면역패닝에 의한 성체 마우스 배근 신경절 뉴런 배양의 농축

요약

이 논문은 성인 마우스 후근 신경절에 대한 면역 패닝 프로토콜을 설명합니다. 배양 플레이트에 항체를 부착함으로써 비신경 세포를 음성으로 선택하고 제거할 수 있습니다. 우리는 이 프로토콜을 사용하여 뉴런에 대한 배양이 풍부해짐을 보여주며, 조작에 대한 뉴런 반응에 대한 심층 연구를 가능하게 합니다.

초록

등근 신경절(DRG)은 척수의 등쪽 뿔에 인접한 말초 구조로, 감각 뉴런의 세포체와 다양한 기타 세포 유형을 수용합니다. 공개된 배양 프로토콜은 종종 섬유아세포, 슈반 세포, 대식세포 및 림프구의 존재에도 불구하고 전체 해리된 DRG 배양을 뉴런으로 언급합니다. 이러한 전체 DRG 배양은 형태 또는 염색을 기반으로 뉴런을 식별할 수 있는 이미징 응용 분야에 충분하지만, 이러한 배양에서 수집된 단백질 또는 RNA 균질액은 주로 뉴런 기원이 아닙니다. 여기서는 배양된 마우스 DRG에 대한 면역패닝 서열을 설명합니다. 이 방법의 목표는 다른 세포 유형을 제거하여 뉴런에 대한 DRG 배양을 풍부하게 하는 것입니다. 면역패닝은 항체를 세포배양접시에 부착시켜 세포형을 제거하는 방법을 말한다. 이 접시를 사용하여 우리는 배양에서 섬유아세포, 면역 세포 및 슈반 세포의 수를 부정적으로 선택하고 줄일 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 배양에서 뉴런의 비율을 높일 수 있습니다.

서문

등근 신경절(DRG)은 말초 조직을 자극하는 감각 뉴런의 세포체를 수용합니다. 이러한 뉴런을 연구하면 통증과 감각 상태의 기계론적 토대를 이해할 수 있습니다. 그러나 DRG는 뉴런만으로 구성되는 것이 아니라 섬유아세포, 슈반 세포, 대식세포 및 기타 면역 세포도 포함합니다¹. 이러한 다양한 세포 유형의 존재에도 불구하고, 전체 DRG 배양물은 종종 문헌에서 뉴런 ^2,3으로 지칭된다. 이러한 배양은 이미징 또는 유세포 분석에 의한 신경 세포 조사에 여전히 유용하며, 이를 통해 염색, 세포 크기 및/또는 형태에 의한 신경 식별이 가능합니다. 그러나 RNA 또는 단백질 수집을 위해 배양물을 균질화하는 중합효소연쇄반응(PCR) 또는 웨스턴 블로팅과 같은 분석의 경우 비뉴런 세포 유형의 존재가 결과를 방해할 수 있습니다. 따라서 DRG 배양에서 신경 세포의 비율을 증가시킬 필요가 있습니다.

면역패닝은 피질 뉴런, 성상교세포, 희소돌기아교세포 전구체 세포 및 미세아교세포를 포함한 다양한 세포 유형을 정제하는 데 사용되는 기술입니다. 간단히 말해서, 특정 세포에 결합하기 위한 페트리 접시에 세포 표면 마커에 ....

프로토콜

모든 동물 실험은 앨버타 대학교 보건 과학 동물 관리 및 사용 위원회(프로토콜 0000274)의 승인을 받아 수행되었습니다.

1. 시약 준비

1. 1일째 되는 날, 다음의 시약을 준비한다: 세포 배양 등급 물; 폴리-D-라이신-배양 등급 물 50mL에 전체 병을 100μg/mL의 스톡 농도로 재구성하여 스톡을 준비하고, 4°C에서 저장하고, 스톡 1:10을 배양 등급 물에 10μg/mL의 최종 농도로 희석합니다. 트리스-HCl-분말 트리스 하이드로클로라이드를 500 mM(50 mL 중 3.94 g)의 스톡 농도로 배양 등급 물에 용해시켜 스톡을 제조하고, pH 9.5, 필터 멸균(0.22 μm), 4°C에서 저장하고, 스톡을 배양 등급 물에 1:10으로 최종 농도 50 mM로 희석하고; 2차 항체(염소 항쥐, 토끼 및 쥐).
2. 2일차에는 다음 시약을 준비합니다.
   1. 세포 배양 등급 Ca2+,^Mg2+가 없는 행크의 균형 잡힌 염 용액(HBSS; HBSS-/-), 및^Ca2+ 및^Mg2+를 갖는 세포 배양 등급 D-포스페이트 완충 식염수(PBS). 라미닌 스톡 분취액을 제조하고, 수령 즉시 -80°C에서 ....

결과

그런 다음 DAPI와 β3-튜불린으로 염색된 고정된 세포를 공초점 고함량 스크리닝 시스템으로 이미지화했습니다. β3-튜불린과 공동 표지된 DAPI 양성 세포의 비율을 결정하기 위해 적절한 상용 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석했습니다(그림 3). 전체 DRG 배양물은 42.36% ± 6.4% β3-튜불린 염색을 갖는 것으로 측정되었고, 면역팬 DRG 배양물은 71.44% ±7.43% β3-튜불린 염색을 갖는 ?.......

토론

이 면역패닝 프로토콜은 DRG 일차 배양에서 신경 세포의 비율을 증가시킵니다. 최상의 결과를 얻으려면 적시에 해부를 수행해야하며 DRG는 과도한 신경을 잘라야합니다. 해리 단계는 주의 깊게 모니터링해야 하며 세포가 불필요한 스트레스를 받지 않도록 1시간을 초과해서는 안 됩니다. 구체적으로 면역패닝과 관련하여, 각 플레이트는 세포가 코팅된 항체에 접근할 수 있도록 중간 지점에서 부드?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 um Syringe filters	Fisher	723-2520
100 mm petri dishes	ThermoFisher	FB0875712
24 well black glass-bottom plates	Cellvis	P24-1.5H-N
70 um cell strainer	Cedarlane	15-1070-1(BI)
B27+ supplement	Gibco	A3582801
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A7906	for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction ≥98%)
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A4161	for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, ≥99%)
CD45 antibody	BD Pharmigen	550539
DAPI	Invitrogen	D1306
DMEM	Gibco	11960069
DNAse	Worthington	LS002007	for stemxyme solution and panning buffer
D-PBS	Sigma Aldrich	D8662
EBSS	Sigma Aldrich	E6267	for DNAse solution
Filter paper P8 grade	ThermoFisher	09-795K	for 8% PFA
Glutamax	ThermoFisher	35050061
goat-anti-mouse IgG	Jackson Immunoresearch	115-005-020	for O4 dish
goat-anti-rabbit 488	Invitrogen	A11008
goat-anti-rabbit IgG	Jackson Immunoresearch	115-005-003	for PDGFRB dish
goat-anti-rat IgG	Jackson Immunoresearch	115-005-044	for CD45 dish
HBSS -/-	Sigma Aldrich	14175145
Insulin	Sigma Aldrich	I2643
laminin	Invitrogen	23017-015
N-acetyl cysteine	Sigma Aldrich	A8199
Neurobasal	Gibco	21103049
Normal Donkey Serum	Sigma-Aldrich	D9663
O4 antibody	n/a	n/a	Hybridoma
Ovomucoid trypsin inhibitor	Cedarlane	LS003086	for low ovo
paraformaldehyde prills	Sigma Aldrich	441244	for 8% PFA
PDGFRB antibody	Abcam	AB32570
penicillin/ streptomycin	Gibco	15140-122
Poly-D-Lysine	Sigma Aldrich	P6407
Progesterone	Sigma Aldrich	P8783	for SATO
Putrescine dihydrochrloride	Sigma Aldrich	P5780	for SATO
Sodium phosphate dibasic	Fisher	S374-1	for 0.2 M PB
Sodium Phosphate monobasic dihydrate	Sigma Aldrich	04269	for 0.2 M PB
Sodium Pyruvate	ThermoFisher	11360070
Sodium Selenite	Sigma Aldrich	S5261	for SATO
Stemxyme I	Cedarlane	LS004107	for tissue dissociation; combination collagenase
Transferrin	Sigma Aldrich	T1147	for SATO
Tris-HCl	Millipore Sigma	T5941
trypan blue	Gibco	15250-061
β3-Tubulin	Sigma-Aldrich	T2200