAC), rozpuszczając w podłożu neurobazalnym do stężenia podstawowego 5 mg/ml (50 mg w 10 ml), wysterylizować filtrem (0,22 μm), podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C.
3. Na dzień 4 i 5 przygotuj następujące odczynniki.
   1. Przygotować 0,2 M bufor fosforanowy (PB) rozpuszczając 21,8 g dwuzasadowego fosforanu sodu (Na₂HPO₄) i 8,34 g jednozasadowego fosforanu sodu dwuwodnego (NaH₂PO₄) w 1 000 ml wody. Dostosuj pH do 7,4 i przechowuj w temperaturze pokojowej.
   2. Przygotować 8% paraformaldehyd (PFA) w następujący sposób: w dygestorium podgrzać 50 ml wody do 55 °C, wyłączyć ogień i dodać 8 g granulek PFA, ciągle mieszając. Dodawać kroplami 1 N NaOH, aż roztwór zacznie klarować się, następnie dodać 40 ml 0,2 M PB i kontynuować mieszanie, aż będzie klarowny. Schłodzić roztwór do temperatury pokojowej, dostosować pH do 7,4 i zwiększyć objętość do 100 ml za pomocą 0,2 M PB. Przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
   3. Przygotować D-PBS + Triton X-100 (PBS_TX), dodając 0,2% Triton X-100 do klasy hodowlanej D-PBS (1 ml Triton + 500 ml D-PBS). Przechowywać w temperaturze 4 °C. Przygotować roztwór blokujący, który stanowi 1% normalnej surowicy osła (NDS) w PBS_{TX. Z wyprzedzeniem można przygotować i przechowywać 1 ml NDS + 9 ml PBSTX} w temperaturze -20 °C w podwielokrotnościach po 10 ml.
   4. Przygotować roztwór przeciwciał o stężeniu 0,2% NDS/0,2% BSA w PBS_TX: 200 μl NDS + 200 mg BSA + 9,6 ml PBS_TX; może być przygotowany z wyprzedzeniem i przechowywany w temperaturze -20 °C w podwielokrotnościach 10 ml.

2. Konfiguracja sprzętu

1. Przygotuj następujący sprzęt: sterylną szafkę bezpieczeństwa biologicznego do hodowli komórkowych, zestaw mikropipet, pipety serologiczne i pistolet do pipet, 10 cm szalki Petriego, pożądane szalki do hodowli komórkowych do posiewu (w tym przypadku do obrazowania użyto 24-dołkowych czarnych płytek ze szklanym dnem), stożkowe probówki o pojemności 15 ml i 50 ml, narzędzia do preparowania (mianowicie: cienkie nożyczki sprężynowe do laminektomii i przycinania nerwów, cienkie kleszcze, i żyletka), łaźnia wodna ustawiona na 37 °C, sitko do komórek 70 μm, wirówka (10 min przy 300 x g) z adapterami do probówek stożkowych 15 ml, błękit trypanowy i hemocytometr, wyciąg i magnetyczna płyta grzejna do mieszania.

3. Metoda eksperymentalna

1. Dzień 1: przygotowanie potraw
   1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego pokryj żądaną powierzchnię hodowli wystarczającą ilością poli-D-lizyny, aby pokryć dno studzienki. Przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C. W tym przypadku do obrazowania użyto 24-dołkowych płytek ze szklanym dnem, a więc użyto 300 μl poli-D-lizyny.
   2. W komorze bezpieczeństwa biologicznego przygotuj naczynia do garnkowania: na szalkę CD45 dodaj 10 ml roboczego roztworu tris-HCl i 30 μl koziej antyszczurzej IgG na 10 cm szalkę Petriego; na szalkę PDGFRβ dodaj 10 ml roboczego roztworu tris-HCl i 30 μl koziej anty-króliczej IgG na 10 cm szalkę Petriego; na szalkę O4 hybridoma, dodać 10 ml roboczego roztworu tris-HCl i 30 μl koziej anty-mysiej IgG na 10 cm szalkę Petriego. Upewnij się, że roztwór pokrywa całą powierzchnię naczynia i pozostaw na noc w temperaturze 4 °C.
2. Dzień 2: rozwarstwienie, rozwarstwienie i immunopaning
   1. Odessać poli-D-lizynę, umyć płytki trzykrotnie wodą z hodowli tkankowych, uchylić pokrywę i pozostawić powierzchnię do całkowitego wyschnięcia w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Nanieść wystarczającą ilość lamininy na płytki, aby pokryć dno każdej studzienki i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C. W przypadku płytek 24-dołkowych wystarczy 200 μl.
   2. Zakończ przygotowywanie potraw do smażenia. Umyj każde naczynie D-PBS i inkubuj z 10 μg przeciwciała pierwszorzędowego. Pozostawić w temperaturze pokojowej na co najmniej 2 godziny.
   3. W przypadku szalki CD45 dodaj 5 ml 0,2% BSA i 20 μl podstawowej płytki CD45; w przypadku szalki PDGFRβ dodaj 5 ml 0,2% BSA i 15,4 μl PDGFRβ; w przypadku szalki O4 dodaj 3 ml 0,2% BSA, 2 ml hybrydoma O4 i dodatkowe 100 μL 4% BSA (aby upewnić się, że końcowe stężenie BSA pozostanie na poziomie 0,2%).
   4. Poddaj eutanazji od jednej do czterech myszy za pomocą 0,1 ml/kg pentobarbitolu sodu (na 10 cm naczynie immunologiczne). Użyliśmy myszy C57BL/6 w wieku 8-10 tygodni. Obie płcie były używane i hodowane oddzielnie od siebie. Przelej zwierzę 30 ml zimnej 0,9% soli fizjologicznej.
   5. Przypnij przednie i tylne łapy do styropianu i użyj czystej żyletki, aby odsłonić kręgosłup od tyłu. Wykonaj laminektomię, wykonując nacięcia o głębokości około połowy po obu stronach grzbietowego kręgosłupa, usuwając grzbietową połowę kręgosłupa, aby odsłonić rdzeń kręgowy. Albo delikatnie przetnij nerwy i usuń rdzeń kręgowy, albo delikatnie popchnij rdzeń na bok, zachowując integralność nerwu.
   6. Użyj korzeni nerwów rdzeniowych (odciętych lub przyczepionych do rdzenia kręgowego), aby znaleźć i usunąć wszystkie DRG po obu stronach kręgosłupa. Przycinaj resztki nerwowe z każdego DRG podczas jego usuwania (więcej resztek nerwowych w kulturze może prowadzić do słabej przeżywalności hodowli). Zebrać DRG w 15 ml HBSS-/- w stożkowej probówce o pojemności 15 ml na lodzie.
      UWAGA: Należy pamiętać, że tkanka jest preparowana na wolnym powietrzu, ale po dodaniu DRG do probówki należy je traktować jako sterylne i manipulować nimi tylko w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
   7. Umieść zamrożone zapasy stemxyme 1 i 0,4% DNAzy w łaźni wodnej, około 30 minut przed końcem sekcji (mniej więcej podczas uruchamiania ostatniej myszy). Pozwól im osiąść na dnie stożkowej rurki, a następnie kontynuuj protokół w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
   8. Odessać większość HBSS-/- z DRG. Użyj pipety zamiast ssania, aby uzyskać <1 ml płynu i pozostaw ~100 μl płynu, aby nie ryzykować utraty tkanki.
   9. Umyj trzy razy 1 ml HBSS-/-. Dodaj 5 ml roboczego roztworu stemxyme do tkanki. Przykryj pokrywkę przezroczystą folią i zanurz rurkę na boku w łaźni wodnej nastawionej na 37 °C na 1 godzinę.
   10. Po inkubacji w enzymie dodać do probówki 1 ml roztworu inhibitora o niskiej zawartości ovo. Delikatnie rozetrzeć komórki pipetą p1000 10-15 razy. Pozwól, aby kawałki tkanki opadły.
   11. Przenieść górne 2-3 ml roztworu (zawierającego zdysocjowane komórki) do świeżego roztworu o niskiej zawartości ovomukoidów. Powtarzaj, aż tkanka zostanie całkowicie zdysocjowana i nie pozostaną żadne widoczne kawałki.
   12. Wirować przez 10 minut przy 300 x g w temperaturze pokojowej. Ponownie odsysać supernatant, używając pipety zamiast odsysania przez ostatni 1 ml, pozostawiając ~100 μl, i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu do płukania.
   13. Delikatnie odpipetować do wymieszania. Wstępnie zwilż sitko o pojemności 70 μm z 1 ml buforu do płukania na stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Przefiltrować roztwór komórkowy przez sitko do komórek.
   14. Przemyć probówkę 1 ml buforu do płukania, a następnie przepuścić przez sitko (3 ml filtratu). Delikatnie ułóż zawiesinę komórkową (1 ml na raz) na wierzchu 2 ml 15% poduszki BSA, aby usunąć resztki mieliny. Poduszka o pojemności 2 ml jest skuteczna dla dwóch myszy, a 3 ml jest skuteczna dla czterech myszy.
       1. W celu nałożenia warstw umieść 2 ml BSA w probówce, zamknij i delikatnie pokryj boki probówki BSA. Następnie delikatnie nałożyć zawiesinę komórek na wierzchu, pipetując do boku probówki.
   15. Wirować w temperaturze pokojowej przy 300 x g przez 10 minut (powolne przyspieszanie i zwalnianie). Użyj pipety P1000, aby usunąć przezroczysty płyn z wierzchu, fazę mielinową pomiędzy nimi i BSA, po 1 ml na raz (zmieniając końcówki między każdym ml). Pozostaw ~100 μL BSA, aby nie naruszyć pelletu.
   16. Dodać 5 ml buforu do płukania i inkubować probówkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C i stężeniu 10% CO₂ przez 30-45 minut. Pozwala to na pobranie antygenu. Pamiętaj, aby poluzować nakrętkę, aby umożliwić wymianę gazu.
   17. Umyj naczynie CD45 trzy razy za pomocą D-PBS. Odlej ostatnie płukanie. Przelać zawiesinę komórek do naczynia CD45.
   18. Inkubować komórki na szalce CD45 przez łącznie 20 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wirując w punkcie 10 minut, aby umożliwić komórkom równy dostęp do przeciwciała.
   19. Opłucz naczynie PDGFRβ trzykrotnie za pomocą D-PBS i odlej ostatnie płukanie. Przenieść niezwiązane komórki z szalki CD45 na szalkę PDGFRβ.
   20. Delikatnie potrząśnij naczyniem CD45 i podeprzyj je pod kątem. Delikatnie odpipetować 1 ml zawiesiny komórek na naczyniu, aby zebrać niezwiązane komórki. Przelać ją do naczynia PDGFRβ i odpipetować, aby przenieść pozostałą zawiesinę komórek na płytkę PDGFRβ.
   21. Inkubować płytkę PDGFRβ przez łącznie 20 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie obracając w punkcie 10 minut, aby umożliwić komórkom równy dostęp do przeciwciała.
   22. Opłucz naczynie O4 trzy razy za pomocą D-PBS i odlej ostatnie płukanie. Przenieść niezwiązane komórki z szalki PDGFRβ na szalkę O4, stosując tę samą metodę, co w kroku 3.2.19. Inkubować płytkę O4 przez łącznie 20 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie obracając w punkcie 10 minut, aby umożliwić komórkom równy dostęp do przeciwciała.
   23. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować przez 10 minut przy 300 x g. Ponownie zawiesić komórki w żądanej objętości i rozcieńczyć 1:1 błękitem trypanowym, aby zapewnić żywotność komórek. Policz średnie i duże komórki za pomocą hemocytometru (pozwoli to na najlepsze odwzorowanie liczby neuronów w hodowli).
   24. Usuń lamininę i ułóż komórki w żądanej gęstości. Nie dopuścić do wyschnięcia płytki między usunięciem lamininy a posiewem i natychmiast dodaj komórki.
   25. Hodować ilościowo oznaczone komórki w celu wzbogacenia neuronów (Rysunek 3) z 500 neuronami w 25 μl pożywki hodowlanej (opisanej w 1.2.7) na studzience na basenie i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Zalać studzienki do końcowej objętości 500 μL.
3. Dzień 4: utrwalenie, zablokowanie i pierwotne utrwalenie immunocytochemii (ICC)
   1. Po 48 godzinach wzrostu dodać 500 μl/studzienkę (lub objętość odpowiadającą pożywce w studzience) 8% PFA przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby utrwalić komórki. Jeśli pożądana jest analiza pożywki, można bezpośrednio naprawić za pomocą 4% PFA. Jednak tego nie testowaliśmy.
   2. Umyj komórki trzykrotnie D-PBS. Należy zauważyć, że trzymaliśmy te komórki w hodowli bez zmiany pożywki przez maksymalnie 72 godziny, ale przypuszczamy, że mogą przetrwać dłużej, szczególnie jeśli pożywka zostanie zmieniona w połowie.
   3. Usuń ostatnie płukanie i dodaj tyle roztworu blokującego do studzienki, aby całkowicie pokryć komórki. Blokuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć roztwór blokujący i dodać przeciwciało pierwszorzędowe do roztworu przeciwciała: β3-tubulinę w rozcieńczeniu 1:1,000. Uszczelnić płytkę przezroczystą folią i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Można rozważyć barwienie PDGFRβ w przypadku braku fibroblastów, CD45 w przypadku braku komórek odpornościowych, P0 lub PMP22 w przypadku braku mieliny lub fabp7 w przypadku gleju satelitarnego.
4. Dzień 5: Wtórne ICC
   1. Umyj komórki trzykrotnie D-PBS. Usuń ostatnie płukanie i dodaj przeciwciała drugorzędowe w roztworze przeciwciał: anty-królik 488 w rozcieńczeniu 1:500 i DAPI w rozcieńczeniu 1:2,000. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem.
   2. Umyj D-PBS trzy razy. Dodaj tyle D-PBS, aby pokryć dno studni i obraz. Płytkę można uszczelnić przezroczystą folią, chronić przed światłem i przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Stałe komórki wybarwione DAPI i β3-tubuliną zostały następnie zobrazowane za pomocą konfokalnego systemu przesiewowego o wysokiej zawartości. Obrazy analizowano przy użyciu odpowiedniego oprogramowania komercyjnego w celu określenia odsetka komórek DAPI-dodatnich, które były współznakowane β3-tubuliną (Ryc. 3). Stwierdzono, że całe kultury DRG mają 42,36% ± 6,4% barwienia β3-tubuliną, a kultury DRG z odpornością określono na 71,44% ±7,43% barwienia β3-tubuliny. U...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Ten protokół immunopanningu zwiększa odsetek komórek neuronalnych w hodowlach pierwotnych DRG. Aby uzyskać najlepsze wyniki, sekcje powinny być wykonywane w odpowiednim czasie, a DRG powinny być przycięte z nadmiaru nerwów. Etap dysocjacji powinien być dokładnie monitorowany i nie powinien przekraczać 1 godziny, aby zapobiec niepotrzebnemu stresowi komórek. Jeśli chodzi o immunopanting, każda płytka powinna być delikatnie zawirowana w połowie drogi, aby umożliwić komórkom dostęp do powlekanych przec...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filtry strzykawkowe 0,2 um	Fisher	723-2520
Szalki Petriego 100 mm	ThermoFisher	FB0875712
24-dołkowe czarne szklane płytki	Cellvis	P24-1.5H-N
70 um sitko komórkowe	Cedarlane	15-1070-1(BI)
B27+ suplement	Gibco	A3582801
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma Aldrich	A7906	dla 15% poduszki BSA i ICC (frakcja szoku cieplnego ≥ 98%)
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma Aldrich	A4161	dla 4% BSA do immunopanningu i SATO dla pożywki (zasadniczo wolna od globulin, odpowiednia do hodowli komórkowych, ≥ 99%)
Przeciwciało CD45	BD Pharmigen	550539
DAPI	Invitrogen	D1306
DMEM	Gibco	11960069
DNAse Worthington		LS002007	do roztworu stemxyme i buforu do płukania
D-PBS	Sigma Aldrich	D8662
EBSS	Sigma Aldrich	E6267	dla DNAse roztwór
Bibuła filtracyjna P8 gatunek ThermoFisher		09-795K	do 8% PFA
Glutamax	ThermoFisher	35050061
kozio-anty-mysia IgG	Jackson Immunoresearch	115-005-020	do naczynia O4
koza-anty-królik 488	Invitrogen	A11008
kozio-anty-królik IgG	Jackson Immunoresearch	115-005-003	dla PDGFRB danie
kozio-anty-szczurze IgG	Jackson Immunoresearch	115-005-044	dla talerza CD45
HBSS -/-	Sigma Aldrich	14175145
Insulina	Sigma Aldrich	I2643
laminina	Invitrogen	23017-015
N-acetylocysteina	Sigma Aldrich	A8199
Neurobasal	Gibco	21103049
Normalna surowica osła	Sigma-Aldrich	D9663
Przeciwciało O4	n/a	n/a	Hybridoma
Ovomucoid inhibitor trypsyny	Cedarlane	LS003086	na niskie ovo
granulki paraformaldehydu	Sigma Aldrich	441244	dla 8% przeciwciała
PFA PDGFRB	Abcam	AB32570
penicylina / streptomycyna	Gibco	15140-122
Poli-D-lizyna	Sigma Aldrich	P6407
Progesteron	Sigma Aldrich	P8783	dla SATO
Dihydrochrlorek putrescyny	Sigma Aldrich	P5780	dla SATO
Fosforan sodu dwuzasadowy	Fisher	S374-1	dla 0,2 M PB
Fosforan sodu jednozasadowy dwuwodny	Sigma Aldrich	04269	dla 0,2 M PB
Pirogronian sodu	ThermoFisher	11360070
Selenin sodu	Sigma	Aldrich S5261	dla SATO
Stemxyme I	Cedarlane	LS004107	do dysocjacji tkanek; kolagenaza kombinowana
Transferyna	Sigma Aldrich	T1147	dla SATO
Tris-HCl	Millipore Sigma	T5941
trypan niebieski	Gibco	15250-061
β 3-tubulina	Sigma-Aldrich	T2200